文摘

众所周知,针灸治疗会影响患者膀胱过动症,但其作用机制还有待阐明。本研究旨在探讨针刺对膀胱过度活跃的影响,和卡哈尔间质细胞的兴奋性膀胱在老鼠模型中部分膀胱出口梗阻。电针刺激(连续波,30 Hz, 1 mA)应用于刺激Ciliao点(BL32)和惠阳点(BL35)大鼠20分钟,3天。结果表明,针刺抑制逼尿肌不稳定频率和降低逼尿肌收缩最大压力在膀胱充盈期。与正常控制老鼠相比,HCN2 mRNA和蛋白表达在膀胱调节和逆转的电针刺激大鼠膀胱过动症由rt - pcr、免疫印迹和免疫组织化学。此外,体外细胞培养OAB大鼠膀胱卡哈尔间质细胞的胞内Ca^{2 +}浓度高于正常控制老鼠,针灸治疗后降低。这些发现表明,针灸刺激可以抑制膀胱过度活跃,和调节膀胱的卡哈尔间质细胞的兴奋性膀胱过动症的治疗肌原性的机制。

1。介绍

膀胱过动症(OAB)综合征的特点是有或没有尿频和紧迫性尿失禁,并且经常伴有遗尿症。针灸,作为中国传统疗法之一,提供了可循治疗OAB。据报道,针灸刺激骶椎骨对膀胱活动有抑制作用,提高夜尿症的症状,减少意味着冲动频率,减少排尿症状(1- - - - - -5]。我们之前的临床研究显示,针灸能改善尿动力学条件,抑制逼尿肌不稳定收缩,增加膀胱容量,提高生活质量的显著OAB患者(6- - - - - -8]。虽然针刺对膀胱活动的影响已经得到证实,其作用机制仍有待澄清。我们之前发现nitrergic神经递质在膀胱颈部和与不稳定膀胱逼尿肌明显降低大鼠电针刺激治疗可以显著增加NOS的包含在膀胱组织,调节膀胱功能,抑制膀胱过度活跃(9]。

许多研究发现,卡哈尔间质细胞(可以)在膀胱,像在胃肠道,作为主要的领跑人产生去极化电流到邻近的平滑肌细胞和协调肌肉收缩,扮演的基本角色从膀胱神经信号传输平滑肌细胞(10]。膀胱产生内在的自主收缩,这些内在的收缩可以由专门的协调系统(11]。c - kit是可以作为识别标记,和Glivec(甲磺酸伊马替尼)是一个c - kit受体抑制剂,它可以降低膀胱过度活跃。可以相互联系和平滑肌细胞缝隙连接形成一个连续的网络,生产的合胞体神经元使快速信号转导(12]。c-Kit-positive可以比正常人类OAB逼尿肌多逼尿肌,这表明膀胱可以一个相关的病理生理学OAB [13]。Hyperpolarization-activated循环nucleotide-gated (HCN)通道在脊椎动物中是独一无二voltagegated离子通道,导致超极化激活。HCN阳离子通道蛋白被认为是结构性hyperpolarization-activated内向(Ih)当前的基础,起着非常重要的作用在起搏(14]。HCN蛋白质是确定在大鼠膀胱可以,HCN的表达蛋白质OAB老鼠明显增强,这可能是负责增加膀胱兴奋性(15]。结构和细胞通讯功能的变化步伐制造商可以在膀胱导致膀胱过度活跃。针灸的效果是否刺激仅仅作用于逼尿肌平滑肌细胞或通过调节速度标记可以兴奋性?因此,本研究在老鼠进行研究:(1)针灸刺激膀胱过度活跃的影响;(2)膀胱可以兴奋性的改变是否介导逼尿肌不稳定的收缩;(3)如何针灸调节膀胱可以兴奋性在治疗不稳定膀胱肌原性的机制。

2。材料和方法

2.1。动物和研究设计

所有实验进行女性Wistar鼠,从实验动物中心,获得上海大学的传统中药,重180 - 200克的实验。动物被安置在一个12 h光/暗周期可以随意提供食物和水。室温保持在°C和相对湿度45 - 50%。五个动物被安置在每个笼子里。所有实验进行遵守国际道德标准的护理和使用动物,和动物伦理委员会通过了考试上海中医药大学。

女性Wistar鼠()首先被随机分为两组:正常控制(),模型()。老鼠被1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(50毫克/公斤)。正常对照组接受虚假的操作。部分膀胱出口梗阻(PBOO),经典的方法诱导OAB [16),在模型组执行。6周后,模型评估由cystometrogram氨基甲酸乙酯麻醉。逼尿肌收缩时引起的压力波动收缩波显示阶段,该模型建立(17]。成功的模型()被随机分为3组:模型组(),针灸组(),基利克集团()。模型组没有治疗,针灸组治疗通过电针刺激。基利克集团在膀胱灌溉可以拦截器Glivec (10⁻⁵mol / L, 1毫升/天,圣克鲁斯生物技术),其他组治疗膀胱灌溉生理盐水,每一组连续治疗3天。

2.2。针灸治疗

有意识的老鼠接受针灸治疗。一个针灸针(直径0.22毫米)定位几乎垂直骨膜下约5毫米侧中线的年代₂(BL32 Ciliao)和其他针灸针(直径0.22毫米)定位几乎垂直骨膜下约5毫米的中线侧尾骨(BL35惠阳),左右对称。电刺激在左派和右派的点30赫兹的频率和强度1 mA,整个过程持续20分钟。

2.3。PBOO操作和Cystometric分析

PBOO的操作下进行全身麻醉提供1%戊巴比妥钠腹腔注射(50毫克/公斤)。2 - 3厘米中线耻骨弓上的皮肤切口,筋膜反射,腹膜被打开,膀胱被确认。插入尿道的硬膜外导管(直径1毫米),近端尿道被顺利分离钳和与2 - 0无菌丝绸、紧张的程度是导管可以轻易拉,然后导管移除。在两层中线切口关闭5聚丙烯缝线。

6周后的模型被cystometric评估分析。所有的老鼠被腹腔内注射20%氨基甲酸乙酯麻醉(0.5毫升/ 100克)。transvesical导管的一端(聚乙烯catheter-50)是通过尿道插入膀胱,另一个是连接到一个压力传感器和注射器泵通过一个三通活塞记录膀胱内的压力和注入生理盐水膀胱。膀胱被清空后,执行cystometry与生理盐水注入0.2毫升/分钟。逼尿肌不稳定的收缩频率和最大压力在膀胱充盈期记录治疗前后,逼尿肌不稳定的收缩频率记录通过计算no-voiding收缩。

2.4。RNA提取和定量rt - pcr

所有老鼠都被颈椎脱位,腹部被打开了,三棱的膀胱无菌隔离,立即在液氮中冷冻,并立即被存储在−80°C,直到它被使用。每个样本中收集1毫升冰冷的试剂盒(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。均质化后,sonification与氯仿提取RNA,用异丙醇沉淀,溶解在30岁μL RNAse-free DEPC。RNA浓度和纯度分析Nanodrop分光光度计(Nanodrop技术,威明顿、德),光谱吸收的260和280海里。互补脱氧核糖核酸的合成,益生元(dT)引物,1μg的总RNA样本,RevertAid合成第一链cDNA工具包(加拿大安大略省Fermentas)使用,遵守制造商的指导。互补脱氧核糖核酸样本放置在冰和储存在−20°C到进一步使用。在分析之前,10μL与90年的cDNA样本稀释μL MilliQ水。

定量rt - pcr进行了20μ包含1 L缓冲溶液μL(稀释cDNA样品,10μL 2×SYBR绿色II中存在工具包(Toyobo,大阪,日本),1μ每个引物(5 Lμ米),8μL MilliQ水。引物检测看家基因的mrnaβ肌动蛋白Hcn的设计使用引物3 (http://frodo.wi.mit.edu/)。引物对的β肌动蛋白:5′-TCTGTGTGGATTGGTGGCTCT-3′, 5′-AGAAGCATTTGCGGTGCAC-3′, Hcn: 5′-ACCCCCAGCTCGTCTACTCT-3′, 5′-ACCCCATCTTGTTTCTGCAC-3′。循环条件是10分钟95°C,紧随其后的是40的周期在95°C和1分钟15秒60°C。骑自行车,融化后协议执行了15秒95°C, 1分钟60°C,在95°C和15秒,控制产品特异性。褶皱的变化(FC)在目标基因的互补相对于选定的内生控制基因决定如下:FC =,ΔΔCt = ()测试−()控制。Ct值被定义为的PCR的循环次数检测荧光信号。

2.5。西方墨点法

冷冻组织均质在寒冷的裂解缓冲(海门Beyotime生物技术有限公司、江苏、中国)和离心机在13日000 rpm 5分钟在4°C,上层清液总蛋白是由洛瑞量化方法(18]。样品(30μg每加载)分离血清总蛋白10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳凝胶,electrotransfered到聚乙二烯二氟化物膜(微孔,贝德福德,妈,美国)。的与5%脱脂牛奶膜被封锁在一夜之间在4°C,然后孵化与主抗体识别β肌动蛋白(Abcam鼠标单克隆,1:5000年,剑桥,英国)或HCN2抗体(兔多克隆,1:1000年,细胞信号技术,丹佛,美国马)为2 h 22°C。然后,膜被孵化与辣根peroxidase-conjugated antimouse (Abcam 1: 5000年,剑桥,英国)或山羊antirabbit合(Abcam 1: 4000年,剑桥,英国)二级抗体。信号的可视化与发射极耦合逻辑加试剂(通用电气医疗集团,白金汉郡,英国)和暴露在x射线胶片(柯达,罗切斯特,纽约,美国)。蛋白质比例计算基于densitometrical量化软件扫描电影图像的J。HCN蛋白质含量归一化到肌动蛋白水平和级别的控制动物样本。

2.6。免疫组织化学

膀胱24 h在缓冲10%福尔马林固定,脱水和嵌入在石蜡中,然后在3截口μ如果化验。总之,幻灯片被煮沸(99°~ 100°C)在0.01 M柠檬酸钠缓冲(pH值6.0)10分钟。非特异性结合后被正常山羊血清5%,一夜之间,幻灯片被孵化与主抗体c - kit (h - 300)抗体(sc5535,圣克鲁斯生物技术)和Anti-HCN2抗体(ab84817 Abcam),紧随其后的是两个荧光共轭二次抗体的混合物为30分钟,Alexa萤石488山羊antirabbit免疫球蛋白(美国表达载体猫:A11034)和Alexa萤石555山羊anti-mouse免疫球蛋白(美国表达载体猫:A21424)。最后,幻灯片与DAPI安装安装解决方案(美国表达载体P36935)和评估50我尼康显微镜在黑暗。细胞核蓝色可视化使用一个过滤器330 - 380 nm和积极的标签表达与绿色的过滤器465 - 495 nm,红色的过滤器530 - 600 nm。

2.7。原发性膀胱可以细胞培养和鉴定

指的是先前的实验(19,20.),大鼠膀胱被解剖,放置在D-hanks的解决方案和粘膜层移除。平滑肌是切成小块,放入1毫克/毫升胶原酶II型(沃辛顿),0.5毫克/毫升胰蛋白酶(PAA), 1毫克/毫升BSA(华美生物工程公司、中国)的解决方案。平滑肌是孵化在摇晃浴8分钟37°C 300 RPM,重复5次。孵化后细胞在1500转离心5分钟,然后superfusate含有胶原酶被移除。细胞在5毫升resuspended RPMI解决方案包含30%在1500 RPM的边后卫,再次离心5分钟(两次)。最后清洗过程后,3毫升RPMI解决方案包含30%的边后卫了1盘(直径3厘米)2.5毫升细胞悬液,intracellular-free Ca的测量^{2 +}集中使用96孔板。在我们的实验中,我们发现,虽然可以用3 - 4个小时成为文化附着在板的磁盘,逼尿肌细胞需要6个小时做同样的事情。因此,我们使用这个时差分离这两种细胞有关。实验1 - 2几天大的文化。可以在文化形态不同于平滑肌细胞和他们的身份被确认使用c - kit主要抗体免疫细胞化学。

可视化细胞免疫组织化学表达c - kit免疫反应性,细胞被固定在3.7%甲醛(Thremo鱼)10分钟,封锁在1%牛血清白蛋白(BSA)为20分钟,和准备装载在黑暗中孵化12 h在PBS包含c - kit蛋白(SC 5535稀释1:200年,圣克鲁斯生物技术)。细胞板的清洗和培养另一个1 h 37°C antirabbit IgG抗体与荧光示踪标记(IgG-Alexa萤石488稀释1:900年,细胞信号技术)。与PBS洗后,准备使用一个倒置荧光显微镜观察(Axiovert 40节能灯、蔡司、德国)。

2.8。膀胱可以测量细胞内自由钙^{2 +}浓度,钙^{2 +})我

准备在DMSO加载包含5μmol / L fura-2点(Dojindo实验室、日本)40分钟在37°C。他们洗了三次在PBS和de-esterified 40分钟在实验前37°C。Varioskan flash(热费希尔科学)是用于测量(Ca^{2 +}我的浓度。强度比率在340和380 nm励磁(/)校准使用的体外方法和转化为Ca^{2 +}根据方程,浓度(Ca^{2 +}我=(()/ ()),代表224海里的离解常数,其值,代表/,和代表强度比率在0^{2 +}(添加0.1 EGTA)和饱和Ca^{2 +}(0.1% Triton x - 100和0.1 CaCl₂)。

2.9。数据分析

所有数据都表示为平均数±标准差。统计显著性测试使用单向方差分析(方差分析)和事后测试,的值被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。针灸治疗对尿动态的影响

3.1.1。针灸治疗的效果在膀胱逼尿肌不稳定的收缩频率填充

体重无显著差异,在四组治疗前后观察。(在治疗之前,治疗后)。

在cystometrograms六周后执行操作,与正常对照组相比,),逼尿肌不稳定的收缩频率(次/期)在膀胱充盈期模型组显著增加(,)(,),针灸组(,)(,),Glivec集团(,)(,),但是模型组之间无显著差异,针灸组和基利克集团(,,,)。比较治疗前后,正常对照组(没有区别,和模型组分别,),针灸组下降(,)和Glivec组分别,(,)。比较治疗后组间(,,),正常对照组()针灸组(),基利克集团()低于模型组()(,,,),而正常组之间没有显著差异,针灸组和Glivec组(,,,)(数据1和2)。

3.1.2。针灸治疗的效果在膀胱逼尿肌不稳定的收缩最大压力灌装

在cystometrograms六周后执行操作,与正常对照组相比(,),最大压力(不啻逼尿肌不稳定的收缩₂O)在膀胱充盈期模型组显著提高(,)(,),针灸组(,)(,),Glivec集团(,)(,),但是模型组之间无显著差异,针灸组和基利克集团(,,,)。比较治疗前后,正常对照组(没有区别,和模型组分别,),针灸组下降(,)和Glivec组分别为(,)。比较治疗后组间(,,),正常对照组()和针灸组(),基利克集团()低于模型组()(,,,),而正常组之间没有显著差异,针灸组和Glivec集团(,,,)(数据1和3)。

3.2。针灸治疗对膀胱的影响HCN2信使rna和蛋白质

3.2.1之上。HCN2 mRNA的表达在膀胱和rt - pcr检测

在膀胱HCN2 mRNA的表达明显不同组间(,,)。模型组(,)明显高于正常对照组(,)(,),针灸组(,)(,),Glivec集团(,),(,)(图4)。

3.2.2。HCN2的表达蛋白在膀胱被西方墨点法

与rt - pcr的结果相似,HCN2的表达蛋白在膀胱不同组间(,)。模型组(,),与正常对照组相比增加(,)(,),针灸组明显减少(,)(,)和基利克集团(,)(,)(图5)。

3.3。针灸治疗对膀胱的影响可以分布和数量

检测可以在大鼠膀胱、荧光染色法是应用,c-Kit-positive可以(红色)被发现在大鼠膀胱上皮,suburothelium,通过荧光显微镜和肌肉层。膀胱逼尿肌肌层中可以被发现主要位于边界的平滑肌束和肌肉束之间。的数量可以是计算每个视野和10视觉领域在每组随机观察到。结果显示组间的显著差异(,,)。模型组()超过正常对照组()(,),但是没有差异相比,针灸组()(,)和基利克集团()(,)(图6)。

3.4。针灸治疗的效果在膀胱可以HCN2通道的数量

膀胱可以和HCN2渠道之间的关系被双重免疫荧光实验研究使用c - kit抗体抗体蛋白HCN2紧随其后,已知速度制造商的重要特征。一个关系是注意到HCN2染色观察单个细胞中c - kit积极可以身体,HCN2和c - kit疣状均匀在细胞质中。HCN2疣可以也算在每个视野和10视觉领域在每组随机观察到。结果揭示了这些团体之间的显著差异(,,),HCN2积极的数量可以在模型组(),与正常对照组相比显著升高()(,),不分布在针灸治疗()(,)和基利克集团()(,)(图7)。

3.5。针灸治疗对膀胱的影响可以细胞内自由钙^{2 +}浓度

培养细胞,倒置显微镜下观察。可以是纺锤状的形态,与几个分支来自中央soma,和与邻近细胞,显示网络(图8)。可以在文化形态不同于平滑肌细胞和他们的身份被确认使用初级抗体与免疫细胞化学c - kit(数字9(一个),9 (b),9 (c))。

大鼠膀胱的能力可以应对针灸刺激和Glivec研究主要培养和新鲜细胞,含有钙^{2 +}fura-2指标。Varioskan flash (ThermoFisher科学)是用于测量(Ca^{2 +}]我浓度,每个在96孔板5日确定感兴趣的区域,每组和40个地区选择。根据方程(Ca^{2 +}我=(()/ ()),转换成Ca^{2 +}浓度。细胞内自由钙^{2 +}集中在模型组的膀胱可以(),与正常对照组相比更高(),(,);针灸刺激()和Glivec膀胱灌溉()显著降低细胞内钙OAB大鼠膀胱可以^{2 +}浓度(,,)(图10)。

4所示。讨论

本研究表明,针灸刺激抑制膀胱过度活跃,理气HCN2 mRNA的表达和蛋白在膀胱,膀胱可以HCN2频道的数量减少,同时也减少膀胱可以细胞内自由钙^{2 +}浓度。这是第一个证据表明针灸刺激的兴奋性调节膀胱可以治疗膀胱过动症肌原性的机制。

刺激点的这项研究是古典点BL32和BL35对应于骶椎骨₂水平和尾骨,属足太阳膀胱经的中药(21]。临床研究表明,针灸刺激骶椎骨增加膀胱容量,抑制膀胱过动症(22,23]。在我们之前的临床研究,我们发现,与连续波电针刺激,30 Hz, 1 mA, 20分钟,3天刺激可以抑制膀胱收缩频率不稳定,并降低逼尿肌最大压力在膀胱充盈期从而抑制膀胱过度活跃。因此,我们通过实验用同样的治疗。

可以被广泛认为是扮演关键角色开始收缩活动,调节神经传递,进行电脉冲,作为一段传感器(24]。中标识的自发动作电位可以表明该细胞兴奋性的变化导致一系列收缩异常。膀胱过动症的数量可以增加,可以变化可能占病理上增加细胞之间的信号传输(25]。膀胱ICC在膀胱功能障碍的临床意义已经被研究的组织调查不稳定膀胱患者据报道有大量和ICC分布密度比控制样本,Glivec(甲磺酸伊马替尼)10⁻⁵M,改善膀胱容量、合规、空心卷,尿频,减少收缩阈值和自发的活动26]。我们的结果表明,该质量OAB老鼠的c-Kit-positive膀胱可以显著增加与正常控制老鼠相比,这与以上研究的结果是相一致的。然而,素质没有明显减少了针灸刺激和Glievc 10⁻⁵mol / L膀胱灌溉。

HCN通道是活跃在静止膜电位,因此被认为参与自律性和兴奋性。免疫荧光和免疫印迹显示,HCN1 HCN2 HCN3, HCN4渠道都出现在人类膀胱(可以27]。HCN1 2 4亚型在调节膀胱兴奋性方面起重要作用通过控制kit-positive ICC-like细胞。HCN通道,Ih当前可能参与细胞激发的调制和控制膀胱的兴奋性。HCN通道,作为一个潜在的和事佬,参与膀胱兴奋的规定,可能通过膀胱ICC-like细胞(28]。在我们的研究中,免疫组织化学也用于检测HCN2通道。在OAB老鼠HCN2的质量可以显著增加与正常控制老鼠相比,显著减少了针灸刺激和Glievc 10⁻⁵M膀胱灌溉。rt - pcr和免疫印迹分析结果显示,HCN2亚型中检测出膀胱,及其在OAB mRNA和蛋白表达增加老鼠,这表明有一些HCN2通道在病理条件下的变化,在膀胱HCN2通道的兴奋性增强。HCN2参与针灸刺激的抑制效应不稳定膀胱收缩,针灸刺激和Glivec 10⁻⁵M膀胱灌溉理气HCN2 mRNA和蛋白表达,可以表明HCN通道可能成为新的治疗OAB目标。

调制的胞质钙^{2 +}浓度是一种机制共同的信号转导途径调节许多细胞现象,细胞内钙的作用^{2 +}是特别重要的,因为它是逼尿肌收缩活动的主要决定因素。自发、自主细胞activity-Ca^{2 +}和膜电位振荡,源自人类膀胱逼尿肌平滑肌,由细胞外钙^{2 +}流入和胞内释放29日]。与此同时,这些心律调整器细胞可以产生重复的Ca^{2 +}瞬变,激活内在的电流通过缝隙连接提供传播的去极化信号触发通过开放l型压控渠道收缩(挥发性允许外部Ca^{2 +}涌入细胞触发收缩(30.]。在这项研究中,我们发现基底细胞内自由钙^{2 +}浓度升高在膀胱可以活跃膀胱和通过针灸刺激和Glivec显著下降,这表明,针灸可能对膜电位的影响,并使得很难引起Ca^{2 +}涌入,l型钙通道开放引发动作电位。

5。结论

系统配置文件的影响针灸刺激的兴奋性膀胱过度活跃和膀胱可以是本研究中所示。结果表明,针灸刺激抑制膀胱过度活跃,理气HCN2 mRNA的表达和蛋白在膀胱,并减少在膀胱可以HCN2香奈儿的质量。此外,针灸刺激也减少了膀胱可以intracellular-free Ca^{2 +}浓度。结果可能有助于提供一个科学的基础构建临床针灸治疗OAB。

确认

作者感谢中国国家自然科学基金(没有。81072761),上海市科学技术委员会(没有。11 dz1973502),上海市卫生和计划生育委员会(没有。ZYSNXD-CC-ZDYJ040)财政支持这项工作。他们欣赏荣禄博士(医学院基本上海中医药大学),和Cheng-guang Li博士(脊髓死亡研究所上海中医药大学附属龙华医院)为他们对这项工作有建设性的讨论和建议。他们也谢谢Ke王博士(上海中医药大学附属曙光医院)为他的帮助在数据的解释和修改。