文摘

n .椰子中是一个重要的药用植物在各种临床前模型评估的典型动作。本研究旨在调查的各类典型效应连续甲醇和水提取物的花瓣n .椰子通过研究影响脂肪生成、adipolysis脂肪酶,5 -羟色胺(5 -大麻素(CNR)₂),黑素细胞集中激素(MCHR₁)和肾上腺皮质(MC₄R)受体。连续甲醇和水提取物n .椰子花瓣有影响抑制脂肪储存在脂肪细胞和脂解作用增加。n .椰子花瓣甲醇提取物表现出对脂肪酶的抑制作用浓度活动集成电路₅₀47µg /毫升的价值。n .椰子花瓣提取显示明显对5 -受体激动剂和拮抗剂活动和中国北车₂受体,分别对MCHR虽然它显示没有影响₁和MC₄R受体。总的来说,甲醇提取的n .椰子花瓣比连续水提取物显示出更好的活动。

1。介绍

一些草药已经表明体重管理(1]。这样一个植物用于体重管理莲属椰子Gaertn。n .椰子,被许多名字包括印度莲花,神圣的莲花,印度的bean,或者仅仅是莲花,是两种水生植物在家庭莲科。几乎所有的部分n .椰子可食用,在许多亚洲国家,被发现在食物的食谱2]。提取的n .椰子花、种子、根茎和叶子已报告有不同的治疗潜力包括反应力的(3],各类典型[4),抗氧化剂(5],王亚南[6[],抗糖尿病的活动7,抗炎8,9],退热剂[10),抗菌11),和免疫调节12,13)活动。

几个从这些植物中提取生物活性phytocompounds部分属于不同的化学组,包括生物碱、黄酮类化合物、苷、三萜、维生素(14]。叶、根和胚胎阶段n .椰子已报告包含生物碱如roemerine nuciferine, nornuciferine, nelumboside, anonaine, 5-methoxy-6-hydroxyaporphine, liensinine, asimilobine [15]。Bisbenzylisoquinoline生物碱的n .椰子后被证明是可利用对大鼠口服剂量20毫克/公斤(16]。n .椰子生物碱是抑制3所示t3-l1 preadipocyte分化和改善高脂食源性肥胖和身体脂肪堆积在老鼠17]。

几类黄酮和nonflavonoids从花中n .椰子报道了作者被合并在一个审查慕克吉et al。14]。黄酮类化合物包括myricetin-3-O-b-D-glucopyranoside quercetin-3-O-b-D-glucuronide,黄芪甙、槲皮素3 4-dihydroxybenzoic、山柰酚、羟基苯甲酸,b-sitosterol隔绝的乙醇提取的花瓣n .椰子(18]。Nonflavonoid化合物,包括腺嘌呤、肌醇、熊果苷、谷甾醇吡喃葡萄糖苷,花中提取(14]。吴et al。19)展示了各类典型flavonoid-enriched提取物的效果n .椰子叶(NLFE)高脂肪饮食(HFD)美联储C57BL / 6小鼠和总结其作用通过lipid-regulated酶,从而衰减身体脂质积累和防止肥胖。典型药物行动的叶子和种子n .椰子在得到了广泛地研究。在体外和在活的有机体内模型由许多研究人员(4,20.- - - - - -22]。本研究旨在调查的影响n .椰子花瓣提取脂肪酶,脂肪生成、adipolysis和中央受体在体外。

2。材料和方法

2.1。化学物质

地塞米松,isobutylmethylxanthine (IBMX)、油红O,猪脂肪酶酶,噻唑基溴化四唑蓝(MTT) 4-methyl umbelliferyl油酸,803430 GW,黑素细胞集中激素(妇幼保健),melanotan II, DL-isoproterenol盐酸盐,奥利司他是从Sigma-Aldrich采购的。AL34662 AM630, CP 55940年,细胞电镀reagent-3,细胞分析缓冲区,衬底试剂1,衬底试剂2得到DiscoveRx(美国)。胰岛素从百采购。胎牛血清(的边后卫)和牛牛血清(BCS)从Hyclone购买。从生物测定系统Enzychrom甘油检测设备采购。DMEM Gibco生活获得了技术。

2.2。植物材料

的花瓣n .椰子(每100克)从本地商业供应商和采购认证在科学传播与信息资源研究所(NISCAIR),新德里。凭证标本(没有。811)是存入我们的标本。干花瓣提取与甲醇(~ 400毫升)回流1小时的70°C。提取的解决方案是过滤,剩下的原材料受到甲醇萃取两次重复上述步骤。液体过滤相结合,集中由蒸馏真空稠膏,紧随其后的是真空下干燥温度为70°C。干提取被任命为甲醇提取和利用来执行在体外实验。甲醇提取的植物化学的调查n .椰子是由对甲醇提取物高效液相色谱分析来识别每个描述的方法的类黄酮Xingfeng et al。23]。

甲醇提取的原料是如上所述。剩下的原料甲醇提取后进一步煮水85 - 90°C(3次每500 - 600毫升水1 h)和过滤。液体过滤相结合,集中由蒸馏真空稠膏,紧随其后的是真空下干燥温度为80°C。干提取被任命为连续的水提取物和用于执行在体外实验。

2.3。细胞系和文化条件

3 t3-l1细胞系从美国采购类型文化集合(写明ATCC)。3 t3-l1成纤维细胞在DMEM培养补充10% BCS和孵化37°C;5%的公司₂。加上5 - U2OS细胞线或MC₄受体和CHO-K1细胞系加上中国北车₂或MCHR₁从DiscoveRx受体得到。U2OS CHO-K1细胞维持在96孔细胞板试剂板材组织培养48 h和24 h,分别。

2.4。细胞生存能力测定

最初实验使用3 t3-l1、CHO-K1 U2OS细胞进行连续评估细胞毒性浓度的甲醇和水提取的n .椰子。细胞生存能力是由比色MTT测定如Mosmann所述24]。总之,细胞培养在96 -孔板的播种密度5×10³细胞/。播种24 h后,这些细胞被处理n .椰子100年提取物的浓度μ克/毫升。此后,这些细胞被冲洗,进一步孵化与麻省理工1 h。1小时后,MTT晶体于200年解散μL DMSO溶液。光密度是读570海里,因此,noncytotoxic浓度进行选择在体外研究。

2.5。脂肪生成分析

的影响n .椰子花瓣提取脂肪生成是评估通过检查他们的抑制能力preadipocytes脂肪细胞使用3 t3-l1细胞的分化作为测试系统。0天,鼠标3 t3-l1成纤维细胞被播种在3×10的密度⁴细胞/在一个包含DMEM 48-well板补充BCS的10%。1天,细胞被改为DMEM培养基补充的边后卫(5%)、IBMX(0.5毫米)、胰岛素(10μg / mL)和地塞米松(1μ米)有或没有n .椰子提取物。控制Guggulsterone被用作参考。3天,细胞被改为DMEM补充的边后卫(5%)和胰岛素(5μg / mL)有或没有n .椰子花瓣提取物。在5至7天,细胞被改为DMEM补充5%的边后卫。8天,3 t3-l1脂肪细胞与PBS冲洗并使用10%福尔马林固定30分钟紧随其后的另一个冲洗60%异丙醇溶液和允许干燥。这些细胞被沾油红O解决方案(异丙醇油红O 0.5%,稀释比例的3部分油红O股票和蒸馏水的两部分)在室温下15分钟。染料保留在脂肪细胞与异丙醇提取和量化通过测量吸光度在500海里。

2.6。Adipolysis化验

Adipolysis试验进行评估的可能的分解脂肪的活动n .椰子花瓣提取通过检查他们的能力释放甘油从分化3 t3-l1细胞。0天,3 t3-l1细胞被播种在3×10的密度⁴细胞/在48-well板包含DMEM培养基补充BCS的10%。1天,细胞被改为DMEM补充5%的边后卫,IBMX(0.5毫米)、胰岛素(10μg / mL)和地塞米松(1μ米)。2天,细胞被改为DMEM,补充的边后卫(5%)和胰岛素(5μg / mL), 2天左原状。在第四天,细胞被允许种植的边后卫(5%)连续三天。7天,细胞包含2% BSA与DMEM挨饿过夜。8天,细胞治疗noncytotoxic浓度n .椰子盐酸提取并DL-isoproterenol(参考控制)分别为4 hr KRB Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲(pH值7.2)。上层清液收集并估计了甘油含量增加100μL(甘油工作试剂和10μL(样本/标准/在96 -试验板。板是在室温下混合和孵化了20分钟。读的颜色强度在570 nm VersaMax板读者。

2.7。脂肪酶测定

的抑制作用n .椰子猪胰脂肪酶是评估。转换原理的分析是基于底物4-methyl umbelliferyl油酸,4-methyl umbelliferone由一个活跃的猪脂肪酶酶(25]。总之,50的总反应体积μL包含15μL(三羟甲基氨基甲烷缓冲液/参考控制(奥利司他)/n .椰子提取5μL的脂肪酶酶,5μL(软化水,25岁μL的衬底(4-methyl umbelliferyl油酸)。这些试剂混合并确定荧光的变化在25°C 20分钟的激发和发射波长360 nm和460 nm,分别使用FLUOstar最适条件。

2.8。受体化验

连续甲醇和水提取物的花瓣n .椰子筛选可能的格斗和敌对活动对受体的浓度选择10μ克/毫升。

2.8.1发布。兴奋剂检测

和MC₄R受体化验。U2OS细胞行加上5 -或MC₄10 R受体是镀的密度⁴细胞组织培养板/在96 -好,含有细胞镀试剂。48 h后孵化,n .椰子花瓣提取或引用受体激动剂,(AL34662 5 -;对MC melanotan二世₄R)被添加在单独的井noncytotoxic浓度和孵化为90分钟37°C;5%的公司₂。55μL准备检测试剂的解决方案是添加到每个。60分钟后在室温下孵化,板使用发光板读读者(FLUOstar)。

2.8.2。拮抗剂化验

大麻素受体2(中国北车₂)。连续甲醇和水提取物的效果n .椰子在抑制CP 55940(中国北车₂受体激动剂)引发了中国北车₂活动Gi /去耦合CHO-K1细胞系进行了研究。10⁴细胞/镀在96 -包含细胞组织培养板电镀试剂。48 h后孵化,n .椰子或引用拮抗剂(AM630)添加到各自的井和孵化为30分钟37°C;5%的公司₂。5μ55940年L受体激动剂化合物(CP)是添加到各自的井在110年最后一卷μL和孵化为90分钟。55μL准备检测试剂的解决方案是添加到每个在室温下孵化60分钟,并使用荧光板板是读读者(FLUOstar)。

黑色素集中激素受体(MCHR₁)分析。敌对的潜力n .椰子提取物在MCHR₁使用MCHR受体进行了研究₁胃肠道耦合CHO-K1细胞。3×10的细胞密度⁴细胞/镀在96 -包含细胞组织培养板电镀试剂和孵化24 h。孵化后,整个介质吸气和45μL细胞分析缓冲和抗体的混合物被添加到每个。n .椰子或引用拮抗剂(803430千瓦)添加到各自的井和孵化为15分钟37°C和5%的公司₂。受体激动剂化合物(妇幼保健- 62.5 nM + Forskolin 20μ米)添加到各自的井和孵化了30分钟。60μD L准备检测试剂溶液和阵营的解决方案是添加到每个好,孵化在黑暗中在室温下60分钟。60μL营地的解决方案添加和孵化3人力资源在黑暗中在室温下。板使用发光板读读者(FLUOstar)。

2.9。数据分析

脂肪形成和adipolysis化验,统计分析是由使用Graphpad棱镜单向方差分析统计软件。结果被表示为每个治疗组平均±标准差从三个复制。差异与相比于控制被认为是具有统计学意义。脂肪酶测定,意味着相对荧光单元(RFU)n .椰子计算/参考控制测试一式三份。平均值的百分比抑制(使用以下公式计算:

集成电路₅₀由芬尼计算软件。受体分析,学生的以及使用GraphPad棱镜5执行统计软件来测试差异在所有治疗。差异与被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。的影响n .椰子3 t3-l1分化的细胞

Noncytotoxic 50浓度μ克/毫升和100年μg / mL连续被选为甲醇和水提取物n .椰子分别为在体外基于单元的分析。测试是否n .椰子提取物抑制脂肪细胞的分化,分化脂肪细胞被油红o染色的染色结果表明,孵化n .椰子分化期间显著抑制3 t3-l1脂肪形成。发现治疗3 t3-l1细胞n .椰子连续的水提取物显著降低剂量依赖性的细胞分化和脂质积累方式,而控制细胞。甲醇提取的n .椰子表现出显著的抑制脂肪细胞分化的浓度19% 2μ克/毫升。参考控制、guggulsterone演示了一个强力的抑制活性脂质积累20岁μ米的抑制百分比48(图1)。

3.2。分解脂肪的作用n .椰子在分化3 t3-l1细胞

n .椰子花瓣提取显示明显的脂解的活动显著增加的甘油释放3 t3-l1细胞分化。甲醇提取的n .椰子显示明显的剂量依赖性释放甘油浓度从2μ50 g / mLμ克/毫升。3.5倍的最大分解脂肪的活动增加与甲醇提取物的观察n .椰子在一个集中的50μ克/毫升。连续的水提取物显示显著增加的甘油浓度最高水平(20 - 100μg / mL),观察1.9的成倍增加。异丙肾上腺素,一个已知的分解脂肪的代理,引起了甘油由脂肪细胞释放的测试浓度10μM控制权(图增加了4倍2)。

3.3。脂肪酶的抑制作用n .椰子

胰脂肪酶连续甲醇和水提取物的抑制n .椰子是50的筛选浓度决定的吗μ克/毫升。百分比脂肪酶的抑制作用的连续甲醇和水提取50岁μ克/毫升n .椰子分别被发现52和10。此外,脂肪酶抑制潜在的甲醇提取物进行了测试,以确定集成电路₅₀(抑制脂肪酶的活动所需的浓度50%)。甲醇提取的n .椰子表现出剂量依赖性与IC脂肪酶的抑制作用₅₀47岁的价值μ克/毫升。然而,这不是比奥利司他显示IC更有效₅₀26 ng / mL(表的价值1)。

3.4。核心目标动作n .椰子

3.4.1。5 -_2摄氏度和MC₄受体化验

连续甲醇和水提取物n .椰子10点μg / mL显示显著的均等的刺激的活动对5 - 4倍增加受体(表2)。参考控制AL34662演示了一个强有力的对5 -受体激动剂活性存在剂量依赖的相关性受体与电子商务₅₀~ 10.8 nM的价值。甲醇和连续的水提取物对MC受体激动剂活性不显著₄受体的浓度为10μ克/毫升(表2)。Melanotan II,一个已知的MC₄R受体激动剂,展示了一种浓度的受体激动剂对MC活动₄R EC受体₅₀~ 3.3 nM的价值。

3.4.2。中国北车₂和MCHR₁受体化验

在一个集中的10μg / mL,甲醇提取的n .椰子花瓣显示26.2%对抗对CP 55940对中国北车活动₂受体,而连续的水提取物的浓度被发现不活跃的10μ克/毫升(表2)。AM630,中国北车₂拮抗剂,演示了一个强有力的对手对CP 55940激活中国北车活动₂受体与集成电路₅₀~ 62.3 nM的价值。两种提取物对MCHR没有显示拮抗剂活动₁(表2)。803430千瓦,MCHR₁拮抗剂,演示了一个强有力的对手对妇幼保健诱导MCHR活动₁受体与集成电路₅₀的价值~ 13海里。

3.5。甲醇提取的植物化学的分析n .椰子

高效液相色谱分析的粗甲醇提取的n .椰子确认类黄酮是主要的植物化学物质的存在。高效液相色谱紫外光谱分析证实了紧随其后的身份类黄酮苷(槲皮素和山柰酚苷)由Xingfeng符合早些时候报告et al。23]。

4所示。讨论

膳食脂肪并不直接被小肠吸收,除非脂肪一直受到胰脂肪酶的作用。因此,胰脂肪酶是一种最广泛研究机制确定天然产品和潜在功效为典型代理[26]。在这项研究中,我们报告的抑制效应莲属椰子花瓣提取胰脂肪酶。甲醇提取了IC脂肪酶酶的抑制作用₅₀47岁的价值μ克/毫升。类似于我们的研究但在荷叶上,作者显示各类典型活动通过浓度抑制脂肪酶酶和调节脂质代谢(4]。莲属椰子被称为神圣的莲花和发现各种药物活性物质包括生物碱、黄酮类化合物,常用药用,多酚,类固醇,苷(23]。植物化学的调查的n .椰子叶子隔离了八个生物碱和一些显著抑制胰脂酶(20.]。总类黄酮n .椰子叶子显示高对猪胰脂肪酶抑制活动,α淀粉酶,α葡糖苷酶。也降低总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、丙二醛和提高了高密度脂蛋白胆固醇在活的有机体内系统。此外,它缓解了高脂肪食源性脂质积累在肝脏27]。

脂肪细胞的形式主要是甘油三酯和释放他们存储在游离脂肪酸与能源需求的变化。n .椰子花瓣提取物表现出明显的剂量依赖性抑制对3 t3-l1脂肪细胞脂质积累的影响。生物碱分离n .椰子显示更强的抑制对脂肪细胞分化的影响(20.),可能导致花瓣的活动n .椰子。类似于本研究莲子,外果皮中提取的n .椰子研究了使用一个在体外3 t3-l1 preadipocyte细胞模型。结果表明,莲子外果皮提取物抑制preadipocyte分化为脂肪细胞浓度的方式(21]。典型药物的影响n .椰子叶萃取精华(向)使用高脂肪食源性肥胖小鼠进行了研究。向显著减少高脂肪食源性体重增加,子宫旁组织的脂肪组织重量,和老鼠的肝脏三酰甘油水平。作者得出结论,向受损的消化,抑制脂类和碳水化合物的吸收,加速脂类代谢,调节能量消耗(4]。

在这项研究中,我们已经表明,花瓣中提取的n .椰子显然表现出剂量依赖性的方式分解脂肪的活动在小鼠3 t3-l1成纤维细胞。先前的研究已经报道,叶提取液莲属椰子在分化的脂肪细胞脂解作用刺激活动。作者也表明,治疗脂肪细胞文化荷叶提取物0.5%解决方案显著增加的内容自由甘油。同样的,培养的细胞为1%荷叶提取物溶液诱导显著释放甘油相比,自由控制的细胞(28]。在另一项研究中,50%的乙醇(EtOH)从树叶中提取准备的n .椰子刺激白色脂肪组织中脂类分解(窟)的老鼠和可能的参与该项受体(beta-AR)途径是归因于这种效果。n .椰子在预防食源性肥胖出现是由于各种黄酮类化合物和beta-AR通路的激活有关,至少部分(29日]。

基于5 -受体的研究中,n .椰子花瓣提取显示重要的受体激动剂对5 -活动受体对中国北车和敌对活动₂显示它的作用在中央肥胖的目标是食欲抑制剂。烷基4-hydroxybenzoates被隔绝的种子n .椰子示增强和抑制5-HT-stimulated内向电流(I(5))由人类5 -(3)受体表达在非洲爪蟾蜍卵母细胞(30.]。类似的研究中,哦et al。31日)表明,慢性乙醇提取物治疗桑属阿尔巴叶子会产生一个典型效应在食源性肥胖老鼠通过其直接妇幼保健₁受体拮抗。各种phytocompounds,即生物碱、花青素和nonanthocyanin类黄酮,被孤立的花瓣n .椰子(32,33),证明有其他生物活性;然而,他们的角色在各类典型活动需要确定。

Flavonoid-enrichedn .椰子叶提取物显著抑制高脂肪食源性异常血脂及肝损伤(27]。Galleano et al。34)合并证明链接类黄酮摄入与代谢紊乱,即肥胖、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、高血压和胰岛素抵抗。然而,一系列的分子机制已确定;端点的类黄酮代谢综合症的影响仍不确定。这些旋转被解释为代谢综合征的危险因素之间的复杂关联,多个生物目标控制这些危险因素,和大量的黄酮类化合物(包括他们的代谢物)出现在饮食和潜在的负责在活的有机体内效果。因此,大量的基础和临床研究的评估类黄酮治疗代谢综合征的相关性(34]。

急性和subchronic口服毒性的研究n .椰子雄蕊提取物在大鼠进行急性毒性和发现安全阈值高于5000毫克/公斤体重,和no-observed-adverse-effect水平(科学)提取的雄性和雌性老鼠被认为是200毫克/公斤/天(35]。

总之,n .椰子花瓣提取显示antilipase活动,分解脂肪的脂肪细胞和antiadipogenesis效果在体外。n .椰子提取表明受体激动剂和拮抗效应对中央受体参与食物摄入量。因此,值得进一步研究n .椰子花瓣提取并对其药理作用的潜在植物成份在代谢紊乱,特别是肥胖。

利益冲突

所有作者宣称他们没有利益冲突。

承认

本研究得到印度生物技术部的支持,印度在Indo-Spanish联合呼吁在生物技术领域的合作。