发酵小麦胚芽提取物诱导细胞死亡和增强顺铂、5 -氟尿嘧啶人类肝癌细胞的细胞毒性

文摘

肝细胞癌(HCC)是全球最常见的肿瘤相关性死亡的原因。由于早期诊断困难,治疗治疗是不能用于大多数病人。姑息治疗如化疗常常与低反应率有关,强烈的副作用和有限的病人临床益处。替代方法如发酵小麦胚芽提取物(FWGE)与抗肿瘤功效可以提供改善当前治疗肝癌的临床结果。本研究旨在阐明抗肿瘤功效FWGE和FWGE与化疗药物的组合药物作用,顺铂和5 -氟尿嘧啶(研究者用)在人类肝癌细胞,HepG2 Hep3B, HepJ5。目前的研究表明,抑制HepG2 FWGE表现出潜力,Hep3B,和HepJ5细胞,一半最大抑制浓度(IC₅₀FWGE)分别为0.494、0.371和1.524毫克/毫升,分别。FWGE也诱导聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP) Hep3B细胞中细胞死亡有关。此外,FWGE治疗进一步增强顺铂在所有测试了肝癌细胞的细胞毒性和细胞毒性的研究者用协同方式HepJ5细胞。集体,结果发现FWGE在肝癌细胞的抗肿瘤功效,建议FWGE可以用作补充有效改善肿瘤抑制顺铂和研究者用在肝癌细胞的效率。

1。介绍

肝细胞癌(HCC)是全球最常见的癌症之一,站在癌症死亡的第二位1),尤其是在亚洲和撒哈拉以南的非洲地区(东部2]。早期肝癌的治疗治疗肝移植,切除或局部消融,但是这些方法并不可行的先进的患者(2,3),复发率高达50%在术后2年(4]。由于肝癌的早期诊断困难,大约70%的患者被诊断为肝癌晚期,无法接受治疗治疗(3]。发展的替代治疗方法,姑息治疗如chemoembolisation建议显示晚期肝癌患者的生存利益(5,6]。例如,尽管标准化疗药物如顺铂、5 -氟尿嘧啶(研究者用)管理系统性化疗证明没有临床效益和改善生存(7,8与顺铂)、肝动脉灌注和chemoembolisation研究者用被认为是潜在的治疗方法治疗肝细胞癌(9]。近年来,小说等代理索拉非尼还建议肝癌治疗进展[10]。尽管治疗肝细胞癌的治疗方法的发展,肝细胞癌患者的死亡率仍超过90%全球(1]。替代疗法(如组件如姜黄素、白藜芦醇silibinin从天然产物分离),提供改善目前肝癌治疗的临床结果因此在急需11]。

发酵小麦胚芽提取(FWGE),配偶Hidvegi博士发明的,是一种营养补充剂与药用价值在范围广泛的潜在疾病的目标(12- - - - - -14),包括抗肿瘤功效对许多肿瘤类型在体外(15),在活的有机体内(16,17]。此外,一些临床研究也报道了使用FWGE改善大肠癌患者的总生存期和皮肤黑色素瘤。这些数据表明,FWGE有潜力提供福利在癌症治疗18,19]。2-methoxy苯醌和2 6-dimethoxybenzene FWGE的两个主要组件,提出施加FWGE[的主要生物学特性14,20.]。最近的研究表明,FWGE破坏目标的无氧糖酵解和戊糖周期转酮醇酶glucose-6-phosphate脱氢酶、乳酸脱氢酶,己糖激酶(14,21,22),FWGE抑制肿瘤细胞DNA合成的前体分配(13]。肿瘤细胞的t细胞白血病,FWGE治疗诱导细胞程序性死亡,干扰糖酵解和戊糖循环,导致细胞周期阻滞和激活caspase-dependent保利(腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)通路(23]。FWGE结合化疗药物的效果已被证明在肝细胞癌,直肠癌、卵巢癌和乳腺癌细胞(16,24,25]。这些先驱研究结果表明FWGE可能提高顺铂在卵巢癌细胞的细胞毒性24),增加研究者用在结直肠癌细胞的功效15]。然而,尽管治疗的anti-proliferative影响FWGE仅演示了在人类肝细胞癌和HepG2细胞(15),FWGE未能结合研究者用后可增强细胞毒性,达卡巴嗪或Adriblastina在同一个细胞系(16]。需要进一步说明的使用FWGE结合化疗药物对肝癌的治疗。

因此,本研究的目的是评估FWGE在人类肝癌细胞的抗肿瘤效应,并进一步阐明FWGE的影响结合标准化疗药物顺铂和研究者用。这些数据可能会提供一个理性的基础结合使用FWGE补充和治疗选择在肝癌治疗的发展。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

人类肝癌细胞株,HepG2 Hep3B, HepJ5杜尔贝科的修改鹰的培养基培养(美国纽约Gibco,大岛)与100 U /毫升青霉素和100年g / mL链霉素(美国生活表达载体技术,卡尔斯巴德,CA) 37°C的5%的股份有限公司₂湿润孵化器。

2.2。细胞生存能力分析和显微观察

HepG2、Hep3B HepJ5细胞被播种到96孔酶标5×10的密度³细胞每一夜之间,然后处理各种浓度的发酵小麦胚芽提取物(Avemar FWGE,品牌名称,美国生物科学公司,Blauvelt,纽约,美国)48或72人力资源。细胞生存能力的肿瘤细胞在本研究中主要是由3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)试验,进一步证实了细胞大小测量使用权杖细胞计数器(默克密理博Billerica,妈,美国)。肿瘤细胞被播种到24-well板的密度3×10⁴细胞每口井。一夜之间培养后,细胞被暴露在连续稀释FWGE: 0, 0.25, 0.5毫克/毫升HepG2细胞,0,0.2,0.4毫克/毫升Hep3B细胞,和0,0.5,1毫克/毫升HepJ2细胞。细胞被胰蛋白酶化收获72 h后添加FWGE和细胞数量统计的权杖细胞计数器。

调查的影响FWGE结合顺铂和5 -氟尿嘧啶(研究者用,购买代理商Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),HepG2, Hep3B HepJ5细胞治疗与不同浓度顺铂和研究者用0.5,0.25和1毫克/毫升FWGE。72小时后,MTT比色细胞生存能力分析和形态学观察尼康Eclipse TS100光学显微镜(美国纽约尼康仪器,梅尔维尔),在100 x放大拍摄。

2.3。免疫印迹分析

HepG2、Hep3B HepJ5细胞(5×10⁵细胞每道菜)一夜之间被播种在6厘米的菜肴。与不同浓度的孵化后FWGE(表示),细胞被里帕收获缓冲区(150毫米氯化钠,50 mM pH值7.5 Tris-HCL NP-40 1%, 0.5%脱氧胆酸盐,0.1% SDS, PMSF 1毫米,10g / mL亮抑酶肽和100g / mL抑肽酶)。整个细胞的总蛋白浓度提取测定Bio-Rad蛋白质分析工具包(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。每个单元格提取然后平衡的30g和使用12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。蛋白质被转移到一个聚偏二氟乙烯膜(笼罩Corp .)、港口华盛顿,纽约,美国)和探测的主要抗体,PARP(1: 1000年,细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国),和3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH 1: 10000年,Abfroniter,首尔,韩国),紧随其后的是驴antirabbit辣根过氧化物酶共轭二次抗体(1:10000年,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA,美国)。免疫反应性被发现与电化学发光免疫印迹检测设备(WesternBright Advabsta,门洛帕克,CA,美国)。

2.4。统计分析

数据从细胞生存能力和半定量的免疫印迹分析提出了均值±站推导(SD)。统计学意义分析了单向方差分析时检查剂量依赖效应。统计分析是由SPSS(美国SPSS . n:行情)、芝加哥、IL)。

CalcuSyn软件(Biosoft,剑桥,英国)是用于统计分析的最大抑制浓度(IC的一半₅₀MTT比色)测定和FWGE与化疗药物的联合效应。合并后的药物效果的统计分析CalcuSyn软件基于median-effect方法和评估综合指数(CI)的值(26),这是一个有用的工具来识别协同,添加剂和组件之间的拮抗效应在癌细胞27,28]。

3所示。结果

3.1。FWGE治疗人类肝癌细胞诱导细胞死亡

在本研究中,抗增殖活动48或72小时连续暴露在各种浓度的FWGE评估在三个人类肝癌细胞,HepG2, hep3B HepJ5细胞。如数据所示1(一)1(c), anti-proliferative FWGE的影响在三个肿瘤细胞表现出剂量依赖性的方式进行测试。HepG2 Hep3B细胞,FWGE治疗72小时导致对细胞生长的抑制作用超过48小时的治疗。相比之下,FWGE治疗产生了类似的生长抑制作用HepJ5细胞48和72小时。集成电路₅₀FWGE分别为0.494,0.371和1.524毫克/毫升,HepG2 Hep3B,和HepJ5细胞,分别,这表明HepG2和消息灵通的3 b细胞更敏感比HepJ5 FWGE治疗细胞(表1)。观察形态学变化FWGE细胞治疗建议FWGE诱导细胞死亡而不是细胞生长抑制(数字1(d)1(e))。FWGE治疗也导致HepG2细胞收缩和Hep3B细胞和细胞凋亡的存在体像泡在萎缩的细胞(数字1(d)和1(e)),而FWGE增加HepJ5细胞中脂滴的形成囊泡(图1(f))。细胞MTT比色可行性分析是基于测量的线粒体氧化还原酶在存活细胞的代谢活动,但可能有偏见的存活细胞的代谢活动时受到特定压力对线粒体(29日]。进一步证实anti-proliferative FWGE对测试的影响肿瘤细胞,细胞大小分布决定。细胞数量统计的权杖细胞计数器是基于库尔特原理impedance-based粒子检测(30.]。细胞的直径介于10 - 22之间m是算作细胞生存。在图2(一个),存活细胞HepG2的数量,3 b, J5细胞明显减少FWGE治疗72小时后剂量依赖性的方式。此外,FWGE治疗导致更多的细胞,一个小得多的规模(6到8米)建议从死细胞细胞碎片(数据的积累2 (b)和2 (c))。免疫印迹分析的结果也表明激活PARP Hep3B细胞治疗0.25毫克/毫升FWGE 72人力资源。这些结果与形态学变化观察到FWGE治疗细胞表明FWGE可能触发程序性细胞死亡而不是抑制肿瘤细胞的增殖。

有趣的是,细胞MTT比色可行性分析高于统计的权杖细胞计数器。例如,HepG2细胞的生存能力在0.5毫克/毫升FWGE治疗MTT比色85%,化验,而结果统计的权杖细胞计数器是50%。也观察到类似的结果Hep3B和J5细胞。Hep3B HepJ5细胞暴露于0.2和0.5毫克/毫升FWGE揭示细胞MTT分析可行性,但75%和77%分别为35%和65%,确定权杖细胞计数。这些结果表明,MTT试验可能低估了抗肿瘤FWGE对肝癌细胞的效率。

3.2。FWGE增强化疗药物对人类肝癌细胞的细胞毒性

评估的影响结合FWGE和化疗药物对肝癌细胞HepG2, 3 b和J5细胞治疗与不同剂量顺铂或研究者用0.5,0.25和1毫克/毫升FWGE,分别。FWGE剂量用于每个细胞株抑制约60%在以前的结果(图实现1)。集成电路的使用₆₀FWGE是避免在抑制细胞的生存能力和导致的难度评价组合FWGE和化疗药物的效果。肿瘤细胞暴露于顺铂或研究者用的可行性与FWGE单独或组合图所示3。结果表明,FWGE进一步减少细胞HepG2的可行性和Hep3B顺铂的存在,细胞和HepJ5研究者用的存在。随后的治疗,FWGE降低集成电路₅₀顺铂从6.843到1.049,4.436,1.111,和15.785至6.021米hepG2 Hep3B,分别和HepJ5细胞。细胞治疗的研究者用co-treatment FWGE略降低集成电路₅₀从5.237到4.591的研究者用的细胞HepG2但不是Hep3B(表1)。尽管HepJ5相对耐研究者用治疗与HepG2和Hep3B细胞相比,FWGE结合研究者用仍然导致了更大的抑制HepJ5细胞(图3和表1)。这些结果表明,细胞毒性的顺铂和研究者用FWGE co-treatment,可能会进一步增强。结合指数(CI)分析了Calcusyn软件可能有助于识别结合FWGE cisplain和研究者用对肝癌细胞的影响。的,协同、添加剂和敌对的影响是由CI值表示< 1 = 1 > 1。如表所示2FWGE治疗,结果发现在细胞治疗1 - 2添加剂效果1)M的顺铂(CI封闭,在5到20和协同效应M的顺铂对HepG2细胞(CI < 1)。而协同效应在1至15和5到30观察顺铂在Hep3B和HepJ5细胞,分别。FWGE治疗还显示协同效应与1到50 - 50到250研究者用在HepG2和HepJ5细胞。拮抗效应(CI > 1)在Hep3B细胞,但细胞生存能力是相似的在各种肿瘤细胞治疗研究者用孤独和结合FWGE(图3 (b))。根据词的分析,cotreatment FWGE可能增强顺铂的细胞毒性和研究者用,根据细胞类型和管理剂量的化疗药物在人类肝癌细胞。

4所示。讨论

目前的研究表明,FWGE对人类肝癌细胞表现出一种有效的抗肿瘤活性,尤其是HepG2和Hep3B细胞与IC₅₀0.494和0.371毫克/毫升的价值观。相比之下,HepJ5更耐FWGE治疗一个集成电路₅₀1.524毫克/毫升。我们的研究结果与以前的研究表明一个集成电路₅₀FWGE治疗96小时是0.33毫克/毫升HepG2细胞。有趣的是,细胞MTT比色可行性分析明显高估的生存FWGE治疗肝癌细胞与细胞大小分布的测量,特别是对HepG2(85%比56%的细胞生存能力为0.25毫克/毫升FWGE)和Hep3B(75%比35%细胞生存能力为0.2毫克/毫升)。自细胞生存能力以MTT试验根据比色的紫色甲瓒转换由线粒体脱氢酶(31日],FWGE磷酸戊糖途径FWGE而中断可能会导致在肝癌细胞中线粒体的代谢活动改变,导致高估了光学密度的测量。HepJ5细胞,MTT实验和细胞之间的差异大小分布在HepG2和Hep3B细胞较小,这表明FWGE治疗可能会导致更少的在HepJ5细胞线粒体代谢紊乱。东和他的同事们认为,缺氧诱导因子1α(HIF - 1)是在HepJ5细胞和线粒体介导的细胞凋亡中起着保护作用[32]。这种生物特性可以帮助HepJ5细胞逃避FWGE引起的破坏和死亡。

FWGE治疗也导致明显的形态学变化三个肝癌细胞株。HepG2和Hep3B细胞,细胞收缩和FWGE治疗后发生凋亡身体,就像囊泡的形成,而脂滴像囊泡是HepJ5细胞质中所示。肝癌细胞的细胞大小分布范围从10 - 22所示m和转移到6 ~ 8m细胞FWGE对待,这表明肝癌细胞被分解成碎片。这些结果暗示FWGE诱导肝癌细胞的细胞死亡。观察形态学变化Hep3B和G2细胞表明细胞凋亡可能参与FWGE-induced细胞死亡。劈理的PARP Hep3B细胞进一步证实了这一观察和建议FWGE诱导肝癌细胞死亡与PARP涉及程序性细胞死亡。自从FWGE诱导细胞死亡在t细胞白血病细胞参与caspase-PARP通路(23),PARP激活可能会发挥重要作用在肿瘤细胞FWGE诱导细胞死亡。另一方面,特定的形态变化和脂滴的形成囊泡FWGE治疗后显示在HepJ5 FWGE治疗细胞的特异性反应。这脂滴像囊泡是类似于自噬小体,因此提出了一个疑问,一个保护性自噬过程在HepJ5激活细胞逃避FWGE引起的破坏和随后的细胞死亡。由于自噬作为细胞程序性死亡过程是把双刃剑或防止细胞死亡致命的压力,尤其是在肿瘤细胞(33),是否FWGE HepJ5细胞诱导自噬,自噬的作用可能值得进一步调查。

FWGE被认为是一个安全的营养补充了医疗目的包括癌症患者的推荐剂量,没有观察到不良反应(14),虽然FWGE作为药物成分的临床意义有待验证了更多设计良好的临床试验(34]。FWGE是作为辅助治疗大肠癌的化疗和放疗和皮肤黑色素瘤在一些临床研究(18,19]。因此,FWGE结合化疗药物的影响,顺铂和研究者用测试目前的研究澄清临床FWGE肝癌治疗的潜力。HepG2 Hep3B细胞,顺铂诱导细胞毒性被FWGE大大增强,导致降低集成电路₅₀剂量(表1)。尽管集成电路₅₀HepJ5没有细胞,FWGE治疗仍然增强cisplatin-induced HepJ5细胞毒性,细胞HepG2, Hep3B。CI分析表明FWGE cisplatin-induced增强细胞毒性的影响是协同在5 - 20,1 - 15和30对HepG2 M,分别Hep3B和HepJ5细胞。这些数据都同步观察人类卵巢癌细胞接受FWGE和顺铂(24]。另一方面,FWGE co-treatment研究者用增强细胞毒性的研究者用集成电路₅₀剂量HepJ5细胞,但不是HebG2和Hep3B细胞。CI分析还表明FWGE的协同效应在HepJ5研究者用细胞。由于相似性较高的细胞治疗后生存曲线FWGE和研究者用HepG2和Hep3B细胞,CI分析不能清晰地识别FWGE的组合效果,研究者用在这些细胞系。然而,FWGE cisplain或研究者用了没有拮抗效应检测肝癌细胞。自FWGE激活细胞程序性死亡在肝癌细胞中,FWGE相关细胞死亡的途径是否也与顺铂或研究者用诱导细胞凋亡,需要进一步调查。

5。结论

FWGE展出一个抗肿瘤疗效和人类肝癌细胞,诱导细胞死亡包括HepG2 Hep3B, HepJ5细胞。结合化疗药物中,顺铂,研究者用FWGE没有敌对的效应,并最终增强cisplatin-induced HepG2细胞毒性,Hep3B, HepJ5细胞,以及5-Fu-induced HepJ5细胞的细胞毒性。顺铂的组合效果,总结了研究者用图4。总之,这项研究的结果表明,FWGE是一个潜在的辅助治疗改善肿瘤抑制效率,特别是在治疗方案对肝癌患者使用顺铂和研究者用。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Cheng-Jeng Tai和王Wen-Ching贡献了同样的工作。

确认

这项工作是支持的奇美医学中心(101 cm-tmu-12-4)。Cheng-Jeng Tai和王Wen-Ching并列第一作者。

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