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Saba Sheikh, Ashok Srivastava, Rajesh Tripathi, Shalini Tripathi, V. P. Trivedi, r.c. Saxena， ＂一种新型草药制剂Las01对人癌细胞系的毒性及其在人和动物中的安全性"，循证补充和替代医学， 卷。2012， 文章的ID948375， 9 页面， 2012． https://doi.org/10.1155/2012/948375
一种新型草药制剂Las01对人癌细胞系的毒性及其在人和动物中的安全性
萨巴酋长
，1
Ashok斯利瓦斯塔瓦，1
Rajesh Tripathi，1
莎莉尼·特里帕西，1
v . p . Trivedi，1
和
r . c . Saxena1
1拉瓦尼亚阿育吠陀医院和癌症研究中心，拉瓦尼亚阿育吠陀生物科技园，拉瓦尼亚阿育吠陀医院和癌症研究中心，Chinhat, Dewa Road，印度勒克瑙226016
摘要
Charaka Samhita中描述的基于Rasayana疗法的多面体配方显示出对现代化疗和放疗难以治疗或反应较差的各种癌症患者的生活质量有显著改善。Las01是一种最新的新颖的草药制剂，完全按照古代阿育吠陀文献的指示制备，它被发现在人类细胞系MCF-7和Hela癌症细胞系中是一种有效的抗癌药物。Las01的这种新制剂在动物和人体中都没有毒性，这是现代医学体系中使用的化疗药物的主要缺点。我们的研究结果为多中心的大规模临床试验提供了依据，这似乎是一种未来有望治愈不可治愈的癌症患者的药物。
1.介绍
癌症已经成为世界科学界面临的最大挑战之一，尽管癌症的药物和其他治疗方式不断发展，但在每一个层面的治疗都很复杂。癌症化疗与许多不想要的副作用有关，如恶心、味觉丧失、嗜睡、脱发、性欲丧失、免疫抑制和骨髓抑制，以及肿瘤发生[1］.因此，有必要找到相对安全、有效、经济的治疗癌症的方法。科学界正在关注治疗癌症的传统整体药物体系。草药疗法是治疗癌症等疾病最有前途的领域之一。阿育吠陀的分支研究草药和草药制剂的药用特性，称为Rasa shastra，使用的药物称为Rasa Aushadhi。在佛祖时期，由于药效更快、剂量更少、更方便，以及与草药相比的神秘功效，它们更受欢迎。草药化合物的各种成分，如金、银、铅、铁和砷，从未以原始形式使用，因为它们的原始形式会产生有毒和毒性作用[2］.
现代科学现在已经揭示了厌氧烹饪用于制备草药药物的过程，将有毒的金属大颗粒转化为安全有效的纳米颗粒，甚至更小的微颗粒，这解释了草药药物作为有效的癌症药物的用途，作为预防，缓解，治疗，和支持性的药物。因此，Rasayana疗法及其在癌症管理中的作用正在这个国家几乎所有领先的阿育吠陀研究机构进行筛选。Charaka Samhita描述的基于Rasayana疗法的多面体配方显示了早期接受化疗和放疗的各种癌症患者的生活质量的显著改善。它还能有效克服化疗和放疗的副作用，如脱发、体重减轻、口腔炎和口干燥[3.，4］.本研究检测了Las01在动物和人体内的安全性和毒性，并在乳腺癌细胞株MCF-7和HeLa宫颈癌细胞株job1041上检测了其抗癌活性的治疗效果。
2.材料和方法
2．1.Las01 Herbomineral抗癌
本研究中使用的药物是Las01，由Lavanya Ayurvedic医院和癌症研究中心自己的生产单位按照我们古老的阿育吠陀文献中所列的说明制备的草药制剂[5］.因此，LAS01制备含有许多草本植物和不同类型的无机矿物，如汞，随着Kupipakva Rasayana技术的75个步骤，含有75个步骤，其含有Bhasma的形式抗癌药物。通过使用物理化学性质和透射电子显微镜，将该草霉素药物标准化。
２.２.动物、饲料、剂量和实验
实验采用查尔斯-福斯特系白化大鼠，雌雄均为，体重150-200克。每组16只动物进行急性毒性研究。将大鼠随机分为4组，其中1组为对照组(雌雄各2只)，连续14天进行急性毒性研究。慢性毒性试验将36只大鼠随机分为4组，第一组为对照组，正常饲养90天，雌雄各3只。使用了勒克瑙萨加尔技术管理学院的动物舍设施;所有动物实验均经研究所动物伦理委员会批准后进行。维持标准动物条件:室温21±20℃，相对湿度60±10%，光/暗循环12 h。为大鼠提供商品颗粒饲料和反渗透水自由．试验药物Las01的实验研究剂量由人体剂量(1000 mg/天)外推至动物剂量(88.02 mg/kg正常剂量= 1x;880.2 mg/Kg体重量= Las01 10x;3520.80 mg/Kg体重量=Las01 40x)，以体表面积比为基础，并口服给药[6］.
研究分为急性和亚慢性两个阶段。急性毒性试验于第14天处死，亚慢性试验于第90天处死。在尸检过程中，可以通过肉眼观察内脏器官的形状、大小和颜色来寻找病变的迹象。采用心脏穿刺法采血，采集至EDTA-K3和非vac凝块激活剂中。试管分别用于血液和生化分析。血液学参数用自动细胞计数器检查，血红蛋白用高铁血红蛋白法检查[7由血液)。血清通过3000rmp离心10分钟用于生化分析，使用Roche诊断试剂制备的试剂盒。血清谷氨酸草酰乙酸转氨酶(SGOT)、血清谷氨酸丙酮酸转氨酶(SGPT)、碱性磷酸酶(ALP)用(国际临床化学联合会)IFCC方法测定[8]，总胆红素和直接胆红素用Jen Drasik和Grof法，肌酐用Jaffe和动力学法，血尿素氮用甘油醛脱氢酶法[9总蛋白用双缩脲法测定，白蛋白和球蛋白用溴甲酚绿法测定。用Biolyte 2000离子选择性电解质分析仪测定血清钠、钾含量[10］.肝脏组织病理学分析(图1)、肾(图3.），心脏（图2)，用切片机切割组织2毫米，用10%甲醛固定，进一步用苏木精和伊红染色，并由病理学家检查。
（a）控制
1 (b)组
组2 (c)
(d)组3
(一)控制
1 (b)组
组2 (c)
(d)组3
(一)控制
1 (b)组
组2 (c)
(d)组3
２.３.Las01在25例不同癌症患者中的安全概况
Lavanya Ayurvedic医院在过去的几年里一直在用Las01草药治疗癌症患者。在本研究中，25名患者的血液被用于Las01制剂的血液学和生化(肝和肾)毒性。在获得患者的书面知情同意书和IEC的批准后，采用Las01 Herbomineral制剂对癌症患者治疗1年前后的血液进行分析。
2.4。体外抗癌
2.4.1。癌症细胞系和培养条件
人Hela宫颈癌细胞系和MCF-7乳腺癌细胞系（腺癌）是从印度的国家细胞科学中心（NCCS）浦那。在含有10％胎牛血清和抗生素（100个单位/ ml青霉素和100mg L.）的Dulbecco的改性鹰培养基（DMEM）中，将两条细胞系培养为单层培养物。−1在5% CO的湿化气氛中2在37°C的T-75瓶中培养，每周传代两次。
2.4.2。细胞毒性试验
采用MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑]方法评价Las01对人宫颈癌HeLa和MCF-7乳腺癌细胞系(腺癌)细胞的细胞毒性作用[11］.简单地说，细胞在数量为2的情况下被播种10496孔板上的每孔细胞（200 μL/孔)，用不同浓度Las01溶解的乙醇(25 mg/L - 500 mg/L)浸泡48 h。在处理结束时，去除培养基，用20μL的MTT (5 mg/mL的PBS)，在新鲜培养基中37°C孵育4小时。4小时后，MTT线粒体还原形成的福马赞晶体溶解于DMSO (150μL/well)，在iMark Microplate Reader (Bio-Rad, USA)上孵育10 min后，在570 nm处读取吸光度。细胞毒性抑制百分数作为对照(不含Las01)的一个分数计算，Las01的细胞毒性表示为%抑制。
2.4.3。LDH测定
通过乳酸脱氢酶(LDH)渗漏到培养基中，测定了Las01的细胞毒性。Las01暴露后，抽吸培养基，3000rpm离心5分钟，获得无细胞上清。用市售的培养基上清液测定LDH活性CytoScan通过使用LDH细胞毒性试验设备。计算细胞毒性抑制率作为对照(不含Las01)的一个分数，Las01的细胞毒性表达为IC50。
2.4.4。台盼蓝排除法染色活性测定
Las01的细胞毒活性采用Ian Freshney, 1994年采用的台盼蓝排除法进行分析。指数生长期的细胞系用PBS溶液洗涤，胰酶化后重悬于完全培养基中。细胞以5000个/孔的温度放置于6孔板中，孵育24小时，形成部分单层细胞。孵育后将细胞暴露于不同浓度的药物中。控制良好的接收仅维持媒体。培养皿在37℃5% CO中孵育2培养箱为24小时。使用倒置显微镜检查形态学变化，并与用作控制的细胞进行比较。在24小时结束时，测定培养细胞活力。
2.4.5。细胞凋亡和坏死的测定
对凋亡和坏死的细胞进行双染色分析，在凋亡细胞核评分的基础上量化培养中凋亡细胞的数量。用6孔板将HeLa细胞(每孔5000个细胞)置于DMEM中，用不同浓度的功能性低聚物(约0 ~ 200个)处理μG·ML.−1在酚红自由培养基中）24小时。收集附着和分离的细胞，然后用Hoechst染料33342染色（2 μG·ML.−1)、碘化物(PI) (1μG·ML.−1)和DNAse free-RNAse (100μG·ML.−1)在室温下放置15分钟[11］.PI染色坏死细胞呈红色。缺乏质膜完整性和PI染料的坏死细胞可以穿过细胞膜，而PI染料不能穿过非坏死细胞膜。采用荧光倒置显微镜(德国莱卡)DAPI和FITC滤光片检测凋亡和坏死细胞数量。
3.结果
3.1。急性毒性
3.1.1。Las01对血液生化指标的影响
用Las01 40倍剂量处理14天的动物，其WBC总数、血红蛋白含量和生化参数没有显著变化(见表)1)．各指标均在正常范围内，未见多动现象。ALD中Las01含量不超过5毫克。
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３．２．慢性毒性
白细胞计数、血红蛋白含量及鉴别计数无明显变化。肝肾功能参数无明显改变。亚慢性给药未引起钠、钾、氯和碳酸氢盐水平的任何变化(见表)2)．大鼠给予高剂量药物后，内脏未见明显组织病理学改变。
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３．３．体外活动
Las01使用MCF-7和HeLa细胞株的细胞毒作用数据在体外见表3.．Las01对MCF-7和HeLa细胞株的细胞毒作用在体外MTT法和LDH法分别抑制MCF-7和HeLa宫颈癌细胞增殖，且呈剂量依赖性。Las01的细胞毒性作用是用10 mg L的浓度测定的−1至500mg L−148小时。在48小时暴露后，LAS01诱导浓度依赖性细胞毒性效果约78％，宫颈细胞系500mg / L，在MCF-7乳腺癌细胞系中以500mg / L为77％。台盼蓝用于染色细胞以观察可行和死细胞的比例。观察到，增加LAS01的浓度（10至500mg / L）降低癌细胞的活力。LAS01的低浓度对细胞产生的低毒性效果，而在较高浓度（500mg / L）中，毒性的效果较高，因此在MCF-7和HeLa中仅为20％和18％，观察到活力（见桌子4)．对照细胞和处理细胞的双染色结果如图所示4．对照组细胞均发绿色荧光，特征正常。Las01处理的大多数细胞呈红色荧光，显示细胞收缩、染色质凝聚、核碎裂和凋亡小体形成等凋亡特征。Las01 1000 mg/L浓度较高时，少数细胞出现细胞肿胀、溶解等坏死特征。
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(一)
(b)
（C）
（d）
（e）
（F）
对照细胞和处理细胞的双染色结果如图所示4．对照组细胞均发绿色荧光，特征正常。Las01处理的大部分细胞呈绿色荧光，250 mg/l时细胞收缩、染色质缩合、核碎裂、凋亡小体形成等凋亡特征较500 mg/l时明显减少。
4.讨论
阿育吠陀是印度11亿人口中大多数人使用的一种传统医疗系统。阿育吠陀这个词的字面意思是生命的科学。经过几千年的使用，它经受了时间的考验和信任。从查拉卡和苏苏鲁塔时代开始，阿育吠陀主要被用作制备治疗药剂的药用植物。直到公元8世纪，印度炼金术士Nagrjuna才规定使用金属(如汞、铅、镉、铁和锌)和矿物质(如云母)作为药物。由于这些药物非常有效，见效快，即使剂量小，美味可口，保质期长，使用矿物质和金属成为阿育吠陀疗法的支柱[12］.
癌症是人类死亡或发病的主要原因[13］.人体由不同的细胞组成。根据身体系统的需要，细胞分裂和繁殖。然而，当由于若干因素受到原子致动囊肿和肿瘤抑制基因之间的平衡时，这些细胞继续除去不必要的肿瘤形成[14］.有证据表明，如果这些颗粒转化为纳米颗粒，则潜在的毒性宏观或微粒可以是无毒的[15］.在植物疗法中寻找新型抗肿瘤化合物是预防癌症的有希望的策略[16］.细胞的增殖依赖于细胞分裂和死亡的速率，因此，许多抗癌药物被用来防止癌细胞分裂，以抑制癌细胞的增殖。在体外细胞毒性试验可用于预测人体毒性和化学物质的一般筛选[17，18］.以前有报道说，不同的细胞毒性试验根据所使用的试验剂和所采用的细胞毒性试验结果不同[19］.我们目前的研究不仅证明了Las01在在体外Las01对人宫颈癌细胞系(HeLa)和乳腺癌细胞系(腺癌MCF-7)的检测，以及Las01对动物实验和人体内各种血液学和生化参数的安全性。Lavanya阿育吠陀医院和癌症研究中心根据我们古代阿育吠陀文献中描述的说明配制的Las01剂量配方也得到了Dasgupta和Cuenca的观察的支持[14，15］.我们的在体外细胞凋亡实验也表明，Las01的特性不死癌细胞可以转化为具有抑癌和抗癌活性的死亡细胞。Las01是一种草药标准化制剂，鉴于其有效性和安全性，有必要在多种癌病条件下进行广泛的临床试验。
5.结论
最新的草药制剂之一，Las01，完全按照古老的阿育吠陀文献中给出的指示制备，已发现对人类细胞MCF-7和HeLa癌细胞系有效的药物。Las01的这种新制备方法也被发现在动物和人体中都没有毒性，这是现代医学中使用的化疗药物的主要缺点。鉴于我们令人鼓舞的结果，值得进行大规模的多中心临床试验，这似乎是一种新的和未来有希望的药物治疗不可治愈的癌症患者。
承认
作者非常感谢M. Arshad博士，勒科斯诺大学佐尔科助理教授，以时间支持和指导。
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