文摘

本研究旨在探讨抗抑郁Shuyusan活动(中药),使用一个不可预知的慢性温和应激引起的大鼠抑郁症模型(ucm)。政府组织Shuyusan汤治疗,疗程3周并与氟西汀治疗。为了理解潜在的抗抑郁Shuyusan活动,尾巴悬挂试验(TST)和强迫游泳试验(置)作为行为绝望的研究。促肾上腺皮质激素的释放因子的水平(CRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质酮(CORT)和海马糖皮质激素受体表达检测。建模后,有显著延长固定时间管理组织体系和置。高剂量Shuyusan可以减少静止时间测量与TST和置。静止的时间在高剂量中药组和氟西汀组与模型组相比显著增加。美联储3周药草后,血清CRH水平,内容CORT在高剂量中药组ACTH,明显降低模型组相比。结果表明,Shuyusan对ucm模型大鼠有抗抑郁活性的影响。潜在的抗抑郁效应可能与减少糖皮质激素水平的活动,调节HPA轴的功能,抑制海马糖皮质激素受体的表达。

1。介绍

在抑郁症发病机制的研究,-肾上腺轴(HPA)过度活跃,和神经内分泌紊乱更认可;除了单胺神经递质(1- - - - - -3]。大脑的海马,作为一个重要的角色认知,情感,和记忆功能,对学习和记忆的巩固是动态的中心(4]。研究提出,HPA的长期慢性压力可能导致甲状腺机能亢进,增加水平的促肾上腺皮质激素的释放因子(CRH),促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质酮(CORT),导致糖皮质激素受体(GR)的过度表达HPA (5]。这个长期的过度和水平的提高糖皮质激素引起的慢性压力可能会导致海马神经元细胞损伤,导致抑郁症状,如抑郁情绪、感觉自己一无所用,失眠,健忘,性功能障碍,和其他抑郁症的症状6,7]。

中医在治疗抑郁症有良好的效果。增加使用中医药对抑郁症的治疗表明,传统的处方药表现出一定的临床疗效,增强疗效,并减少剂量和副作用的常见的药物,结合其他抗抑郁药8]。在中医理论中,肝中扮演一个重要的角色在抑郁症的病理。抑郁症是常见的引起的情绪压力和伤害肝脏洗涤功能的失败以及肝脏气,停滞(气是一种能量流,一种重要的能源,循环身体调节身体功能)或生活来源9- - - - - -11]。Shuyusan一直有效的草药处方对抑郁症在我们医院多年来,显示了净化的心热的影响和调节气和血。我们之前的临床研究表明,Shuyusan可以改善抑郁症的临床症状,和实验室研究表明Shuyusan可能增加5 -羟色胺(5 -)和提高5 -表达引起的海马神经元在大鼠慢性轻度不可预知的应激抑郁(12- - - - - -14]。Shuyusan的主要成分是京尼平甙,去氧五味子素,Spinosae类黄酮苷。京尼平甙SH-SY5Y细胞的保护作用,受伤的大剂量肾上腺酮使用SH-SY5Y损伤模型细胞(15]。因此,保护神经递质从伤病是其中最重要的神经保护作用Shuyusan Shuyusan的抗抑郁活性效应是否依赖与GR在海马体和受体的相互作用可以调节血清CRH水平,ACTH、CORT慢性应激抑郁大鼠的。在目前的研究中,我们旨在调查Shuyusan行为绝望的任务的影响,血清CRH水平,ACTH、CORT、HPA在当前研究的糖皮质激素受体的表达。

2。材料和方法

2.1。动物

我们使用70只成年雄性Sprague-Dawley (SD)老鼠重180 - 220克(许可证号。SLXK 2009 - 0007)进行定量分析。SD大鼠的医学实验动物中心由中国人民解放军(PLA)综合医院。同样70 SD大鼠,随机分为6组,即正常的控制模型,高剂量治疗,中等剂量治疗,与Shuyusan汤低剂量治疗,氟西汀治疗组()。此外,中医和西医治疗组是由Shuyusan草药煎煮和氟西汀,分别。模型,与生理盐水对照组治疗。中药治疗组中的一个老鼠死在24天,因此被排除在分析,但剩下的老鼠都是包含在最终的分析。协议按照指导进行了实验动物保健和使用,建议由科技部制定的中华人民共和国。

2.2。药品、试剂、药品监督管理局

Shuyusan (10 g柴胡属、郁金15克、6克薄荷、10 g栀子,10 g茯苓10 g远志10 g菖蒲,15克的脊柱日期种子和10 g花丝绸的树合欢属在表1)是由中国人民解放军总医院的药房。其主要活性化合物是脊柱日期种子,magnoliavine水果,栀子。Shuyusan煮,过滤和集中到5 g / mL液体在80°C水浴,并存储在冰箱4°C。使用时,用蒸馏水稀释填喂法大鼠。百忧解(盐酸氟西汀分散片,万神殿法国公司,法国,很多:9711 b, 20毫克/片),用于浓度2毫克/毫升液体通过蒸馏水。正常对照组是美联储没有任何治疗。老鼠模型中,Shuyusan组和氟西汀组受到的模型预测慢性温和应激和美联储隔离。美联储模型组21天的压力刺激后正常;高剂量Shuyusan组管理包含Shuyusan 25克/公斤的牛群胃灌注每天一次;中等剂量Shuyusan组与成群的7.5 g / kg; low-dose Shuyusan group was with herds of 2.5 g/kg; fluoxetine was dissolved into 2 mL normal saline and was administered 10 mg/kg through gastric perfusion for the fluoxetine group. The fed dosage of Shuyusan: according to clinical experience, the effective dosage of normal 60 kilogram adult was to take 96 gram per day of Shuyusan, so the rat of 200 gram would take Shuyusan 0.32 gram per day. The rats started accepting the above treatments in the 21 days and the rats in treatment groups were continuously administered with the drugs through gastric perfusion for 21 days. All rats were included in the final analysis. Rat CRH, ACTH, and CORT ELISA kit (R&D, United States), GR primary antibody kit (Santa Cruz), low temperature for high-speed centrifuge (Sigma, USA), inverted microscope (OLYMPUS Japan), microplate reader (TECAN, Switzerland), homemade open boxes, and so forth.

2.3。抑郁症慢性不可预知的轻微压力模型(和)

采用慢性不可预知的轻微的抑郁压力(和)和改进。正常对照组是住五鼠笼和节食,喝的水,没有任何刺激。模型组大鼠喂过一个为每个笼子里并得到了21天的压力刺激,包含水不足(24小时),禁食(24小时),夹紧尾巴(1分钟),电击脚(20 v, 10秒/时间,1分钟),迫使在冰水游泳(4°C, 4分钟),倾斜的笼子里(45°C, 12 h),转换的昼夜节律,制动(2 h)和热刺激(40°C, 5分钟),每天随机抽取1 - 2种刺激,每个刺激重复2 - 3次。

2.4。ELISA分析CRH、ACTH和CORT

实验周期结束后,所有大鼠腹腔注射麻醉的10%水合氯醛(3毫升/公斤),暴露心脏,通过升主动脉灌注冲洗0.9%生理盐水(37°C, 250毫升)和灌注4%多聚甲醛溶液(4°C, PH = 7.4, 200毫升),直到四肢僵硬的动物。最后,大脑被移除和修复块,存储在聚甲醛10%解决方案。脑组织的组织添加适量的盐水和土豆泥,离心10分钟(3000 rpm),以及得到的上层清液。然后我们把酶联免疫试剂盒(CORT) CRH、ACTH和4°C冰箱和协调到室温,反应板,分别设置空白井(空白对比井没有添加样本和HRP-conjugate试剂,其他每一步操作一样)。样品测试:我们添加了样本稀释40L测试样本,然后添加测试样本10L(样品最终稀释5倍),添加样本井,并没有碰墙尽可能轻轻混合。封闭板封板膜后,我们孵化为30分钟37°C,然后发现封板膜,废弃液体,干的秋千,洗缓冲区添加到每一个,还是30年代排水,重复5次,拍干。然后添加HRP-conjugate试剂50L之间,除了空白;添加50发色体解决方案L和发色体解决方案B,避光保存15分钟37°C;停止解决方案添加50L之间;停止反应。我们把空白以及零,在450 nm读吸光度后15分钟内停止解决方案和补充道。最后,我们检测到的浓度标准曲线根据OD值的样本。

2.5。绝望的行为研究

开放田地测试:一种开放田地的方法被用来在所有组大鼠进行praxeological得分。开放田地设备是用不透明的材料和76厘米×76厘米广场,位于底部,它也同样分为25个等边广场。有一堵墙,45厘米的高度。老鼠在中心广场,然后测量数字老鼠穿过广场3分钟(只有老鼠进入四英尺的正方形可以编号的分数水平活动)和《纽约时报》站在后肢被观察到。每个老鼠三分钟测量一次,将由两个观察员和平均值得分。时间比例在这个中心区域被认为是指示性的探索行为和可能反映了降低焦虑,尽管这个参数不敏感的所有抗焦虑药,不得模型焦虑症的某些特性16,17]。

强迫游泳测试(置)
强迫游泳测试被用于所有组,根据Porsolt的方法(18]。老鼠被放置在一个开放的圆柱形容器(直径10厘米,高25厘米),包含15厘米的水在25±1°C。观察到静止的时间被记录在最后4分钟的6分钟测试时期(19,20.]。老鼠被迫游泳在受限空间中,他们无法逃脱,诱导静止的行为特征。观察到静止的时间被记录在最后4分钟的6分钟测试。当老鼠停止挣扎,仍漂浮在水中一动不动,他们被认为是固定的。降低浮置板轨道是在静止的时间作为衡量抗抑郁药活动。

尾部测试(TST)
静止时间的持续时间由尾部测量根据Steru的方法(21]。老鼠的听觉上和视觉上孤立被胶带上地板上放置约1厘米从尾巴的尖端。结核菌素是量化的保持时间6分钟。老鼠被认为只有当他们无法挂被动和完全不动。

2.6。GR-Receptor决心

内源性过氧化物酶灭活与3% H₂O₂。部分被封锁在10%正常山羊血清37°C 30分钟,添加主要抗体在4°C一夜之间,并与PBS洗。积极染色细胞的平均光密度分析了上面的切片获得使用图像-图像Pro软件(美国马里兰州贝塞斯达媒体控制论)免疫组化阳性细胞和集成光密度分析(积分光密度,IOD)。三片从每组选择的分析。对于每一个切片,来自三个不同地区的三张图片,额叶皮层的五层四层,区域海马的CA1(600嗯远离中线的起点A1区)和海马CA3区域(点海马把顶部区域),评估在200 x物镜。

2.7。统计分析

所有计算结果意味着±SEM。用于比较组间方差分析。如果P值小于0.05,被认为是具有统计学意义的差异。我们使用测试同质性检查数据:如果数据是均匀的,我们进行方差分析(ANOVA)直接在数据上。两组之间,我们使用LSD法比较任何差异。否则,我们改变了参数,然后再次测试用于同质性。我们只对数据进行方差分析后变得均匀变化的参数。使用SPSS统计分析都是由Windows (SPSS Inc .)。

3所示。结果

3.1。开放田地测试

开放田地测试报告的结果在图1。它显示了观察老鼠的活动(水平、垂直)。间没有显著差异在建模之前组(,)。建模后,发现有重大变化在开放田地测试在这些组。3周后美联储草药治疗高剂量药草和氟西汀,静止时间显著增加,与模型组相比(高剂量组和模型组,;氟西汀组与模型组,)。

3.2。在每组置

置的结果在图2。间没有显著差异在建模之前组(,)。建模后,观察到有显著延长固定时间在这些组。3周后美联储草药治疗高剂量药草和氟西汀,静止时间显著增加,与模型组相比(高剂量组和模型组,;氟西汀组与模型组,)。

3.3。每组的测试

池执行所有的测试,测试的结果在图3。建模组间(之前没有显著差异,)。建模后,观察到有显著延长固定时间在这些组。高剂量Shuyusan药草也可以减少测试的不动时间。高剂量的草药和氟西汀治疗3周后,静止时间显著增加,与模型组相比(高剂量组和模型组,;氟西汀组与模型组,)。

3.4。测定血清CRH水平内容、ACTH和CORT

图4显示了血清CRH水平变化内容,ACTH、CORT每组治疗后。模组的血清含量水平显著增加,CRH ACTH、CORT (CRH:模型组和正常组,;ACTH:模型组和正常组,;CORT:模型组和正常组,)。3周美联储草药治疗后,血清CRH水平,内容ACTH、CORT高剂量组明显降低,与模型组相比(CRH:高剂量组和模型组,;ACTH:高剂量组和模型组,;CORT:高剂量组和模型组,)。尽管血清CRH水平内容、ACTH和CORT减少低剂量组和氟西汀组,模型组相比无显著性差异。

3.5。GR表达受体大鼠海马

数据5,6,7显示GR-receptor-positive细胞的数量在每组大鼠的海马。GR-receptor积极每组大鼠的海马细胞GR的变化为慢性不可预知的轻微的压力主要体现在海马的CA1和CA3区域(CA3区域更为突出)。GR-positive-cells正常组排成密集,海马的结构,分布在正常。模型大鼠的免疫反应在海马显著减少,GR-positive细胞排列松散,和更少的结构。GR-receptor-positive细胞的数量明显减少相比模式组(CA1区:模型组和正常组,;CA3区:模型组和正常组,)。GR-receptor-positive细胞的数量比模型组显著增加在CA1和CA3区域区域(CA1区:高剂量组和模型组,;CA3区:高剂量组和模型组,)。中等剂量组、低剂量组和氟西汀组都有增加趋势的内容阳性细胞的数量和IOD,但没有显著差异。

4所示。讨论

行为研究中扮演重要角色的评价抗抑郁活性效应(22]。强迫游泳和尾悬挂测试行为绝望测试,它是有用的为探索抑郁症的病理机制和抗抑郁药物的评价23]。置和结核菌素被广泛用作抗抑郁药物的临床前检测工具(24,25]。鼠行为得分的特征在两种测试称为静止,这反映了人类的行为绝望如抑郁症(26]。静止的时间被困在老鼠和强迫游泳无助密切相关。从我们的结果观察,有显著延长固定时间在这些群体建模;与高剂量中药Shuyusan管理,固定时间显著增加。它表明Shuyusan在生产重要的抗抑郁活性效应,当评估置和结核菌素。根据传统中医理论,以及从现代科学研究成果和临床试验,Shuyusan展品治疗对抑郁症的影响通过净化心热,解决痰,气、血、津液和规范。以前的动物研究显示抗抑郁作用的Shuyusan基于行为改善抑郁大鼠模型(11,13]。

许多研究表明,抑郁心理有关,neuron-endocrine障碍,单胺神经递质失衡,海马神经发生障碍,和许多其他因素27- - - - - -30.]。长期压力和糖皮质激素水平升高含铅的出现情绪障碍(31日]。类固醇激素可以通过多种机制调节神经传输。海马体富含糖皮质激素受体,这个区域的神经元可以受到高水平的糖皮质激素;在抑郁症的发病机理研究中,HPA轴响应压力成为焦点(32,33]。旁边单胺神经递质,血清CRH水平,CORT、ACTH和GR水平变化被用来评估抑郁症(24- - - - - -26]。压力是外部环境刺激的影响下,可以唤醒相对应的内部心理;这种反应发生在神经系统和内分泌系统(34,35]。HPA多动症是大萧条的主要pathology-physiological因素,连续CORT结合GR超表达的增加在海马体损伤海马和蓝斑,所以导致海马神经元的萎缩和细胞凋亡36,37]。此外,多动症HPA轴的压力抑制了GR,回到基线水平。GR减少受损后的效果,HPA轴更活跃,形成一个恶性循环38]。另一方面,作为HPA轴的多动,5 -内容受到抑制。的高浓度CORT可以诱导肝脏产生色氨酸吡咯酶,它可以degradate血液中的色氨酸。色氨酸的前身是5日,它的减少可能导致合成5日,所以导致大脑5 -内容减少,造成抑郁症状(39,40]。在生理条件下,CRH分泌和ACTH受5日系统。应力状态,HPA轴功能变得活跃和5 -合成显著减少由于缺乏色氨酸运入中枢神经系统(41- - - - - -43]。从目前的研究结果表明,Shuyusan可以降低血清CRH的内容,ACTH、CORT。它也可能增加海马GR表达的受体大鼠抑郁模型。我们的研究结果表明,Shuyusan的作用机制是由于CRH水平,降低血清内容ACTH、CORT和增加海马GR受体的表达。氟西汀是选择性5 -羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)药物,它可以增加NE、5 -,和DA大鼠的大脑和5的差别有关对这些受体,但不降低血清CRH水平,内容ACTH、CORT和增加海马GR受体的表达。

慢性应激抑郁模型是一种有效的模型为研究抑郁和已广泛应用于基础研究和药物筛选的抑郁症(44,45]。该模型可以模拟抑郁症的核心症状,也就是说,失去兴趣,快感缺乏,降低的探索能力和性行为。事实上,无助和快感缺乏是抑郁症的核心症状,只模仿快感缺乏大多数当前的模型。目前慢性温和应激模型可能是最有效和最广泛使用的抑郁症的动物模型。目前,浮置板轨道是应用最广泛的工具在抑郁症研究[45]。实验表明,在强迫游泳不动时间延长。证明了抑郁症的复制模型老鼠成功。

总之,我们的数据显示,大剂量草药Shuyusan对慢性应激抑郁模型大鼠抗抑郁活性的影响。与模型组相比,行为指标改善。我们发现CRH、ACTH和海马的CORT血清和GR表达水平高剂量的草药Shuyusan组均明显改善,与模型组相比,ELISA和免疫组织化学方法。因此,我们证实Shuyusan具有抗抑郁活性作用,其机制可能与减少糖皮质激素水平的活动,调节HPA轴的功能,抑制海马糖皮质激素受体的表达。

作者的贡献

这项研究的构思和设计的指导下l .陈负责资金从l . Chen z太阳和提供数据支持,问:智。耿m . m . Chen f . Wang, h . Chen和d段参与研究的概念和设计,数据分析,和纸稿。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

伦理批准

实验动物伦理委员会批准,中国人民解放军总医院中国。

承认

军事科技研究基金在第十二个五年计划期间,中国人民解放军,没有。CWS11J067。