文摘
卒中后痴呆常发生中风后,其发病机制有关β淀粉样蛋白生产和细胞凋亡。本研究评估吸附的影响,从中药酚类植物化学物质的分离牡丹安德鲁斯(MC),从记忆丧失保护缺血性中风后亚急性阶段。大鼠大脑中动脉闭塞受到瞬态(tMCAo)缺血10分钟。数据显示,芍药醇回收的分步检索延迟测试tMCAo后七天,但没有改善神经赤字tMCAo引起的。淀粉样前体蛋白(APP)——和测试网站应用裂开酶(确定新基点;β分泌酶)免疫反应性的细胞,和终端原位dUTP-biotin缺口末端标记(TUNEL)阳性细胞减少paeonol-administered组。免疫印迹显示线粒体的伯灵顿蛋白质水平降低和凋亡诱导因子(AIF)后细胞溶质芍药醇治疗。总之,我们推测,芍药醇保护内存缺血性中风后通过减少应用程序,确定新基点和细胞凋亡。压制的伯灵顿和阻塞AIF的释放到胞质可能参与芍药醇提供的抗凋亡。
1。介绍
认知障碍是常见的后遗症后中风和老年痴呆症的第二大原因,在阿尔茨海默病(1,2]。大多数中风幸存者遭受各种认知障碍,包括老年痴呆症(存在于25%的中风患者),与残疾,可怜的功能结果,和生活的不满3]。与最近的改善中风的治疗,存活率增加,预防和治疗卒中后血管性认知障碍和血管性痴呆已成为越来越重要的(3]。
虽然有差异的原因的疾病,卒中后痴呆股票共同机制与阿尔茨海默氏症,包括增加β淀粉样蛋白生产和τ蛋白磷酸化(4,5]。缺血性事件后,淀粉样前体蛋白(APP)的表达上调β大脑中的淀粉样蛋白寡聚物的细胞外空间6- - - - - -8,淀粉样前体蛋白产量增加在星形胶质细胞(9]。然后,之间的交互β淀粉样蛋白和几个因素,包括载脂蛋白、presenilinsτ蛋白,α-核蛋白、炎症因子和大脑中的神经元生存/死亡的决定,导致缺血性脑退化,导致白质损伤和神经元细胞死亡(5,7]。除了坏死细胞死亡发生在几分钟内,神经元死亡(包括细胞凋亡)开始的几个小时后缺血性中风和持续好几天10]。治疗可挽救缺血半影的神经元细胞凋亡可能改善缺血性中风后患者的结果(11]。
芍药醇(2′-hydroxy-4′-methoxyacetophenone)是一种酚醛从中草药植物化学物质隔离牡丹安德鲁斯(MC),并被广泛使用作为营养补充剂在中国医学公式在北京第三最高销量在2007年和2009年期间(12]。在动物研究中,芍药醇减毒引起的神经毒性和改善认知障碍d-galactose [13]。目前集团曾表明,芍药醇减少梗死面积在短暂性大脑中动脉闭塞(tMCAo)大鼠模型(14]。也减毒细胞氧化应激的应用表达模式15]。
调查的有效性芍药醇在卒中后的内存保护,tMCAo的老鼠模型使用。神经状态和内存测试tMCAo后七天。水平的应用,测试网站应用裂开酶(确定新基点),和脑组织细胞凋亡进行评估。然后,蛋白质的水平参与凋亡的内在和外在途径也被测量。缺血性中风后的数据表明,芍药醇保护内存通过减少应用程序,确定新基点和细胞凋亡。抑制线粒体伯灵顿和胞质如果可能也参与到保护作用。
2。材料和方法
2.1。动物和化学物质
所有试验程序进行成年男性Sprague-Dawley老鼠,重300 - 350克,按照批准的指导方针由实验动物保健和使用委员会中国医科大学。采取了足够的措施来减少动物的疼痛或不适。老鼠被安置在明暗- (12 h / 12 h)和房间温度控制条件。
吸附分离和纯化的根树皮牡丹如前所述(14]。刚做好的芍药醇溶解在四甘醇和稀释在磷酸盐(PBS;137毫米氯化钠,1.4毫米KH2阿宝4,4.3毫米Na2HPO42.7毫米氯化钾,pH值7.2)达成最终的浓度2毫克/毫升的5%解决方案在PBS四甘醇。水合氯醛(默克公司,达姆施塔特,德国)溶解在水中,股票400毫克/毫升的浓度。
2.2。阻塞模型
缺血诱导是通过管腔内的缝合的阻塞大脑中动脉(MCA)如前所述16]。简单地说,老鼠与水合氯醛麻醉(400毫克/公斤,i.p)。右颈总动脉(CCA)和颈内动脉(ICA)是通过颈部中线切口暴露。pterygopalatine动脉结扎接近它的起源。3/0尼龙长丝缝合、钝化在火焰和涂有poly-L-lysine(美国σ),从右颈外动脉通过先进的CCA和ICA 20到25毫米的距离阻止MCA的起源。缺血10分钟后,尼龙缝线被允许再灌注。
2.3。分组和实验
共有36个老鼠被随机分为三组:芍药醇组、汽车集团和虚假的组。老鼠在芍药醇组pre-administered芍药醇引入tMCAo之前一个小时。一剂20毫克/公斤(i.p)。根据我们之前的研究中,选择显示,20毫克/公斤的芍药醇表现出最好的神经保护作用[14]。缺血10分钟后,老鼠接受再灌注。汽车组的老鼠受到芍药醇组的老鼠一样的过程,但PBS是管理,而不是芍药醇。老鼠在虚假的组接受相同的过程作为汽车组的老鼠,但MCA的起源并没有阻挡。
tMCAo前有一天,老鼠接受习惯被动回避试验和培训。1小时前tMCAo、老鼠接受保留审判。tMCAo 24小时后,测量的神经状态。第二个保留神经状态进行试验和评估tMCAo后的第七天。老鼠被牺牲为西方墨点法和终端原位dUTP-biotin尼克结束标记(TUNEL)和免疫组织化学染色(包含IHC)。
2.4。测量神经状态
每个老鼠的神经状态测量,使用改进后的神经严重程度得分,再灌注后24小时内,由调查员盲目治疗组。运动、感觉、平衡和反射功能评估基于神经功能缺损评分(比例尺度)所描述的陈et al。17]。短暂,电机测试包括将老鼠在地板上(不能走直线得分为1,绕向轻瘫的边被列为2,和跌落到轻瘫的得分为3),提高每个老鼠的尾巴(前肢得分为1的弯曲,弯曲的后肢得分为1,和头部移动> 10°得分为1),感官测试包括触觉(不足,1)和推爪边(不足,1)单项成绩表。平衡梁的能力得分如下:老鼠抓住的梁上,1;拥抱的梁和一个肢体滑梁、2;拥抱了梁的梁和两个四肢下滑,3;试图平衡但跌落(> 40岁),4;试图平衡但跌落(< 20岁),5;掉梁没有任何试图平衡,6。反射测试包括耳廓反射(不足,1),角膜反射(不足,1),和惊吓反射子(不足,1)。异常运动得分(发作,1)。
2.5。被动回避试验
避免被动装置由两院组成相同的大小(厘米高)通过一个连接断头台门(9×7厘米)。每个室的地板是由14个不锈钢棒(直径6毫米),间隔1.8厘米中心,连接到一个冲击扰频器(双子座规避系统,圣地亚哥仪器,圣地亚哥,美国)。习惯化的老鼠被放置在正确的仪器室,5秒后,家里灯打开,断头台的门。进入黑暗的商会,断头台的门被关闭,30秒后,老鼠被从黑暗的房间,放在家里的笼子里。入口延迟到暗舱记录当动物把所有四个爪子黑室。如果动物等超过100秒进入黑室,这是消除实验。习惯化是重复30分钟后,相同的间隔训练。在训练了断头台的门是关闭的,断断续续电击(50赫兹,3 s, 0.5 mA)立即被送到黑室的地板在动物进入黑暗的房间。30秒后,老鼠从黑暗的房间,放在笼子里。2分钟后,反复训练。 The rat received a footshock each time it reentered the dark. Training was terminated when the rat remained in the light compartment for 120 sec. The numbers of trials (entering the dark chamber) were recorded. The retention trial was performed 24 hours and seven days after tMCAo. After the house light was on and the guillotine door was open, the step-through latency (STL) into the dark chamber was recorded for up to 300 sec. If the rat did not enter the dark chamber after 300 sec, the retention trial was terminated and a ceiling score of 300 sec was assigned.
2.6。包含IHC检测
我和TUNEL染色,老鼠和200毫升0.9%的生理盐水灌注transcardially 200毫升4%的多聚甲醛(PFA, pH值7.4)。老鼠的大脑被迅速和后缀在4% PFA其次是30%蔗糖(wt /卷)三天,然后切成15μ部分使用低温恒温器。大脑部分与杜尔贝科冲洗的磷酸盐(美国σDPBS)包含0.01% Tween-20和沉浸在3% H2O2/甲醇15分钟抑制内源性过氧化物酶活性。此后,部分与10%正常孵化动物血清(酶、钙、美国)在室温下20分钟。主要的部分在潮湿的孵化室anti-APP(1: 100稀释,鼠标单克隆,22 c11 Chemicon, Billerica,妈,美国)和anti-BACE(1: 100稀释,Chemicon)一小时在37°C。与二次抗体和avidine-biotin孵化后过氧化物酶复杂(ABC工具包,酶、钙、美国)部分是使用3色,3′-diaminobenzidine (DAB)工具包(Scytek实验室、洛根、U。美国T),然后用苏木精复染色。彩色部分是安装在安装媒体(Assistant-Histokitt、德国)和免疫反应性的细胞在显微镜下计算(Axioskop 40,蔡司)。免疫反应性的细胞数连续9个大功率领域(HPFs分区)沿着CA1区和九个高通滤波器在广场的MCA领土皮层(图3(一个))。负控制污渍进行相邻部分在对照组和受到相同的包含IHC检测程序,但是没有主要抗体。
2.7。TUNEL分析
TUNEL染色按照制造商的指示进行的商业工具(默克公司,达姆施塔特,德国)与核DNA识别细胞碎片。短暂,大脑部分,选择相邻的那些用于包含IHC孵化与蛋白酶K (20μg / mL) 20分钟,然后用1 x孵化的负平衡缓冲在室温下为30分钟,其次是孵化与负标签反应混合物为1.5 h在37°C。添加解决方案和阻止缓冲区后,部分被孵化与共轭解30分钟在室温和TUNEL阳性细胞可视化使用涂抹工具。最后,部分与甲基绿复染色。
2.8。免疫印迹分析
西方墨点法,老鼠麻醉使用合唱水合物和灌注transcardially 400毫升0.9%的生理盐水。大脑被移除,所以分段−4.3 + 1.7毫米前囱,分为正确的皮质纹状体,左皮层和纹状体。正确的皮层称重和胞质和线粒体蛋白质分离使用商业套装(美国BioVision山景,CA)。胞质和线粒体的蛋白浓度分数使用Bio-Rad试验测定。蛋白质提取(10μg)然后分开使用10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳,转移到硝化纤维膜,与抗体探测,发现使用peroxidase-conjugated anti-rabbit抗体紧随其后的是化学发光如前所述[18]。对肌动蛋白抗体(稀释1:5000)从Chemicon购买。抗体细胞色素c(1: 1000稀释),伯灵顿(1:1000稀释),b细胞白血病/ lymphoma-2 (bcl - 2)(1: 1000稀释)和肿瘤坏死因子受体类型1-associated死域(TRADD)(1: 1000稀释)购买的细胞信号(美国贝弗利,MA)。抗体凋亡诱导因子(AIF)(1: 100稀释)和Fas-associated死域(FADD)(1: 1000稀释)从Calbiochem购买(美国圣地亚哥,CA),抗体裂解caspase-8(1: 1000稀释)从BioVision购买(美国加利福尼亚州山景城),这对Cox4(1: 5000)是购自Abcam(美国Cambridge, MA)。乐队在凝胶的强度计算Gel-Pro分析仪(媒体控制论Inc .,马里兰州贝塞斯达,美国)。
2.9。统计分析
数据表示为平均数±标准差。虚假的数据、车辆和芍药醇组比较使用单向方差分析后跟posthoc菸害的测试。一个概率小于0.05被认为是具有统计学意义的价值。
3所示。结果
3.1。芍药醇对神经系统的影响赤字tMCAo引起的
有三组大鼠:假的,车辆,芍药醇。车辆和芍药醇组大鼠通过10分钟收到tMCAo MCA闭塞,而老鼠在假针灸组一个虚假的操作。老鼠在芍药醇组pre-administered芍药醇tMCAo之前一个小时。tMCAo 24小时后,车辆和芍药醇组大鼠神经赤字的(范围6 - 8)分别(范围,5 - 8)。七天后tMACo神经功能缺损评分在汽车集团和芍药醇组。没有显著差异的神经功能缺损评分之间的车辆和芍药醇组24小时或7天后tMCAo(图1)。
3.2。影响吸附在STL被动回避试验
被动回避试验,老鼠震惊为了训练他们避免进入黑暗室tMCAo前24小时。保留的性能试验前tMCAo确保了老鼠记得冲击从原来的24小时。然后,重复的保留试验后七天tMCAo测试如果老鼠记得冲击一个星期以前。STL数据显示,到黑室显著短于对照组比虚假的组tMCAo后七天。芍药醇预处理明显逆转的减少引起的STL tMCAo ()(图2)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.3。芍药醇减少的表达应用和确定新基点缺血性脑tMCAo后七天
包含IHC染色评估应用,BACE-expressing细胞在大脑的虚线区域内冠状部分(图3(一个))。tMCAo后七天,虚假的集团提出了最小的应用和确定新基点免疫反应性。海马的CA1区和MCA领土的皮质汽车集团演示了应用免疫反应性增加。芍药醇组的老鼠显示较小的增加在CA1和应用免疫反应性皮质比汽车集团(图3 (b), 3 (c), 3 (d)和3 (e))。tMCAo诱导增加MCA BACE-immunoreactive细胞数量的皮质区域的领土。然而,芍药醇组证明减少确定新基点免疫反应性(数据4(一)和4 (b))。CA1区包含没有虚假的免疫反应性的细胞环境,车辆,和芍药醇组。这些数据表明,芍药醇抑制tMCAo-induced应用在CA1和皮层和还在大脑皮层抑制表达环境。
(一)
(b)
3.4。tMCAo后七天芍药醇对细胞凋亡的影响
TUNEL染色检测到凋亡细胞tMCAo后七天。没有TUNEL-positive细胞皮质区域虚假的组(数字5(一个)和5 (b))。TUNEL-positive细胞的数量MCA领土的皮质区域车辆组显著增加tMCAo后七天。相比之下,芍药醇组的人表现出显著的减少TUNEL-positive细胞相比汽车组。细胞计数表明,芍药醇TUNEL-positive细胞的数量减少到52.3%(图5 (b))。没有TUNEL-positive CA1区细胞骗局,车辆,或芍药醇组。
(一)
(b)
确定吸附的可能途径可能参与抑制细胞凋亡,本研究从缺血皮层中提取胞质和线粒体蛋白进行免疫印迹分析。apoptosis-related蛋白的检查,tMCAo AIF增加了超过两个线粒体和胞质分数。芍药醇抑制细胞溶质AIF的增加。在线粒体,AIF蛋白水平在芍药醇组没有不同于那些在汽车集团。tMCAo诱导3.74倍增加线粒体伯灵顿蛋白质而芍药醇治疗减少了诱导伯灵顿其基线值的1.62倍。管理芍药醇并没有改变胞质bcl - 2、Bax、细胞色素c, caspase-8, FADD、TRADD bcl - 2蛋白水平,也没有修改线粒体和细胞色素c(图6)。
4所示。讨论
基于先前的研究发现,芍药醇改善认知功能和抑制应用表达式(13,15),目前的研究调查了芍药醇的潜在记忆脑缺血大鼠模型中的保护作用。数据表明,芍药醇保护内存在亚急性阶段tMCAo后七天。包括减少的可能的分子机制β淀粉样蛋白水平和细胞凋亡的抑制。过程还发现了伯灵顿,如果关键分子抑制凋亡过程中芍药醇。
之前的研究已经发现,芍药醇施加保护神经的影响,减少梗死面积在脑动脉阻塞和脑缺血再灌注模型17,19,20.]。芍药醇对神经损伤的保护以前归因于其抗氧化活动。在一项研究中,芍药醇增加超氧化物歧化酶、谷胱甘肽活动(13]。在另一项研究中,芍药醇的氢peroxide-induced转录因子NF -κB (15),这是高度相关的缺血性中风后的炎症过程(21]。钟山等人也将改善d-galactose引起的认知障碍,产生超氧化物阴离子和oxygen-derived自由基,抗氧化能力提供的芍药醇(13]。
在这项研究中,芍药醇没有显著影响神经赤字第一或再灌注后第七天,冲突与我们先前的研究表明芍药醇降低神经功能缺损评分。不一致可能来自不同的神经赤字产生的不同缺血时间在这两项研究。在之前的研究中,老鼠接受tMCAo了MCA再灌注前90分钟,产生严重的损伤与神经功能缺损评分超过13 (14,20.];然而,老鼠几乎存活时间超过48小时。在这项研究中,为了在缺血性中风的亚急性阶段检查内存,我们放弃了严重赤字模型和采用适度赤字模型为10分钟,阻塞血液流动产生的神经功能缺损评分(范围,6 - 8)。我们提出,这是因为神经赤字分数较小的比,在我们前一个在这项研究中,数据不能显示统计学意义,甚至意味着芍药醇组神经功能缺损评分较低。尽管芍药醇并未显著保护神经功能在这个模型中,芍药醇在STL逆转tMCAo-induced减少被动回避检索测试,表明芍药醇保护脑缺血后的记忆。
在以前的研究中,芍药醇提高学习能力和增强D-gal-injured大脑内存,使用莫里斯水迷宫测试和被动回避试验(13]。芍药醇也改变了学习后大鼠的行为β淀粉样蛋白注射液(22]。Amyloidopathy是卒中后痴呆发病的主要机制之一。之前的调查观察upregulation应用和β淀粉样蛋白在脑缺血后,主要在海马CA1区星形胶质细胞(23- - - - - -25),和皮质和胼胝体缺血再灌注1到4周后,导致密集plaque-like形成后九个月跟踪(4]。本研究观察到的应用程序增加海马和皮质tMCAo七天后,和衰减这两个地区的应用增加芍药醇治疗。然而,应用程序在中枢神经系统的作用还存在争议。应用产品之一是有害的β淀粉样蛋白,而另一个应用程序产品,酸式焦磷酸钠α、可能参与神经保护、突触可塑性、神经突产物,和突触发生26]。增加应用表达也可能参与保护内质网应激(27]。根据我们的数据,我们推测,应用的关键因素不是tMCAo神经损伤7天后,因为没有细胞凋亡和梗死在海马体(数据未显示),甚至在同一地区应用水平上调。另一方面,确定新基点的coinduction和colocalization细胞凋亡在皮层tMCAo后建议确定新基点比应用发挥了更多的有害作用。
裂开的三种蛋白酶应用程序生成β淀粉样蛋白是α- - - - - -,β- - - - - -,γ分泌酶(28]。在三个分泌酶,确定新基点coexpresses最高β淀粉样蛋白(29日,30.),并控制病原反应步骤的生产β淀粉样蛋白(31日]。确定新基点和之间的高相关β淀粉样蛋白呈现确定新基点考虑治疗的有效治疗靶点之一β-amyloid-related疾病(32,33]。在以前的研究中,局灶性缺血确定新基点的活动增加,尤其是BACE1缺血皮层(7)、丘脑(34]。与先前的研究一致温家宝et al。(7),本研究观察确定新基点诱导和细胞凋亡发生在相同的位置,也就是说,缺血皮层,表明高相关性的确定新基点和细胞凋亡在缺血性中风。芍药醇治疗有限确定新基点的诱导和抑制细胞凋亡,表明抑制β淀粉样蛋白生产芍药醇可能密切联系抑制细胞凋亡,并可能参与脑缺血后的内存保护。
脑缺血后细胞凋亡发生在CA1脑缺血后三天内,七天之后就消失了,不重新出现后7天(35,36]。在目前的研究中,细胞凋亡在缺血皮层观察到,但不是在CA1区,tMCAo后七天。细胞凋亡的抑制缺血皮层表明芍药醇从tMCAo神经细胞损伤的保护。在最近的研究中,芍药醇也被证实可以抑制glutamate-induced PC12细胞凋亡(37)在大鼠大脑接收β淀粉样蛋白注射液(22),而细胞凋亡的具体机制与抑制神经细胞尚未确定。脑缺血后细胞凋亡的一般途径有两种:内在和外在途径。的内在途径是由细胞内的积累能源耗尽后缺血后(10]。钙蛋白酶的激活导致裂开的bcl - 2相互作用域(投标)截短形式(tBID),目标外线粒体膜和诱发proapoptotic蛋白质构象变化,如贝克,伯灵顿,不好,Bcl-XS。这些pro-apoptotic蛋白还可以与凋亡heterdimerise蛋白质,包括bcl - 2或Bcl-XL [38]。绑定的tBID pro-apoptotic打开线粒体蛋白质过渡孔,导致细胞色素c的释放,如果到胞质(39]。一旦从线粒体释放,细胞色素c结合并激活caspase-9,然后caspase-3,劈开的聚(ADP-ribose)聚合酶(PARP),导致DNA损伤和caspase-dependent凋亡细胞死亡(40]。胞质如果进一步把原子核和刺激caspase-independent DNA碎片(41]。外在途径从激活的细胞表面Fas和肿瘤坏死受体。Fas受体触发FADD直接和肿瘤坏死受体触发FADD通过TRADD激活caspase-8,然后caspase-3,导致PARP乳沟和DNA损伤(42]。本研究首次确定伯灵顿,如果两个芍药醇可以调整的主要分子被吸附在脑缺血后细胞凋亡的抑制。
伯灵顿的降低芍药醇表明芍药醇可能抑制细胞凋亡,抑制线粒体因子的释放到胞质。同时抑制胞质AIF支持这一假设。然而,细胞色素c水平没有明显改变了芍药醇,虽然细胞色素c的平均值较低芍药醇组(虚假的0.89倍),在汽车集团(虚假的1.29倍)。我们提出,细胞色素c的小改进降低了统计学意义。朱等人的报告描述,脑缺血后,如果表现在男性大脑的神经元更为明显,而女性大脑神经元表现出显著增加表达caspase-3 [43]。目前研究雄性老鼠诱导细胞溶质高架AIF的2.47倍,这是逆转几乎基线水平。只有少数草本植物来调节AIF的表达。Isatis indigotica(44]和polyphyllin D [45]从线粒体释放如果增加,导致细胞凋亡,而小檗碱抑制AIF因此抑制细胞凋亡(46]。
药用植物提取物和天然抗氧化剂可能有潜在的使用在痴呆的预防和治疗2,47]。从目前的研究结果表明,芍药醇,这源于一种广泛管理草药,保护脑缺血后的记忆。芍药醇治疗减少了应用程序和确定新基点表达,凋亡细胞的数量。抑制水平的伯灵顿蛋白质和阻止如果释放到胞质也可能是芍药醇对它施加影响抗凋亡的机制和内存保护。
缩写
| 如果: | 凋亡诱导因子 |
| 应用: | 淀粉样前体蛋白 |
| 确定新基点: | 测试网站应用裂开酶 |
| bcl - 2: | b细胞白血病/ lymphoma-2 |
| CCA: | 颈总动脉 |
| 轻拍: | 3、3′-Diaminobenzidine |
| 高通滤波器: | 高功率领域 |
| ICA: | 颈内动脉 |
| 包含IHC: | 免疫组织化学 |
| MCA: | 大脑中动脉 |
| tMCAo: | 短暂性大脑中动脉闭塞 |
| PBS: | 磷酸盐 |
| STL: | 分步延迟 |
| TUNEL: | 终端原位dUTP-biotin尼克结束标签。 |
确认
本研究由中国医科大学医院的支持,台湾(dmr - 99 - 002),部分台湾卫生部临床试验和研究卓越中心(doh101 - td - b - 111 - 004)。