红车轴草和红车轴草提取物对雌激素缺乏所致骨质疏松大鼠发育的影响

摘要

一些植物种类属于三叶草L.属是被认为是施用植物雌激素活动的异黄酮的来源。本研究的目的是检查从空中部位获得的标准化提取物的影响Trifolium介质的提取物三叶草pratenseL.关于大鼠雌激素缺乏诱导的骨质疏松症的发展。这两个三叶草取去卵巢(OVX)大鼠口服异黄酮苷元10、20 mg/kg或雌二醇0.2 mg/kg，连续4周。研究血清骨转换指标、骨量、矿化和力学性能。OVX对照组大鼠胫骨干骺端和股骨颈的力学性能较假手术对照组明显恶化，而股骨骨干的力学性能未受影响。雌二醇抑制了胫骨强度的恶化和骨转换标志物的增加。两种提取物均显著增加股骨骨干的强度和骨矿物质中钙和磷的含量，但只是T. Praatense.提取提高胫骨膜化妆品的强度。总之，两者的效果三叶草提取物与雌二醇的提取物不同。除异黄酮提取物成分之外可能导致其骨骼效应。

1.介绍

植物雌激素是具有雌激素活性的植物源性物质，与雌激素受体结合，可发挥激动、拮抗或部分激动/拮抗作用[1］.它们有时被认为是自然选择性雌激素受体调节剂（SERMS）;然而，植物雌激素和SERMS的作用之间只有薄弱的关联[2］.由于激素替代疗法的副作用，人们有兴趣使用植物雌激素来缓解更年期症状，包括骨质疏松症的发展。人们普遍认为雌激素缺乏会导致绝经后妇女的骨质疏松症。

红三叶草(三叶草pratense是植物雌激素异黄酮的知名来源。主要含有刺芒柄花素和鹰嘴豆素A，以及少量的大豆黄酮和染料木素，主要以糖苷形式存在[3.，4］.

虽然在5次临床试验的META分析中证明了红色三叶草提取物在预防血管运动症状中的一些疗效[5]，最近两者都缺乏影响[6，7及有利的效果[8]据报道。关于心血管、乳腺、子宫内膜和泌尿生殖健康以及骨骼健康的长期影响的数据要少得多[9］.缺乏显着影响的临床报告[10.，11.，并产生一些有利的影响[12.，13.红三叶草提取物对骨骼系统的影响。然而，红三叶草提取物对骨骼的有益作用已在实验环境中得到证实[14.- - - - - -16.］.

此前，Zgórka [17.]揭示了干燥的，地上部分的之字形三叶草(Trifolium介质l .)可能构成相当新的和丰富的异黄酮类植物雌激素(尤其是芒柄花黄素和biochanin)。总含量的糖苷配基形式的异黄酮(本地和释放苷的水解),计算出这个物种,大约是3倍高于红三叶草和类似大豆的大量报道。

T.媒体是豆科多年生根茎植物。它的俗名是之字形三叶草，因为向上的茎倾向于以之字形(弯曲)的方式生长。作为三叶草属的代表，T.媒体以其特有的由红紫色花朵组成的球形头状花序来区分。一般的外表,T.媒体与俗称的红三叶草相似;然而，它有较长的茎，较深色的头状花序，和较长的披针形椭圆形小叶，没有明显的苍白的“V”标记，在后一种中出现。T.媒体遍布欧亚大陆的野生植物，特别是在阳光充足的草原、路边、荒地和森林边缘，通常土壤贫瘠。它在地中海地区被列为饲料作物;然而，它比红三叶草少得多[18.，19.］.

影响T.媒体迄今为止，异黄酮在骨骼系统中的作用尚未得到研究。本研究的目的是研究从地上部分提取的标准化提取物的效果T.媒体，与提取物相比T. Praatense.卵巢切除大鼠雌激素缺乏诱导的骨质疏松症的发展。此外，接受雌二醇的卵巢切除大鼠用作阳性对照。

2.方法

三叶草提取使用。标准植物提取物是从干燥的地上部分获得的T.媒体l .,T. Praatense.L.通过超声辅助提取用50％（v / v）乙醇，然后冻干。使用反相高效液相色谱（RP-HPLC）与光电二极管阵列检测（PDA）联合使用反相高性能液相色谱（RP-HPLC）进行标准化程序，其包含在水解的三叶草提取物中的生物活性异黄酮（糖苷剂形式）的定量。平均异黄酮含量，计算为四个糖苷酮的总和：Formononetin（F），生物晶素A（B），Genistein（G）和Daidzein（D），为7.2和2.8％的干重，适用于T.媒体和T. Praatense.分别提取。在异黄酮级分中，糖酮浓度百分比如下：46.3％（f），41.8％（b），11.2％（g）和0.7％（d）T.媒体分别为49.0%（B）、44.9%（F）、5.3%（G）和0.8%（D）t . pratense。两种提取物的剂量分别为10和20 mg/kg总异黄酮苷元/天。

使用的其他药物包括雌二醇半水合物（雌激素，Novo Nordisk A / S，0.2mg雌二醇/ kg /天，P.O.），氯胺酮 - 生物蛋白（甲基喹啉）和木糖 - 木龙（甲基喹啉）。

这项研究是在卢布林地方伦理委员会的同意下进行的，实验对象是来自西里西亚医科大学实验医学中心的3个月大的雌性Wistar大鼠。大鼠初始体重210 ~ 240 g。老鼠被喂食不含大豆的食物随意．在开始注射提取物或雌二醇的前一天，这些动物从标准的实验室饮食切换到无大豆饮食。

在全身麻醉下，腹腔注射氯胺酮和氧拉嗪，行双侧卵巢切除术，从背侧进入卵巢。假手术仅切除卵巢。手术发生在用药前7-8天。

大鼠被分为以下几组(-10每组）：(我)sham-operated控制老鼠,(2)去卵巢(OVX)对照组大鼠，(3)切除卵巢的老鼠接受T.媒体提取物(10 mg异黄酮苷元/kg每日)（iv）切除卵巢的老鼠接受T.媒体提取物（20mg异黄酮糖苷酮/ kg p.o.每日），(V)切除卵巢的老鼠接受T. Praatense.提取物(10 mg异黄酮苷元/kg每日)(VI)切除卵巢的老鼠接受T. Praatense.提取物(20 mg异黄酮苷元/kg po日)，（vii）接受雌二醇(0.2 mg/kg /天)的去卵巢大鼠。

雌二醇或提取物通过胃管（p.o.）以2ml/kg的体积给药28天。对照组大鼠服用体积为2 mL/kg p.o.的载体自来水。此外，为了标记钙化前沿，给动物服用盐酸四环素（20 mg/kg，i.p.）和钙黄绿素（10 mg/kg，腹腔注射），3周后。

第二天在最后一次药物管理后，在24小时禁食后，通过心脏放血杀死动物，全氯胺酮 - 木嗪麻醉。从处死的动物，雌激素依赖性器官（子宫和胸腺）和骨骼，左右股骨，左右胫骨，右胫骨，以及L-4椎骨。在分离后立即称重器官（精度0.1mg）。用卡钳（精度为0.01mm）测量左骨头的长度和直径。将骨头包裹在浸泡在0.9％NaCl溶液中并保持低于-20℃直至在解冻骨骼上进行机械测试[20.］.

2．1.骨力学性能研究

使用Instron 3342 500N仪器和Bluehill 2版本2.14软件评估左股骨干、左胫骨干骺端和右股骨颈的力学特性。如前所述，使用三点载荷弯曲试验研究了左股骨干和左胫骨干骺端的力学特性[20.- - - - - -22.］.将负载垂直于骨骼的中长度的股骨的长轴（支撑点之间的距离：16mm）或近侧胫骨膜化妆品。位移率为0.01 mm / s。分析了每个骨的负荷 - 位移曲线，其代表施加到骨骼的负载与响应于负载的位移之间的关系。评估最大载荷和位移，能量和应力，以及裂缝载荷以及断裂载荷的断裂载荷和屈服和应力。还确定了杨氏模量。为了确定横截面中的惯性矩，需要计算内在骨机械参数的必需品，假设股骨晶体是椭圆形管，并且胫骨膜化合物是圆形梁。对于股骨骨干，右骨干的横截面在中间长度下进行，并根据[23.，使用骨测量软件(Osteometrics)进行组织形态测量。用卡尺测量胫骨干骺端平均直径。

使用压缩测试研究了股骨颈的力学性能[22.，24.］.将负载沿股骨的长轴施加到股骨的头部（位移率为0.01mm / s），并且确定了最大载荷（导致股骨颈部的骨折）。

2.2。骨组织形态学研究

如前所述，右股骨用于制备组织学标本[22.，25.，26.］.组织形态测量使用Optiphot-2显微镜(尼康)，通过RGB相机(Cohu)连接到计算机，使用Lucia G 4.51软件(实验室成像)，最终放大倍数为200和500倍，或使用Osteomeasure软件(放大倍数为70倍)。

在股骨的纵向预备中测量远端骨骺和干骺端的小梁宽度。皮质骨横切面面积和骨髓腔横切面面积由股骨中段股骨骨干横切面确定。同时测量股骨骨膜和骨内膜的横向生长。

2.3。骨矿化研究

为了确定骨矿物质(灰)的质量，将骨头在640°C的马弗炉中矿化48小时，并称重。骨矿物质的质量与骨量的比例也被确定作为骨矿物质密度测量的替代品。

使用Pointe Scientific生产的钙试剂组和磷试剂组，比色法测定矿化骨骼(溶解在6 M盐酸中，然后用蒸馏水稀释)中的钙和磷含量。

２.４.生化研究

采用ELISA法(Mouse/Rat estradiol ELISA, Calbiotech, Inc.)研究血清雌二醇浓度。采用酶免疫法测定血清骨钙素水平(Rat-MID骨钙素EIA, Immunodiagnostic Systems Ltd.)。采用酶免疫分析法(RatLaps EIA, Immunodiagnostic Systems Ltd.)测定骨吸收过程中从骨中释放的I型胶原碎片的血清水平。此外，使用Pointe Scientific试剂集比色法测定血清钙、磷和总胆固醇浓度。

2.5. 统计分析

结果是作为算术平均数提出的SEM。基于对方差分析进行统计估计。在单向ANOVA中确认统计上显着差异（)，进一步分析采用邓肯氏分析法后HOC.测试。在缺乏正态性(夏皮罗-威尔克检验)或方差齐性(莱文检验)的情况下，使用非参数检验:Kruskal-Wallis方差分析和Mann-Whitney测试。将各实验组的结果与假手术对照组和去卵巢对照组的结果进行比较。

3.结果

3.1。体重增加，雌激素依赖性器官的质量，以及血清雌二醇和总胆固醇水平

去卵巢对照组大鼠血清雌二醇水平和子宫质量明显降低。胸腺质量、体质量增重和血清胆固醇水平均显著升高(表1)1)．既不调查三叶草提取物显着影响上述雌二醇依赖性参数。子宫质量，体重增加和血清胆固醇水平的变化通过雌二醇（每日0.2mg / kg）部分地抵消。


参数	虚假的, 的老鼠	OVX大鼠
参数	虚假的, 的老鼠	控制	TM10	TM20.	TP10	TP20	雌二醇

最终体重(g)	234.8 ±3.6	263.1 ±4.5 * * *	268.3 ±4.2 * * *	274.8 ±4.8 ***	263.9 ±3.9 * * *	265.2. ± 4.6***	250.6 ±5.0 *
28天后体重增加（g）	16.5 ±2.4	39.0 ±2.5 ***	42.1 ±2.3 * * *	43.8 ±3.6 * * *	38.3 ±2.0 * * *	40.7 ±3.3 * * *	25.6 ±2.9^*●●
子宫质量(毫克/100克体重)	235.66 ±27.70	35.09 ±1.81 ***	35.64 ±1.60 * * *	36.03 ±1.41 ***	39.39 ±1.67 * * *	37.19 ±1.79 * * *	67.31 ±4.89^{* * *●●●}
胸腺质量(毫克/100克体重)	130.07 ±11.12	196.83 ±9.25 **	203.63 ± 21.41**	199.37 ±9.66 ***	201.27 ± 13.81**	196.57 ±11.35 *	181.74 ±15.74 * *
总胆固醇毫克/ 100毫升	49.93 ±2.90	69.11 ±2.83 * * *	68.88 ±3.61 ***	65.66 ± 2.62**	68.23 ±3.17 * * *	66.13 ±3.30 **	56.19 ±3.81^●
雌二醇（pg / ml）	20.64 ±3.05	10.37 ±0.80 *	9.83 ±0.63 * *	11.68 ± 0.61	9.34 ± 0.44**	10.95 ±1.07 *	13.84 ±1.26

分别以10、20 mg/kg异黄酮苷元(TM10、TP10、TM20、TP20)或0.2 mg/kg雌二醇(0.2 mg/kg)对OVX大鼠灌胃4周。结果呈现为平均值±SEM（). 单因素方差分析，然后进行邓肯检验，或在适当情况下，Kruskal Wallis方差分析，然后进行Mann Whitney检验检验用于评价结果的显著性。＊，**, * * *-与假手术对照组大鼠明显不同。^● ，^●● ，^●●● -与OVX对照组大鼠显著不同。

这些治疗对血清钙和磷水平没有影响(未显示)。

３．２．骨量和矿化

与假手术大鼠相比，去卵巢对照组大鼠雌激素缺乏导致胫骨、股骨和L-4椎体质量显著下降(以其与体质量之比表示)2)．长骨中骨矿物质质量与骨量的比值显著降低。雌激素缺乏对骨矿物质中钙、磷含量无影响。


参数		虚假的, 的老鼠	OVX大鼠
参数		虚假的, 的老鼠	控制	TM10	TM20.	TP10	TP20	雌二醇

骨量/体重比(毫克/100克体重)	股骨	296.04 ±3.89	259.58 ±4.14 * * *	262.10 ±4.81 * * *	254.99 ±5.24 ***	258.66 ±4.24 * * *	267.53 ±6.82 * * *	271.58 ±4.11 ***
	胫骨	225.87 ±3.06	198.61 ±2.43 * * *	193.37 ±3.14 * * *	192.83 ±2.74 * * *	200.52 ±2.80 ***	200.79 ±3.72 * * *	202.79 ±3.40 * * *
	L-4椎体	80.48 ±1.46	72.80 ±2.18 **	68.43 ±1.04 ***	68.52 ±1.11 * * *	73.18 ±0.94 * *	72.46 ±1.65 * *	75.65 ± 2.03

矿物质质量/骨量比(毫克/100毫克骨量)	股骨	45.74 ± 0.34	43.92 ±0.41 * *	42.59 ±0.47 * * *	43.17 ±0.38 ***	44.42 ± 0.43	43.47 ±0.56 * *	44.48 ±0.47 *
	胫骨	46.38 ± 0.56	44.37 ±0.41 * *	43.99 ± 0.27***	44.38 ±0.39 * *	44.42 ±0.42 **	45.21 ± 0.36	45.45 ± 0.55
	L-4椎体	44.32 ± 0.48	42.29 ± 0.77	42.80 ± 0.51	42.64 ± 0.35	43.11 ± 0.45	42.30 ± 0.56	42.92 ± 0.62

钙含量(毫克/克矿物质量)	股骨	382.79 ±4.77	379.61 ±4.73	395.65 ±5.20	396.39 ±5.25	394.26 ±4.06	395.70 ±6.08	391.82 ±5.48
	胫骨	397.83 ±3.93	406.06 ±9.05.	443.56. ±10.99.^{* *●}	445.64 ± 9.88^{* * *●●}	439.05 ±9.18.^{* *●}	446.67 ±11.49^{* *●}	425.57 ±14.43
	L-4椎体	409.72 ±7.67	409.35 ±5.82	446.48 ±6.59^*●	444.44 ±12.09^*●	451.76 ±9.76.^{* *●●}	453.69 ±12.65^{* *●●}	427.06 ±12.12

磷含量（mg/g矿物质质量）	股骨	161.50 ±1.73	160.89 ±1.60	163.82 ±1.29	163.92 ±1.51	164.47 ±1.38	164.41 ±1.32	162.48 ±3.25
	胫骨	154.36 ± 2.17	153.32 ±2.65	168.77 ±5.30^*●	169.92 ±5.29^*●	168.61 ±3.99^*●	168.28 ±4.36^*●	153.65 ±3.31
	L-4椎体	165.01 ± 2.07	163.93 ±2.91	178.55 ±4.93^*●	177.09 ±3.77^*●	176.66 ±2.97^*●	178.18 ±5.12^*●	171.48 ±3.45

提取的三叶草与去卵巢对照大鼠相比，物种对骨量(与体重之比)和骨矿物质含量(骨量与骨量之比)没有影响。这两个T.媒体和T. Praatense.两种异黄酮提取物均能显著提高胫骨和L-4椎体骨矿物质中钙和磷的含量，但对股骨无显著影响。

雌二醇对去卵巢大鼠骨量与体重之比、骨矿物质与骨量之比均无显著影响。给药雌二醇也没有显著影响骨矿物质中钙和磷的含量。

３．３．松质骨(胫骨干骺端)的力学特性

雌激素缺乏严重恶化了松质骨的力学性能(见表)3.)．去卵巢对照组大鼠与假手术对照组相比，最大负荷、最大负荷累积能量、最大应力和杨氏模量均显著降低。裂缝点的力学参数也显著降低(未显示)。


参数	虚假的, 的老鼠	OVX大鼠
参数	虚假的, 的老鼠	控制	TM10	TM20.	TP10	TP20	雌二醇

最大负荷(）	120.63 ±3.95	66.85 ±3.56 * * *	70.02 ±2.53 * * *	69.76 ±2.41 * * *	79.66 ±2.86^{*** ●●}	77.12 ±2.86^{* * *●}	90.38 ±3.08^{* * *●●●}
最大负载的位移（mm）	0.84 ±0.06	0.90 ±0.07	0.83 ±0.04	0.88 ±0.02	0.82 ±0.03	0.89 ±0.06	0.82 ±0.05
最大负载能量（mJ）	52.02 ±4.36	39.20 ±4.61 * *	33.52 ±2.33 ***	36.49 ±1.61 * *	36.58 ±2.67 * *	37.77 ±2.86 * *	39.93 ±2.91 * *
最大应力(MPa)	103.82 ±4.23	54.82 ±4.38 * * *	56.34 ±3.61 ***	55.81 ±2.22 * * *	60.05 ±2.69 * * *	59.65±2.77 * * *	73.74 ±4.07^{* * *●●●}
杨氏模量(MPa)	3410.78 ±237.74	2318.16 ±182.21 * *	2246.02 ±147.56 * *	2248.36 ±117.87 ***	2149.64 ±178.89 * * *	2417.34 ±140.06 ***	2770.31 ±286.73.

分别以10、20 mg/kg异黄酮苷元(TM10、TP10、TM20、TP20)或0.2 mg/kg雌二醇(0.2 mg/kg)对OVX大鼠灌胃4周。结果呈现为平均值±SEM（). 单因素方差分析，然后进行邓肯检验，或在适当情况下，Kruskal Wallis方差分析，然后进行Mann Whitney检验检验用于评价结果的显著性。Arunachal Pradesh，, * * *-与假手术对照组大鼠明显不同。^● ，^●● ，^●●● -与OVX对照组大鼠显著不同。

提取物T.媒体两种剂量均不影响胫骨干骺端力学特性，而提取物T. Praatense.显著增加去卵巢大鼠骨骼所能承受的最大负荷。然而，最大载荷能量和固有力学参数(最大应力和杨氏模量)保持不变。

添加雌二醇显著增加了最大负荷和最大应激。虽然最大负荷时的累积能量保持不变，但杨氏模量与假操作对照大鼠无显著差异。

3.4. 皮质骨（股骨干）的力学特性

雌激素缺乏对股骨干的力学性能没有影响。杨氏模量，以及确定的外部和内部参数的最大载荷(图1)和断裂点荷载（表1）4）在卵巢切除对照大鼠中，与假手术控制大鼠的对照大鼠没有不同。


参数	虚假的, 的老鼠	OVX大鼠
参数	虚假的, 的老鼠	控制	TM10	TM20.	TP10	TP20	雌二醇

断裂负载(）	114.56 ±3.94	111.98 ±2.33	116.01 ±4.44	125.82. ±3.44^●	116.84 ±4.00	127.66 ±2.66^*●●	120.15 ±3.80
断裂荷载位移(mm)	0.52 ±0.03	0.52 ±0.02	0.61 ±0.04	0.52 ±0.03	0.55 ±0.02	0.56 ±0.02	0.54 ±0.02
断裂载荷能量(mJ)	35.69 ±2.75	34.71 ±1.55	46.36 ±5.00	40.07 ±4.29	40.04 ±2.89	43.73 ±2.66	40.56 ±3.58
断裂载荷应力(MPa)	172.68 ±5.76	169.16 ±5.34	182.65 ±6.06	193.14 ±4.41^*●●	178.01 ±3.63	193.34 ±6.89^*●●	187.79 ±7.14^●
杨氏模量(MPa)	9368.24 ±430.74	8679.70 ±689.37	9612.18 ±499.99	9651.65 ±412.61.	9356.92 ± 148.39	8759.22 ±1028.53	9687.52 ±654.88

分别以10、20 mg/kg异黄酮苷元(TM10、TP10、TM20、TP20)或0.2 mg/kg雌二醇(0.2 mg/kg)对OVX大鼠灌胃4周。结果呈现为平均值±SEM（). 单因素方差分析，然后进行邓肯检验，或在适当情况下，Kruskal Wallis方差分析，然后进行Mann Whitney检验检验用于评价结果的显著性。＊-与假手术对照组大鼠明显不同。^● ．^●● -与OVX对照组大鼠显著不同。

(一)

(b)

(c)

(d)

图1

Trifolium介质 三叶草pratense ^• ^•• 影响l . (TM)L.（TP）提取卵形切除（OVX）大鼠股骨骨干（最大载荷点）的机械性能。分别以10、20 mg/kg异黄酮苷元(TM10、TP10、TM20、TP20)或0.2 mg/kg雌二醇(0.2 mg/kg)对OVX大鼠灌胃4周。结果以平均数表示SEM（-10)。采用单因素方差分析和邓肯检验评价结果的显著性。＊-与假手术对照组大鼠（sham）有显著差异。，-与OVX对照组大鼠显著不同。

两种提取物的管理三叶草物种增加了去卵巢大鼠股骨干的力量。两种异黄酮给药后的最大负荷和最大负荷的能量均有增加的趋势，最大负荷在给药后显著增加T.媒体两种剂量和T. Praatense.与较高剂量的剂量，与卵巢切除对照大鼠相比（图1)．类似地，在给予高等的异黄酮剂量后，骨折点的负荷和应力显着增加，卵巢切除对照大鼠有关。提取物对股骨骨膜杨氏模量没有显着影响（表4)．

给予雌二醇后，与去卵巢对照组大鼠相比，最大负荷和骨折负荷的应力显著增加;然而，效果比给药后观察到的高三叶草提取剂量。

3.5。股骨颈的力学性能

雌激素缺乏在与假手术控制大鼠相关的卵巢对照大鼠中的股骨颈颈部强度导致统计上显着降低（图2)．

图2

Trifolium介质 三叶草pratense 影响l . (TM)TP提取物对去卵巢(OVX)大鼠股骨颈强度的影响分别以10、20 mg/kg异黄酮苷元(TM10、TP10、TM20、TP20)或0.2 mg/kg雌二醇(0.2 mg/kg)对OVX大鼠灌胃4周。结果以平均数表示SEM（= 9)。采用单因素方差分析和邓肯检验评价结果的显著性，*＊＊。，＊＊＊-与假手术对照组大鼠（sham）有显著差异。

管理三叶草两种异黄酮提取物均不影响去卵巢大鼠股骨颈所承受的最大负荷。雌二醇对去卵巢大鼠股骨颈强度无显著影响。

3.6。股骨的组织形态参数

尽管与假手术大鼠相比，去卵巢对照大鼠股骨的横向生长略有增加，但皮质骨和整个骨干的横向横截面积并未受到显著影响（表1）5)．然而，骨髓腔的横截面区域与整个骨干区域的面积的比例显着增加，表明皮质骨吸收增加。在卵头切除对照大鼠中，股骨骨骺和复合物中的小梁的宽度显着降低，表明骨吸收增加的可能性增加。


参数		虚假的, 的老鼠	OVX大鼠
参数		虚假的, 的老鼠	控制	TM10	TM20.	TP10	TP20	雌二醇

横截面区域（mm²）	皮质骨	5.25 ±0.08	5.13 ±0.08	5．12 ±0.10	5．31 ±0.09	5.22 ±0.06	5.28 ±0.10	5.26 ±0.11
	骨髓腔	2.65 ±0.08	2.82 ±0.05	2.82 ±0.08	2.75 ±0.14	2.86 ±0.06	2.77 ±0.07	2.55 ±0.10
	整个骨干	7.90 ±0.10	7.96 ±0.12	7.94 ±0.16.	8.06 ±0.15	8.08 ±0.10	8.05 ±0.10	7.82 ±0.19

横截面骨髓腔/骨干面积比		0.335 ±0.008	0.355 ±0.003 *	0.355 ±0.006	0.339 ±0.012	0.354 ±0.005 *	0.344 ±0.009	0.326 ±0.007^●●

横向增长(μM）	骨膜	38.68 ±2.50	43.70 ±2.99	40.14 ±2.84	40.01 ±1.98	39.65 ± 0.88	37.75 ± 2.24	38.37 ±3.91
横向增长(μM）	骨内膜的	28.54 ±2.99	33.62 ± 2.22	31.47 ±2.45	29.70 ±2.90	31.89 ±1.81	29.75 ±1.08	29.74 ±1.67

小梁宽度(μM）	松果体	58.76 ± 0.79	53.47 ±1.09 * *	57.03 ± 0.73^●	57.28 ± 0.67^●	57.85 ±1.26^●	59.42 ±1.35^●●	60.53 ±1.49^●●
小梁宽度(μM）	干骨后端	36.04 ± 0.59	32.98 ±0.86 **	34.54 ±1.03	35.00 ± 0.80	36.23 ± 0.70^●	37.46 ±1.35^●●	38.49 ±1.78^●

分别以10、20 mg/kg异黄酮苷元(TM10、TP10、TM20、TP20)或0.2 mg/kg雌二醇(0.2 mg/kg)对OVX大鼠灌胃4周。结果呈现为平均值±SEM（). 单因素方差分析，然后进行邓肯检验，或在适当情况下，Kruskal Wallis方差分析，然后进行Mann Whitney检验检验用于评价结果的显著性。＊，**-与假手术对照组大鼠明显不同。^● ，^●● -与OVX对照组大鼠显著不同。

的三叶草提取物不影响去卵巢大鼠股骨骨干的组织形态参数，但增加了骨骺小梁的宽度。只有T. Praatense.提取物显着增加了复杂性小梁的宽度。

雌二醇的施用显着抵消了雌激素缺乏对骨骺横截面骨髓/骨干/骨干/晶体分率的影响和股骨分解中的骨骺和半骨质的宽度。

3.7。血清生化骨转换指标

与假手术对照组相比，雌激素缺乏增加了血清骨吸收生化标志物(ratlap)水平，并有增加骨形成标志物(骨钙素)的趋势(见表)6)．


参数	虚假的, 的老鼠	OVX大鼠
参数	虚假的, 的老鼠	控制	TM10	TM20.	TP10	TP20	雌二醇

骨钙素（Ng / ml）	238.30. ±27.70	325.47 ±26.72.	327.36 ±28.13	344.84 ±25.61	344.84 ±38.73	332.50 ±39.91	254.33 ±17.13
ratlaps（ng / ml）	20.88 ±1.82	30.89 ±1.44 * *	30.79 ±1.99 * *	30.74 ±1.93 **	32.99 ±1.78 * * *	28.59 ±2.09 *	23.39 ±2.80^●

分别以10、20 mg/kg异黄酮苷元(TM10、TP10、TM20、TP20)或0.2 mg/kg雌二醇(0.2 mg/kg)对OVX大鼠灌胃4周。结果呈现为平均值±SEM（)．采用单因素方差分析和邓肯检验评价结果的显著性。＊，**, * * *-与假手术对照组大鼠明显不同。^● -与OVX对照组大鼠显著不同。

的三叶草提取物不会影响卵巢切除大鼠骨质骨质血清血清标志物的水平。

在切除卵巢的大鼠中补充雌二醇使骨转换指标水平正常化。

4.讨论

管理三叶草提取显著影响去势大鼠的骨骼系统，抵消由雌激素缺乏引起的一些变化，也引起这似乎是无关的典型的雌激素效应在大鼠体内雌激素水平的变化。效果之间存在一些差异三叶草雌二醇的提取物和雌二醇的效果之间的差异T.媒体和T. Praatense.．

关于骨骼影响的数据T. Praatense.大豆异黄酮的提取物非常有限，但有很多关于大豆异黄酮对骨骼影响的报道。大豆异黄酮(苷元)中含量最丰富的是染料木素和大豆黄酮，且以大豆黄酮为主三叶草异黄酮，鹰嘴豆素A和刺芒柄花素，在哺乳动物中分别代谢为染料木素和大豆苷元[27.］.然而，关于豆制品对人体骨骼系统影响的研究结果并不一致[28.- - - - - -32.］.有趣的是，最近关于在欧洲人群中进行骨密度对骨密度的影响的研究表明，绝经后妇女和男性生物脉素A之间的骨密度和甲酰胺素之间的独立关联[33.］.然而，关于异黄酮效应对骨折风险的最重要数据仍然缺失[1，34.］.

到目前为止，在实验中已经证实了特定的红三叶草异黄酮对骨骼系统的不同影响体内生物脉素A的研究[35.],芒柄花黄素[36.，37.]，染料木素[35.，38.- - - - - -46.大豆苷(),35.，46.和大豆苷元雌马酚的活性代谢物[43.- - - - - -46.］.然而，在上述研究中使用的是游离异黄酮苷元，而在植物和植物提取物中(也在我们的研究中)，异黄酮主要以糖苷的形式存在。

本研究采用3个月大的去卵巢大鼠模型，由于雌激素缺乏而发生骨质疏松变化。三叶草将提取物施用于大鼠4周，从卵巢切除术后一周开始。4周的给药时间足够长，可以在我们之前的研究中观察植物来源物质的骨骼效应[25.，41.，47.，48.］.

雌激素缺乏导致去卵巢对照组大鼠特征性骨质疏松变化。补充雌二醇，在大多数参数中，抵消了雌激素缺乏的影响:胫骨强度的恶化，骨组织形态参数的改变，骨转换标志物的增加。股骨骨干的一些参数也有所改善。

的三叶草提取物不能像雌二醇那样一贯地抵消雌激素缺乏的影响。只有T. Praatense.提取物可增加胫骨干骺端力量(此作用弱于雌二醇)。T. Praatense.提取物对松质骨组织形态计量学参数（干骺端小梁宽度）也有较强的影响。该基因具有较强雌激素活性的原因T. Praatense.提取物可以推测。有人提出，异黄酮的雌激素活性与它们对雌马酚的代谢有关[46.，49.，50.］.雌马酚的形成完全由肠道菌群负责[49.］.从三叶草异黄酮、刺芒柄花素和大豆黄酮可代谢为雌马酚，鹰嘴豆素A和染料木素则不能[49.，50.］.Formononetin和Daidzein的总含量T.媒体和T. Praatense.提取物非常相似。但是,T. Praatense.含有较少量的异黄酮糖酮的提取物，必须以较高剂量施用，以确保相同的异黄酮糖苷酮酮摄入量。更大的施用量T. Praatense.具有高碳水化合物含量特征的提取物可能有助于创造更好的环境，刺激负责异黄酮糖苷代谢的细菌生长，随后产生更高的雌马酚。已经观察到，大豆异黄酮的生物利用度除其他外，取决于肠道细菌的活动，富含碳水化合物的饮食可能刺激雌马酚的产生[50.］.

除了对松质骨的影响，类似于雌二醇的影响，两者都有三叶草提取物对雌激素缺乏的大鼠还产生了其他骨骼效应:显著增加了股骨紧实骨的强度，增加了椎骨和胫骨骨矿物质中的钙和磷含量，但对股骨没有影响。股骨骨干皮质骨强度的改善，由三叶草，与Shedd-Wise等人近期的外围定量计算机断层扫描研究一致[51.据报道，据用大豆异黄酮治疗的绝经后妇女，观察到对皮质骨的一些保护作用。

可以推测，一些骨骼效应三叶草提取物可以至少部分地归因于其他植物成分，如其他类黄酮和酚酸;据报道一些酚醛酸有利地影响卵巢切除大鼠的骨骼系统[47.，52.］.在我们最近的研究中，我们观察到高剂量咖啡和绿原酸只会略微增加股骨干的皮质骨强度[53.］.提取物的作用机制可能与包括异黄酮在内的多酚类化合物的抗氧化活性有关。氧化应激在骨质疏松症发展中的作用越来越受到关注[54.］.

不断增加的影响三叶草提取的钙和磷含量的骨矿的胫骨和椎骨是惊人的。这些变化并不伴随着骨骼中矿物质(灰分)含量的增加。矿物质化学结构变化的确切特征，以及这种变化对骨骼质量的意义，尚不清楚。在股骨中没有观察到钙和磷含量的显著增加，在股骨中厚骨干(致密骨)对骨量的贡献很大。的三叶草提取改善股骨骨干的机械质量。另一方面，提取物对胫骨松质骨的机械性能的影响越来越小。在骨矿物质中结构变化的情况下，可以平衡松质骨中的反骨（在股骨中观察到的小梁宽度的增加，这是不允许改善骨强度的不利影响。问题需要进一步调查。

我们只能推测，钙含量的增加可能是由于摄入了大量的糖三叶草提取物。一些糖可能已达到结肠，并且已被肠道细菌发酵，从而减少环境的pH并增加钙吸收。到目前为止，提出了菊粉型Fructans的这种机制，据报道，增加钙吸收[55.］.增加的钙吸收伴随着含有含有含有果寡糖的饮食的大鼠骨骼中的矿物质浓度增加[56.］.三叶草pratense不含果聚糖但富含其他非结构性碳水化合物[57.］.

与雌二醇相反，提取物对子宫质量没有影响。此外，对体重增加和总胆固醇水平没有影响，这表明，有可能三叶草植物雌激素不会影响身体中的所有雌激素靶标。对子宫质量缺乏显着影响与兔子的实验研究一致[15.］.事实上，相对的结合具有特殊的亲和力三叶草异黄酮对大鼠子宫雌激素受体的影响远低于雌二醇[58.］.对子宫没有显著影响的原因是它们优先与雌激素受体结合，在子宫中表达较少[15.]. 考虑到雌激素对骨骼的影响，本研究结果支持以下观点：三叶草植物雌激素可作为SERMs。然而，需要指出的是，高剂量的红三叶草提取物可产生雌激素效应，增加去卵巢大鼠的子宫质量和阴道细胞分化[59.］.

由于肠道菌群对异黄酮代谢的不同模式，本研究中观察到的提取物在大鼠中的某些骨骼作用可能无法在人体中观察到。可能是由于肠道菌群的不同，人类分为产生雌马酚的人和不产生雌马酚的人[50.，60.］.老鼠有着巨大的盲肠和丰富的菌群[49.]，更能产生比人类的equol [61.］.此外，植物雌激素提取物的不同化合物依赖肠道菌群和人酶进行代谢，个体间代谢差异较大[27.，50.］.不同的代谢物在多大程度上发挥激动或拮抗活性，目前尚不清楚α或者β雌激素受体，在富含异黄酮的食物消耗后形成[27.］.摄入植物雌激素不仅对健康有益。除了影响雌激素受体外，它们还可能与其他生物系统相互作用，Leclercq等人对此进行了全面综述[62.，并产生严重的不良影响[63.]. 雌激素效应三叶草不同靶点的提取物，包括与凝血和中风或静脉血栓栓塞风险相关的提取物，是可能的，需要进一步研究。

本研究有一定的局限性。其中之一是单期研究(4周)，这可能是一个相对较短的时间，用于测试膳食补充剂对大鼠雌激素缺乏模型的影响。更长的时间是可能的三叶草提取政府将允许观察更多的雌激素效应，包括那些骨转换标记。这项研究的另一个局限性是，它只关注提取物的效果;对它们的主要成分进行平行检测，可以找出与它们的骨骼活性有关的化合物。这个问题需要进一步研究。

总之，……的影响T.媒体和T. Praatense.提取物对雌激素缺乏大鼠骨骼系统的作用不同于雌二醇，其作用机制更为复杂。骨骼的影响T.媒体提取物的效果似乎与雌二醇的效果不太相似T. Praatense.提取。这可能是除异黄酮以外的其他成分的提取物对骨骼系统的影响。

承认

这个科学项目得到了波兰科学和高等教育部的支持(批准号:N N405 617638)。

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循证补充和替代医学

使用药用植物和天然产品治疗骨质疏松症及其并发症

提取物的作用Trifolium介质l .,三叶草pratenseL.关于大鼠雌激素缺乏症状骨质疏松症的发展

摘要