文摘

我们调查的影响中药复合歌你阴具备干细胞在肝细胞癌。MHCC97H和Hep3B细胞系使用SYY 4周,和他们的化学敏感性铂是评估。CSC-related标记物的表达,细胞入侵和迁移,集落形成也检查了。SYY-treated人类肝癌原位裸鼠模型开发探索铂对肿瘤生长的影响,转移和生存。CSC-related分子变化在活的有机体内也被评估。结果表明,MHCC97H Hep3B细胞使用SYY显示显著增加化学敏感性的差别铂,对这些CSC-related标记CD90 CD24, EPCAM。SYY也减毒细胞运动性、入侵和集落形成MHCC97H Hep3B细胞系。降低致瘤性和肺转移观察SYY-pretreated细胞系。联合治疗铂和SYY显著降低肿瘤体积和肺转移和延长生存与铂单独治疗。免疫组织化学分析显示减少的表达CD90、ABCG2 ALDH, CD44, EPCAM,波形蛋白,MMP-9和钙粘蛋白的表达增加,联合治疗后肝细胞。这些数据清楚地表明,SYY呈现铂具备干细胞通过抑制肝细胞癌敏感。

1。介绍

肝癌,最常见的肝细胞癌(HCC),是全球第五个男性最常诊断的癌症,但第二个最常见的癌症死亡原因(1]。在临床实践中,只有不到30%的肝癌患者有机会治疗肝移植等治疗方法,手术切除,因为肝癌消融治疗通常是在诊断确认处于高级阶段(2]。因此,经导管肝动脉化疗栓塞术(TACE)和全身化疗是经常使用的3,4]虽然不幸的是这种治疗方法的总体响应率是可怜的(5,6]。

最近,生物化疗后的肿瘤细胞恶化已被报道。在体外接触化疗药物增强转移性大肠癌的潜力,胰腺癌、乳腺癌和卵巢癌细胞癌(7- - - - - -10]。山等人同样报道了所谓的“适得其反”,增加转移性能力cyclophosphamide-pretreated纤维肉瘤细胞(11]。最近的证据表明,某种类型的肝癌是分层组织的各种各样的癌症细胞包括细胞具有干细胞特性的一个子集12- - - - - -15]。这些癌症干细胞(二者)对常规化疗由于细胞特征,如高的药物转运蛋白的表达,细胞周期相对静止,高水平的DNA修复、抗细胞凋亡(16,17]。科斯特洛等人发现CD34⁺CD38⁻二者在AML患者道诺霉素敏感性降低而CD34展出⁺CD38⁺细胞,这与高药物resistance-related基因的表达水平含碘和MRP(18]。同样,刘等人报道,CD133⁺胶质母细胞瘤细胞表现出更少的比他们的CD133细胞死亡⁻同行处理多个化疗药物时由于过度抑制细胞凋亡的基因,包括翻转,bcl - 2,Bcl-XL(19]。CSC理论的出现提供了深入了解为什么治疗肿瘤化疗似乎显示出最初反应但最终导致治疗失败。

我们之前的研究表明,Songyou阴(SYY包含五种草药化合物)的中药抑制分子变化符合epithelial-mesenchymal过渡(EMT) oxaliplatin-treated肿瘤组织和细胞株(20.]。积累的证据表明,EMT和二者形成一个联盟对癌症治疗(21- - - - - -24]。因此,本研究的目的是调查是否具备干细胞SYY直接会使二者的比例和抑制肝癌细胞在肿瘤组织和肝癌细胞株,从而导致肝癌的敏化铂。到目前为止,没有明显的共识的最佳标志来识别二者在任何特定的癌症。广泛使用CSC-related标记包括CD133 CD90, CD44, CD24, OV6, EPCAM,由赫斯特一边人口细胞染色染料(25]。然而,CSC的表达模式定义标记特定细胞系仍有争议。选择合适的细胞系探索SYY对肝癌的影响,我们首先检查CSC-related标记的表达在不同的高和低转移性肝癌细胞系的潜力。我们接下来研究了CSC的变化比例和具备干细胞特征如入侵、能动性,集落形成,肿瘤发生和肺转移SYY-treated细胞系和评估他们的化学敏感性的变化也再次确认在活的有机体内。

2。材料和方法

2.1。细胞株和动物

人类与高转移潜能肝癌细胞株用于本研究MHCC97H HCCLM3,起源于MHCC97和建立在作者的机构26,27]。人类与低转移潜能肝癌细胞株smmc - 7721(在第二军医大学)和Huh7 Hep3B, HepG2(从美国获得类型文化集合)。MHCC97H Hep3B细胞培养2毫克/毫升SYY 4周称为MHCC97H-SYY Hep3B-SYY,分别。MHCC97H-RFP(红色荧光蛋白)细胞系建立在作者的研究所(28)也是培养2毫克/毫升SYY (MHCC97H-RFP-SYY)。雄性BALB / c小鼠ν/ν(年龄在4 - 6周,体重约20克)是经中国科学院和维护标准的无菌条件下。实验协议是由上海医学实验动物保健委员会批准。

2.2。评议和抗体

铂从西格玛化工有限公司购买的单克隆抗体用于流仪分析鼠标反人类单克隆抗体CD90-PE, EPCAM-APC, CD24-FITC, CD133-APC, CD44-PE, IgG-PE同形像,IgG-APC同形像,和IgG-FITC同形像(所有从Miltenyi购买研究)。抗体用于免疫荧光、免疫印迹和免疫组织化学如下:鼠标反单克隆CD90 (Abcam),兔子反多克隆CD133 (Abnova),鼠标反单克隆EPCAM(微孔),鼠标反单克隆CD44(细胞信号技术),兔子反多克隆CD24 (Epitomics),鼠标反单克隆MMP-9 (Abcam),鼠标反单克隆钙粘蛋白(Abcam),鼠标反单克隆波形蛋白(Abcam),鼠标反单克隆的肌动蛋白(Beyotime),鼠标反单克隆ABCG2(微孔),又兔反单克隆ALDH1 (ABGENT)。

2.3。草药的特性和制备提取物

中草药配方SYY,饮食组件授权的中国国家食品药品监督管理局(批准号G20070160),包括5个中国药用植物提取物的比例,指纹和协议的准备之前被报道(29日]。使用的SYY在体外和在活的有机体内本研究从同一批号20110401方是由上海鑫医药科技有限公司有限公司,上海,中国。800毫克/毫升溶液SYY被0.22 -消毒两次μ过滤(微孔)为进一步使用在体外。

2.4。LDH细胞毒性试验

细胞毒性检测设备⁺(罗氏)是一种精确和快速比色测定细胞毒性的定量测定,通过测量乳酸脱氢酶(LDH)释放从受损的细胞活动。融合MHCC97H细胞培养至80%。胰蛋白酶消化后,细胞计数,用移液器吸取到96孔板的密度2000细胞/。背景控制(媒介)、低控制(自发LDH释放),高控制(最大LDH释放),和实验物质(2毫克/毫升和4毫克/毫升SYY)准备在同一板根据制造商的指示。96孔板在湿润孵化器孵化有限公司37°C的5%₂4、8、12、24、48和72 h。结果表示为每个在492 nm的吸光度(OD492)。细胞毒性(%)计算使用方程:(实验值−低控制)/(高控制−低控制)×100%。

2.5。流仪结果

CSC-related标记的表达水平是由流式细胞术。短暂,MHCC97H HCCLM3 smmc - 7721, Hep3B Huh7, HepG2细胞融合增长到80%。胰蛋白酶消化后,细胞在媒介resuspended 1×10的浓度⁶细胞/毫升和孵化主要抗体CD90、CD133, CD24, EPCAM, CD44(稀释1:11)在4°C,持续15分钟。与PBS洗涤三次后,分析了细胞使用FACSC流式细胞分析仪(BD生物科学)。生物标记CD90 / EPCAM MHCC97H-SYY和CD24 / EPCAM Hep3B-SYY也检查了与他们的父母的细胞系。

2.6。免疫荧光和免疫印迹分析

CSC-related标记的表达也由免疫荧光。细胞生长在玻璃覆盖40% - -50%汇合,然后固定,permeabilized,阻塞,孵化主要单克隆抗体在一夜之间在4°C。幻灯片是清洗和孵化anti-mouse或anti-rabbit Cy3-conjugated二级抗体(杰克逊)。细胞复染色4′6-diamidino-2-phenylindole可视化细胞核和检测到的荧光显微镜(奥林巴斯)。

CD90免疫印迹分析蛋白表达,CD24, EPCAM,钙和波形蛋白在MHCC97H-SYY, Hep3B-SYY,他们父母的细胞系进行根据制造商的指示。蛋白质的浓度提取MHCC97H-SYY Hep3B-SYY,和父母的细胞株决心用BCA蛋白质分析工具包(Beyotime)。

2.7。定量实时聚合酶链反应分析

总RNA提取MHCC97H-SYY Hep3B-SYY,和他们的父母的细胞系使用试剂盒试剂(表达载体)。相反总RNA转录RT试剂使用的主要脚本工具(豆类)。信使RNA表达决心通过实时PCR使用SYBR预混料交货Taq II(豆类)。人类基因的引物用于放大如下:CD90正向引物5′-CAGCATTCTCAGCCACAA颈- 3′和反向引物5′-TTACCTCCT TCTCCAACCCT-3′;CD24正向引物5′-TCGGGTGTGCTATGGATG-3′和反向引物5′aga GGG GGTCTGTTGAAG 3′;EPCAM正向引物5′-CAGTGTACTTCAGTTGGTG-3′和反向引物5′-TCAGGTTTTGCTCTTC TC-3′。

2.8。细胞迁移和入侵检测

细胞迁移和入侵MHCC97H Hep3B细胞系被transwell评估化验(Boyden室;康宁公司)。简单地说,6×10⁴细胞在无血清杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)被播种到参议院的每好24-well包含8.0 -板块μ孔隙大小膜。含10%胎牛血清的DMEM(的边后卫)添加到众议院的好。48小时后,膜的细胞达到底部沾染色(σ),在××100数,拍摄200放大。细胞入侵检测进行了类似的,除了80年μL基底膜基质(BD生物科学)被添加到每个6小时前细胞被播种在膜。

2.9。细胞增殖和集落形成试验

MHCC97H和Hep3B细胞系使用镀SYY 4周,然后在96 -孔板(3×10³细胞/)和暴露于铂浓度增加24,48岁,72和96 h。细胞增殖检测进行细胞计数设备8 (CCK8;Dojindo)。结果表示为每个在450 nm的吸光度(OD450)。

集落形成试验,1×10³细胞被镀在6-well板块(康宁)和1%的边后卫DMEM培养有或没有SYY(2毫克/毫升)。培养基是每三天更换一次,殖民地与冰冷的4%多聚甲醛固定后14天开始治疗。细胞被染色和染色(σ)和拍照在×5放大。

2.10。动物模型和治疗程序

24裸体轴承原位异种移植小鼠被随机分为对照组、SYY集团铂+ SYY集团和铂组。七天原位移植后小鼠治疗如下:SYY治疗组小鼠腹腔内(i.p)与0.1毫升5%葡萄糖溶液(GS)一周一次和口头SYY每天(4 g / kg / d);对照组小鼠接受5% GS和蒸馏水一样SYY组;铂组小鼠治疗铂(10毫克/公斤)ip和0.1毫升蒸馏水口头;铂+ SYY组小鼠接受0.1毫升铂(10毫克/公斤)ip和0.1毫升SYY口头(4 g / kg / d)。重量和肺转移肿瘤的起始治疗后4周进行评估。使用另一个12裸小鼠原位异种移植,存活时间的铂+ SYY组和铂组确定接种日之间的间隔和死亡的一天。

评估SYY-treated肝癌细胞的生长和转移潜能在活的有机体内另一个24雄性BALB / c小鼠ν/ν被分成四组。我组小鼠皮下注射5×10⁶MHCC97H-SYY细胞和第二组老鼠注射相同数量的MHCC97H细胞。肿瘤重量测定注射后4周。第三组小鼠注射1×10⁵通过尾静脉MHCC97H-RFP-SYY细胞,第四组小鼠注射相同数量的MHCC97H-RFP细胞。六周后,肺转移是由荧光显微镜和评估的显微镜检查确认串行的部分肺组织块。

2.11。免疫组织化学

肿瘤组织固定、嵌入式和切成5μ米厚的部分。免疫组织化学染色,CD90 ABCG2 ALDH, CD44, EPCAM,钙粘蛋白、波形蛋白,MMP-9使用标准协议(30.]。

2.12。统计分析

在体外LDH细胞毒性试验数据,CSC的比例的细胞,细胞迁移,入侵和扩散学生的分析比较t以及。肿瘤重量比较,方差分析(方差分析),肺转移试验进行了分析使用确切概率法,和生存与生存率较kaplan meier方法。与SPSS 15.0统计分析了Windows(美国芝加哥SPSS Inc ., IL)。被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。的表达在肝癌细胞株CSC-Related标记

CSC-related标记的表达细胞株HCCLM3, MHCC97H, HepG2, SMMC7721, Hep3B, Huh7检查了流式细胞仪和免疫荧光(附加文件1网上(见补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2012/908601))。二者的比例在每个细胞线呈现在图1。在MHCC97H CD90 / EpCAM的表达%,%。CD24 / EpCAM Hep3B的表达%,%,所有这些都与文献报道一致。此外,这些CSC-related标记以前用于研究二者(12- - - - - -14]。因此,MHCC97H Hep3B选择深造。

3.2。SYY展出肝癌细胞株没有明显的细胞毒性,但他们对铂的敏感性增加

MHCC97H细胞治疗与SYY(2毫克/毫升和4毫克/毫升)4、8、12、24、48和72 h证明没有显著增加释放乳酸脱氢酶(LDH)与对照组相比。当LDH释放的对照组是100%,LDH的相对发射4、8、12、24、48和72 h%,%,%,%,%,%在细胞治疗2毫克/毫升SYY和%,%,%,%,%,%在细胞治疗4毫克/毫升SYY。之间没有统计上的显著差异,实验组和对照组(图2(一个)),这表明SYY MHCC97H细胞没有表现出严重的细胞毒性。

的集成电路₅₀铂是低SYY-treated MHCC97H细胞(MHCC97H-SYY)和Hep3B (Hep3B-SYY)与相应的父母细胞系MHCC97H Hep3B。CCK8试验表明,该集成电路₅₀Hep3B-SYY的铂μmol / L,相比之下μHep3B mol / L ()。的集成电路₅₀铂对MHCC97H-SYY也低于MHCC97H (μmol / L和μmol / L;;图2 (b))。

3.3。SYY CSC-Related标记的表达减少和抑制肝癌细胞系的具备干细胞

我们进一步探讨底层机制的chemosensitization铂SYY和发现CSC-related标记的表达CD90 MHCC97H MHCC97H-SYY细胞和(),分别和EpCAM的表达和(),分别。同样,CD24 Hep3B和Hep3B-SYY的表达和(),分别和EPCAM的表达和(),分别(图3(一个),额外的文件2)。逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr)和免疫印迹分析技术提供了类似的结果,证实SYY-treated CSC-related标记的差别,对这些基因的细胞。upregulation钙粘蛋白和波形蛋白的差别,对这些也SYY-treated细胞系(图中观察到3 (b))。

transwell测定细胞迁移和侵袭性证明MHCC97H-SYY Hep3B-SYY细胞通过基底膜效率比亲本细胞株MHCC97H和Hep3B ()。细胞的数量在MHCC97H-SYY穿过基底膜是低于在MHCC97H细胞迁移试验(与;)和入侵检测(与;)。同样,通过Hep3B-SYY细胞通过基底膜是细胞迁移(低于Hep3B与;)和入侵(与;)(图3 (c)3),额外的文件。在集落形成试验,MHCC97H-SYY和Hep3B-SYY表现出显著降低比他们父母的细胞增殖率和克隆形成能力。殖民地形成较低的数量比父母MHCC97H-SYY细胞(与;)和Hep3B-SYY相比Hep3B (与;;图3 (d)4),额外的文件。

MHCC97H-SYY细胞系还显示减少皮下肿瘤生长能力与亲代细胞裸鼠模型。移植后4周,肿瘤重量g和g MHCC97H MHCC97H-SYY组,分别()。六个星期尾静脉注射后,平均的肺转移结节数MHCC97H-RFP组和MHCC97H-RFP-SYY组和分别(;图3 (e)5),额外的文件。

3.4。铂和SYY联合治疗导致增强的抑制肿瘤的生长,减少肺转移

首先,我们评估的影响SYY独自在裸小鼠肿瘤的生长和肺转移使用MHCC97H-RFP细胞。低剂量的治疗SYY (2 g / kg)没有显著抑制肿瘤生长(克和g;)或肺转移结节数(与)与对照组相比。同样,一个中等剂量的SYY (4 g / kg)没有减少肿瘤的生长(克和g;)尽管有明显降低肺转移结节的数量与对照组相比与;)。然而,治疗高剂量的SYY (8 g / kg)显著抑制肿瘤生长(克和g;)和肺转移结节数(与;)与对照组相比(图4(一))。

SYY (4 g / kg)提高铂的抗癌效果。的肿瘤重量低于SYY + OXA组仅在OXA集团(克和g;),较低的肺转移结节数观察与铂单独治疗(与;)。联合治疗铂和SYY还长期生存与铂治疗孤独(相比天与天;;图4 (b))。

3.5。联合治疗铂和SYY显示减少CSC-Related标记和逆转EMT的表达

调查SYY的作用在调节二者的比例在活的有机体内,我们通过免疫组织化学方法检测肿瘤组织,观察ABCG2的比例下降,CD44, ALDH1, EpCAM和CD90-positive后二者cotreatment SYY和铂与铂单独治疗。基质金属蛋白酶9的表达明显下降(MMP-9),这是参与细胞外基质的分解在肿瘤转移过程中,还观察到与铂和SYY cotreatment之后。此外,典型膜钙粘蛋白表达显著调节肿瘤接受SYY和铂(图5)。

4所示。讨论

肝癌晚期患者疾病,别说话,全身化疗通常的治疗选择。但是,这些疗法通常是暂时性的缩小肿瘤靶向肿瘤体积但未能杀死二者,最终导致治疗失败和肿瘤复发。在目前的研究中,我们发现中草药SYY呈现肝癌细胞敏感铂。二者具有一定的特点,使其难以杀死:他们自我保护的财产通过增加活动的多重耐药种代号为ABCB1的转运蛋白,如和/或ABCG2 [31日- - - - - -33];他们比其他细胞分裂慢得多,使他们逃避传统的化疗,达到快速增殖细胞(34bcl - 2这样的),而凋亡蛋白过表达和存活素,高的DNA修复能力,导致抗凋亡和抗癌药物(35,36]。二者的发现不仅解释了为什么治疗化疗常常似乎是最初的成功,但最终未能根除肿瘤,但也有对我们当前的认知产生深远影响的癌症诊断,管理和治疗方案(37]。

二者领域的最关键问题是开发表型分析,可用于可靠地确定二者(38]。目前,应用最广泛的方法来确定这些细胞是通过他们的标记,如CD133的表达,CD90, CD24, CD44, OV6, EpCAM和通过赫斯特一边人口细胞染色染料(25]。然而特定CSC的识别标记在定义细胞系仍是有争议的。在最近的研究中,CD90的表达/ EpCAM MHCC97H细胞和CD24 / EpCAM Hep3B细胞与文献报道一致,他们之前用CSC-related标记研究肝癌二者(12- - - - - -14]。MHCC97H和Hep3B细胞使用SYY为4周(2毫克/毫升)显示增加对化疗的敏感性与他们的父母的细胞系。二者的典型特征之一是抵抗化疗(39]。在目前的研究中,我们发现在MHCC97H-SYY CSC-related标记的表达(CD90 / EpCAM)和Hep3B-SYY (CD24 / EpCAM)细胞明显低于亲本细胞系。

特征如侵袭性、能动性、克隆形成能力、致瘤性,肺转移归因于二者的存在,被认为是癌症的特点与具备干细胞(40]。因此,我们探索具备干细胞特征的变化SYY-treated细胞系和组织反映二者的变化。SYY-treated MHCC97H-SYY Hep3B-SYY细胞显示较低的能动性,侵袭性,克隆形成能力在体外。我们的尾静脉注射BALB / c小鼠ν/νMHCC97H-RFP-SYY细胞,发现肺转移的发生率减少与小鼠注射MHCC97H相比。裸体小鼠模型,MHCC97H-SYY还显示减少皮下肿瘤生长与亲代细胞的能力。Cotreatment裸体小鼠的铂和SYY导致较小的肿瘤体积和肺部转移的比例低于铂单独治疗。符合这些发现,我们发现铂和SYY cotreatment CSC-related标记和逆转EMT的表达降低与铂单独治疗。这些发现表明SYY抑制肝癌的具备干细胞通过减少CSC-related标记的表达在肿瘤组织和细胞株。

SYY是中药配方组成的五个草药。一些组件SYY已经证明价值的治疗恶性肿瘤(41,42]。在我们之前的研究中,我们报道了SYY有效抑制肿瘤的生长和转移,并增加生存在肝癌裸鼠模型轴承MHCC97H异种移植(29日]。熊等人报道,SYY抑制分子变化符合EMT oxaliplatin-treated肿瘤组织和细胞株(20.]。CSC-related标记的差别我们建议对这些在当前的研究中负责化学敏感性的增加SYY-treated组织和细胞系和具备干细胞的镇压。有两种方法可以减少二者的比例:CSC诱导分化或直接消除二者。药的功效视黄段分化为目标在神经胶质瘤干细胞样肿瘤细胞最近被证明(43]。消除治疗antigen-based治疗目标二者的不同方面,并可以采取疫苗或单克隆抗体疗法的形式或者是基于免疫系统癌症的自发反应(44]。目前尚不清楚SYY目标CSC CSC的诱导分化或直接消除二者。这个问题将在进一步的研究调查使用孤立的二者。

5。结论

SYY可以使肝细胞癌敏感铂通过具备干细胞的抑制。

缩写

二者:	癌症干细胞
EMT:	Epithelial-mesenchymal过渡
肝细胞癌:	肝细胞癌
LDH:	乳酸脱氢酶
别说话:	经导管肝动脉化疗栓塞术
SYY:	Songyou阴
g:	葡萄糖溶液。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Q.-A。贾,Z.-Y。唐,Z.-G。任、y . Bo Z.-M。王,张齐兵。张(SD), X.-M。江,l .梁,张齐兵。张(GS)导致了研究设计,数据分析和解释。Z.-Y。唐,Z.-G。 Ren conceived the study. Q.-A. Jia performed the experiments. Z.-M. Wang, Y. Bo, Q.-B. Zhang, and X.-M. Jiang participated in the establishment of the nude mouse model. L. Liang and Q.-B. Zhang (GS) participated in statistical analysis. Q.-A. Jia and Z.-G. Ren drafted the manuscript. Z.-Y. Tang carried out revisions and provided important suggestions. All authors approved the final manuscript.

确认

本研究项目是支持由中国国家“211”项目的基础高等教育(没有。2007 - 353年);国家重点科技特定项目(2008 zx10002 - 019);中国国家自然科学基金(81172275);中国的国家基础研究计划(973计划、2009 cb521700)。

补充材料