烧伤创面愈合主要活性成分的鉴定积雪草的草本植物

摘要

积雪草的在中国和东南亚，草药作为治疗伤口的传统药物由来已久。它们含有多种三萜化合物，主要包括糖苷(积雪草苷和木樨草苷)和相应的苷元(积雪草酸和木樨草酸)。为确定其中的主要活性成分，对这些化合物进行了综合比较研究。在体外分别用不同浓度的积雪草苷、山楂糖苷、亚洲酸和山楂酸处理原代人皮肤成纤维细胞。细胞增殖，胶原合成，MMP-1/TIMP-1平衡，TGF-β/Smad信号通路研究。在活的有机体内，小鼠在烧伤后口服上述四种化合物2周。伤口愈合的速度和质量，以及TGF-β₁在皮肤组织中进行检测。有趣的是，与普遍的假设相反，积雪草苷和造山草苷本身，而不是相应的代谢物，积雪草酸和造山草酸，被认为是主要的活性成分c . asiatica负责烧伤伤口愈合的草药。此外，茜草苷比积雪草苷(III型前胶原的合成在体外，伤口愈合速度，和伤口愈合模式在活的有机体内,相应的)。

1.介绍

烧伤损伤是主要由热或化学损伤引起的皮肤或其他有机组织损伤，包括烫伤、接触和火焰烧伤[1］．根据世界卫生组织(世卫组织)在2002年提出的报告，估计每年有33万人直接或间接地与烧伤有关[2］．

烧伤后，皮肤立即对痛苦作出反应，这是一个复杂的，但精心安排的伤口愈合过程。凝固的中心区由直接热损伤引起的不可逆的细胞和组织坏死组成。中性粒细胞和单核细胞来源的巨噬细胞被吸引到伤口，这是对凝血块中血小板分泌的一系列化学吸引剂的反应[3.］．坏死碎片激活巨噬细胞后释放生长因子，特别是转化生长因子(transforming Growth factor, TGF)，并逐渐使炎症环境有利于成纤维细胞增殖和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)合成[4］．正常的创面愈合是一个自我限制的过程，最终会出现一个重塑阶段，其特征是肌成纤维细胞和巨噬细胞的凋亡，成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)，最终恢复到接近正常状态的肌理和强度[5］．

伤口修复过程中的任何脱轨都会导致各种疾病，包括慢性伤口愈合[6，增生性疤痕[7和瘢痕疙瘩[8］．不正常的伤口修复被认为是对公众健康的主要威胁，也给经济带来沉重的负担[9］．因此，促进伤口修复的尝试从未中断过。遗憾的是，目前临床应用的抗生素、单细胞因子和生长因子的治疗效果并不理想[10］．作为一种互补的选择，积雪草的草药已用于口头和局部改善伤口修复多年[11］．如图所示1的三萜化合物c . asiatica，主要包括两种苷类(积雪草苷和麻豆苷)和相应的苷元(积雪草酸和麻豆酸)，被认为是具有药理活性的主要成分[12］．以往的独立研究表明，积雪草苷和造糖苷都可能通过促进I型胶原合成促进烧伤创面愈合[13- - - - - -15］．另一方面，目前对两种苷元的研究主要集中在其促凋亡和抗炎作用上[16- - - - - -19］．因此，我们的研究小组推测，madecassoside口服可能通过其肠道代谢产物madecasic酸而非自身对ii型胶原诱导的关节炎小鼠产生抗炎作用[20.， Won等人进一步支持[18］．然而，其中的主要活性成分对烧伤创面的愈合作用c . asiatica草本植物;而积雪草苷和制糖苷口服后的作用则有待阐明。

因此，本研究旨在探讨四种主要的三萜组成的影响c . asiatica如上所述在体外胶原蛋白合成和在活的有机体内烧伤伤口愈合，同时。对其进行全面的比较和分析，可以使我们了解其实际的活性成分c . asiatica用于烧伤伤口愈合的草药。

2.材料和方法

2．1．化学药品和试剂

Madecassoside (C₄₈H₇₈O_20.白藜芦醇(C₄₈H₇₈O₁₉甲基丙烯酸(C_30.H₄₈O₆和亚洲酸(C_30.H₄₈O₅采用HPLC-ELSD法测定纯度(≥98%)。南京师范大学生命科学学院新药研究与开发中心保存1份代用样本(分别为Gong 0703: 1-4)。Cell-Light EdU阿波罗567 DNA在体外试剂盒购自中国广州瑞博生物有限公司。用于RT-PCR的EasyScript第一链cDNA合成SuperMix和EasyTaq DNA聚合酶是TransGen Biotech(北京，中国)的产品。I型前胶原n端前肽(PINP)和III型前胶原n端前肽(PIIINP)检测试剂盒购自R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN, USA)。Anti-Smad 3、anti-phospho-Smad 3和anti-甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)购自Cell Signaling Technology (Beverly, MA)。

2．2.主细胞培养

原代人皮肤成纤维细胞是通过酶消化从切除手术患者的健康包皮样本中获得的。所有实验均按照《赫尔辛基宣言》进行，并获得中国南京中大医院伦理委员会批准。细胞在添加10%胎牛血清(FBS, HyClone, Logan, UT, USA)、100 U/mL链霉素和100 U/mL青霉素的Dulbecco 's modified Eagle培养基(DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA)中培养。所有在体外使用第2代和第6代之间的细胞进行检测。

2．3.细胞增殖实验

成纤维细胞(1 × 10⁵细胞/孔)接种到96孔板上，在全培养基中培养过夜。在加入或不加入四种三萜化合物(1,3,10 .)的5-乙基-2-脱氧尿苷(EdU)前，细胞与无血清处理24 hμ48 h孵育后，根据制造商的方案对细胞进行固定和渗透以进行EdU检测。用Hoechst 33342对细胞核进行定位。用荧光显微镜(Olympus)对细胞进行拍照。将edu -阳性细胞与Hoechst 33342染色的细胞在9个随机区归一化，计算增殖率。

2．4．逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析

用不同浓度的四种三萜化合物(1,3,10μM)处理24 h后，用TRIzol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA)提取细胞总RNA，并根据EasyScript试剂盒的协议进行逆转录。引物用于I型胶原、III型胶原、MMP-1、TIMP-1、TGF-Tβ国际扶轮TβRII, Smad 7，和β-actin列于表中1．PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离。将最终浓度的0.005%溴化乙啶加入凝胶中，在BioRad紫外室中可视化PCR产物。采用Image J成像软件(美国国立卫生研究院，Bethesda, MD)，通过密度法拍摄照片并定量基因表达。

2．5．I前胶原和III前胶原的定量检测

采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测I型前胶原和III型前胶原的含量，该试剂盒可检测I型前胶原n端肽(PINP)和III型前胶原n端肽(PIIINP)。细胞(2 × 10⁵细胞/孔)接种在48孔板上，37℃5% CO孵育₂．用不同浓度的三萜化合物(1,3,10μM) 24小时。

2．6．免疫印迹分析

细胞，用不同浓度的四种三萜化合物(1,3,10μM)孵育24 h，收集细胞裂解液冰溶30 min, 12000 rpm离心5 min。50微克蛋白质样品在10% SDS-PAGE上分离，然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用特异性抗smad 3(1:10 00)、抗磷酸化smad 3(1:10 00)和抗gapdh(1:5 00)一抗在4°C孵育过夜，然后用酶标结合二抗孵育1小时。采用Luminata Crescendo Western HRP Substrate (Millipore, Billerica, MA)显示蛋白条带，并使用Image J确定各条带的光密度。

2.7。动物

雄性ICR小鼠，体重18 ~ 22 g，购于中国药科大学实验动物中心。动物被关在一个恒温的房间里(°C)和12小时的光-暗循环，并喂食标准饮食和水随意．所有实验均严格按照中国药科大学《机构动物护理与使用伦理规范》进行。

2.8。烧伤模型与药物治疗

全层烧伤损伤是按照已公布的方案进行的[21］．简而言之，老鼠(戊巴比妥麻醉(40 mg/kg，静脉滴注)。去除背部毛发，用加热至95°C的65 g直径1 cm的黄铜棒与背部皮肤直接接触9秒，诱导全层烧伤创面。将等摩尔的四种三萜类化合物溶于蒸馏水中，口服(积雪草苷和木樨草苷分别为6、12、24 mg/kg;3、6、12 mg/kg)，连续14天。对照组()的处理方法与上述方法相同，但使用蒸馏水除外。在0、3、7、11、14天，用Image j拍摄创面，测量创面面积。同时，对所有创面进行活检，用10%福尔马林固定，以便进一步分析。

2.9。组织学评估

福尔马林固定的组织标本用石蜡包埋，在5μ切片用苏木精和伊红(H&E)染色进行组织学分析，并由专业组织学家从一系列方面进行评分，包括:(1)坏死和溃疡;(2)水肿和炎症细胞浸润;(3)肉芽组织形成;(4)组织愈合。此外，采用Masson三色染色，对细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的沉积情况有更清晰的认识，以确定胶原蛋白的数量和排列。

2.10。TGF -免疫组织化学

在烧伤后7天和14天获得的小鼠创面组织切片在烧伤后5天连续切片μm.玻片用抗tgf -孵育一抗(Abcam, Cambridge, MA) 1小时，然后根据制造商的协议使用DAB Envision系统(DAKO, Ely, UK)进行开发。

2.11。统计分析

所有数据以均数±标准差(SD)表示。对照组和实验组之间的差异采用单方差分析或双向方差分析，然后采用Dunnett检验被认为具有统计学意义。所有计算均使用SPSS统计软件(SPSS, Chicago, IL)进行。

3.结果

3．1.四种三萜化合物对人皮肤成纤维细胞增殖的影响

由于成纤维细胞在伤口愈合中起着关键作用，它们被用于在体外研究。在肉芽组织形成期间，成纤维细胞合成并分泌ECM，主要是I型胶原和III型胶原。皮肤成纤维细胞的增殖可能直接与ECM的快速沉积和随后的伤口愈合加速有关。因此，我们通过EdU实验研究了四种三萜化合物对皮肤成纤维细胞增殖的影响。如图所示2，所有化合物的浓度(1,3,10μM)与对照组相比，不能促进细胞增殖。

3．2．四种三萜化合物对人皮肤成纤维细胞胶原合成的影响

胶原蛋白，尤其是皮肤组织中的I型和III型胶原蛋白，对伤口愈合有很大的好处。因此，我们研究了四种三萜化合物对皮肤成纤维细胞胶原合成的影响。结果如图所示3.．积雪草苷和甘草糖苷(3,10μM)通过RT-PCR检测，成纤维细胞中I型和III型胶原mRNA水平显著升高(图)3(一个)- - - - - -3 (c))，以及I型、III型前胶原蛋白水平(图)3 (d)和3 (e)）.与此相反，与对照组相比，亚洲酸和madecclassic酸均不影响成纤维细胞中胶原的合成。此外，值得注意的是，在10μ米(）.

3．3.四种三萜化合物对人皮肤成纤维细胞胶原降解的影响

胶原合成并不是ECM沉积的唯一原因。在肉芽组织形成和随后的重塑过程中，MMP-TIMP系统在胶原降解中也起着至关重要的作用。MMP-1又称胶原酶I，可以降解各种类型的胶原，而TIMP-1抑制MMP-1的活性。因此，我们通过RT-PCR检测MMP-1和TIMP-1 mRNA的表达。由于TIMPs与基质金属蛋白酶结合的化学计量方式通常为1:1或2:2，因此MMP-1与TIMP-1的比值应该更直观地描述四种三萜化合物对胶原蛋白降解的药理活性。如图所示4(一)- - - - - -4 (d)(3μM)能显著提高人皮肤成纤维细胞中TIMP-1 mRNA的表达，四种化合物均未影响人皮肤成纤维细胞中MMP-1/TIMP-1的比值。

3．4．四种三萜化合物对TGF-的影响/人皮肤成纤维细胞Smad通路

TGF -β/Smad信号通路，主要包括TGF-和相关受体TβRI, II以及Smad 3和7深入参与了肌成纤维细胞的激活、分化和合成成纤维细胞的胶原蛋白。以识别三萜成分的机理c . asiatica加速胶原合成，对TGF-的影响β探索人皮肤成纤维细胞Smad通路。结果如图所示5．asiaticoside (10μM)和madecassoside (3,10μM) TGF-明显增加和Tβ成纤维细胞中RII mRNA表达、Smad 7 mRNA表达降低、Smad 3磷酸化水平升高，对Tβ国际扶轮表达式(数据5(一个)- - - - - -5 (g)）.与之相反，亚洲酸和madecclassic酸均不影响TGF-β/Smad通路在成纤维细胞中的作用。此外，值得注意的是，在10μ米()，与上述胶原合成结果一致。

3．5.四种三萜化合物对小鼠烧伤创面愈合的影响

在体外上述实验表明，两种糖苷积雪草苷和麻糖苷，而不是其苷元积雪草酸和麻糖苷酸，主要通过TGF-激活皮肤成纤维细胞，浓度依赖性地促进I型和III型胶原的合成β/Smad通路，madecassoside比积雪草苷(）.为了验证这一点，进行了伤口愈合测试。如图所示6和7从组织学角度看，积雪草苷和造卡糖苷均能促进创面愈合，且创面愈合方式较好。山茱萸苷(24 mg/kg)处理组与积雪草苷(24 mg/kg)处理组(和,相应的)。

TGF-免疫组化染色(图8)也与上述结果一致。在烧伤后第7天，在两组糖苷处理组中，浸润的巨噬细胞和成纤维细胞均有深色染色。而在烧伤后第14天，仅在糖苷处理组出现DAB染色，这可能是肉芽组织成熟速度加快的结果。此外，亚细亚酸和造山药酸均不能促进烧伤创面愈合。

4.讨论

作为中国和东南亚的一种传统草药，积雪草的(伞形科)适用于广泛的适应症，如溃疡、麻风病和牛皮癣。然而，促进伤口愈合是其主要应用[12，22］．报道的主要成分有相思子苷、相思子苷、亚洲酸和相思子酸c . asiatica进行药理活动[23］．以前的独立研究已经表明c . asiatica该提取物与积雪草苷和造糖苷两种苷合用，均能促进手术或热损伤创面愈合[13，15，24］．然而，积雪草苷或造卡糖苷在加速伤口愈合方面是否更有效尚不清楚。在本研究中，我们调查了四种主要成分的伤口愈合效果c . asiatica以全面和比较的方式。我们的在体外实验结果与既往报道的积雪草苷和madeccassoside通过激活TGF-提高胶原合成水平一致β/ Smad信号通路。在活的有机体内进一步证实积雪草苷和造糖苷是具有创面愈合活性的实体c . asiatica而从组织学角度看，madecas糖苷较积雪草苷具有较好的愈合速度和愈合方式，这与本文的研究结果一致在体外试验结果(和,相应的)。其中，亚洲酸和山楂酸是积雪草苷和山楂糖苷的代谢物，曾被认为是山楂苷和山楂糖苷的活性实体c . asiatica也没有显示出伤口愈合的活动在体外或在活的有机体内与对照组相比。

烧伤创面愈合由三个重叠阶段组成，即炎症、肉芽组织形成和重塑[5］．烧伤引起的一系列凝血级联反应在纤维蛋白基质上形成血小板塞。纤维蛋白基质作为细胞浸润的临时支架，被肉芽组织取代，在角质形成细胞迁移中发挥作用。巨噬细胞分泌TGF-β，从伤口边缘或骨髓吸引成纤维细胞到伤口区域[25］．TGF-有三种亚型β,即TGF -TGF -, TGF -．其中,TGF -与伤口愈合密切相关[23］．我们的在体外RT-PCR检测结果显示，积雪草苷和造糖苷能提高TGF-排除皮肤成纤维细胞mRNA表达后细胞增殖的可能性。进一步在活的有机体内免疫组化观察TGF-染色呈暗色说明积雪草苷和造卡皂苷可能通过诱导TGF-促进烧伤创面愈合表达式。

TGF -β首先结合TGF β II型受体(Tβ随后异源二聚体被纳入TGF β I型受体(TβRI)，并导致TβRI。受体调节的SMADs (R-SMADs)，包括Smad 2和Smad 3，随后在co-SMAD (Smad 4)的参与下被磷酸化并转位到细胞核。Smad 7作为一种抑制性Smad，与R-SMADs竞争受体结合，从而使TGF-失效β信号转导(26］．在TGF-的刺激下，成纤维细胞增殖并分泌细胞外基质(ECM)，主要是I型和III型胶原，也部分分化为肌成纤维细胞，通过收缩加速闭合[27］．因此,我们进行了在体外RT-PCR检测Tβ国际扶轮TβRII和Smad积雪草苷和甘草糖苷(10μM) T mRNA水平显著升高β而四种化合物均对TβRI是一种结构性表达的膜受体。在积雪草苷-和madecassoside处理组中Smad 3的磷酸化水平也升高，说明这两种化合物都能激活TGF-β/ Smad信号通路。

异源性Smad复合物转位到细胞核后，应与I型和III型胶原启动子位置的Smad结合元件结合，并与p300、CBP等转录共激活子和共抑制子结合，调控基因表达[28］．在创面愈合过程中，首先合成ⅲ型胶原作为临时基质，然后在重塑阶段用I型胶原替代[5］．在两种糖苷处理组中均观察到I型和III型前胶原在mRNA和蛋白水平上的表达升高。此外,10点μM, madecassoside在提高III型前胶原合成方面明显强于积雪草苷，这可以解释在我们的烧伤创面愈合模型中更快更好的创面愈合(）.

基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)和金属蛋白酶组织抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)系统也有助于ECM的沉积，不仅在肉芽组织形成阶段，而且在重塑阶段。MMP合成失调和/或MMP/TIMP平衡失调已在慢性创伤中表现出来，如糖尿病足溃疡[29］．MMP-1是主要的胶原酶，可降解胶原，而TIMP-1抑制MMP-1的活性[30.］．尽管madecassoside在3μMMP-1与TIMP-1的比值M是一个更准确的伤口愈合预测指标，在所有四种化合物治疗组中均无显著变化。

综上所述，两种苷类化合物可能通过激活成纤维细胞促进伤口愈合，而不仅仅是促进细胞增殖。TGF-的激活β/Smad通路，p-Smad 3水平升高，TGF-升高和TβRII mRNA水平和Smad 7表达下调，可能有助于促进作用c . asiatica在烧伤伤口愈合中。这两个在体外和在活的有机体内结果证实，积雪草苷和己糖苷本身就是活性实体。然而，这两种苷的代谢物，至少是相应的苷元，是不存在的，这与本课题组和其他研究者提出的前一种假设相反[18，20.，25］．结合我们未发表的积雪草苷和马尾草苷口服后的药代动力学研究数据，我们推测，在烧伤条件下，积雪草苷和马尾草苷可能具有特殊的吸收和分布模式。有待进一步研究阐明积雪草苷和造糖苷在创面愈合中的作用模式和机制。

综上所述，本研究已鉴定出其活性成分c . asiatica草药烧伤伤口愈合通过两者在体外和在活的有机体内化验。值得注意的是，造卡糖苷比积雪草苷(III型前胶原的合成在体外，伤口愈合速度和伤口愈合模式在活的有机体内而这两种苷的相应苷元则不是具有创面愈合活性的实体c . asiatica．

作者的贡献

吴芳和卞德良对这篇论文贡献相同。

致谢

基金资助:国家自然科学基金资助项目(no。30973915)、江苏省高等学校重点学科建设项目、中国药科大学本科生创新研究计划。

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