文摘

肥厚性瘢痕是一种常见的皮肤成纤维细胞增生性疾病,其特征是胶原蛋白生产过剩和细胞外基质(ECM)过度沉积。没有共识的最佳疗法产生完全和永久改善疤痕几乎没有副作用。探讨疗效的齐墩果酸(OA)肥厚性疤痕,探讨可能的作用机制,建立兔耳模型与肥厚性疤痕。OA(2.5%, 5%,和10%)是每天一次连续28天的伤疤。因此,OA显著缓解形成肥厚性疤痕在兔子的耳朵。TGF -的水平金属蛋白酶- 1,TIMP-1,胶原蛋白我和III明显减少,细胞凋亡细胞的数量和mRNA的表达MMP-2, caspase-3, caspase-9疤痕明显增加。疤痕海拔指数(SEI)也明显减少。胶原组织的组织学结果表现出显著的改进。这些结果表明,OA有良好的疗效在兔耳模型形成肥厚性疤痕,和可能的作用机制是OA增加hsf核扩散和减少hsf凋亡减少P311基因表达和TGF -生产、抑制TIMP-1分泌,增强MMP-2活动,随后促进降解的胶原蛋白类型我和III。

1。介绍

肥厚性瘢痕是一种常见的皮肤成纤维细胞增生性疾病,其特征是胶原蛋白生产过剩和细胞外基质(ECM)过度沉积和发生在深燃烧引发的伤口愈合,炎症反应,和创伤(1]。瘙痒和疼痛常常报道肥厚性疤痕患者,谁经历严重的功能和美容问题引起的各种并发症,包括压缩,僵硬的感觉,关节的灵活性,解剖畸形(2,3]。

有很多治疗选择时的肥厚性疤痕产生。然而,未能达成一致意见的最佳疗法产生完整的和永久改善疤痕几乎没有副作用4,5]。已经普遍意识到,天然药物可以发挥独特的作用在许多疾病的预防和治疗。特别是天然化合物从许多植物物种已经成为近年来流行,其生物活性和对人类健康的作用机理还被调查(6- - - - - -8]。

齐墩果酸(OA),一种天然的三萜化合物,具有广泛的药理活性。OA不仅有效保护肝脏从化学药剂引起的急性肝损伤,但也保护肝脏纤维化和肝硬化引起的慢性肝脏疾病(9,10]。一些其他的药理作用包括抗炎、抗肿瘤、降糖、降血脂药,antiatherogenic和antiobese效果(11- - - - - -15]。

我们以前筛选大量的天然化合物,OA被发现显著抑制肥厚性瘢痕成纤维细胞的生存能力和引起细胞凋亡。动物实验表明,preadministration OA抑制肥厚性疤痕形成的兔耳朵(16),表明其预防对肥厚性瘢痕的影响。然而,药物通常用于治疗肥厚性疤痕形成的临床研究和应用较少的预防肥厚性疤痕。此外,良好的预防功能的药物并不意味着良好的治疗作用。

据我们所知,没有研究人员报道肥厚性疤痕产生的OA的治疗效果。本研究旨在证明OA可以减轻或消除形成肥厚性疤痕在兔耳模型并探讨可能的作用机制。

2。材料和方法

2.1。药物制剂

OA的纯度为98.58%,得到白色粉末从山西Yongjian制药有限公司(山西、中国),与纯凡士林、液体石蜡混合比例是1:7:2,0.5:7.5:2和0.25:7.75:2 (w: v: v),分别。药膏基地,包括凡士林、液体石蜡(比8:2),作为安慰剂。

2.2。肥厚性疤痕兔模型

雌性新西兰白兔,获得上海Si-Lai-Ke实验动物有限公司有限公司(中国上海)和初始体重公斤,。一只兔子的耳朵模型与肥厚性疤痕如前所述[成立17,18]。动物治疗都是严格按照国际伦理准则和美国国立卫生研究院的指导关于实验动物保健和使用的,和实验进行了动物实验伦理委员会批准,第二军医大学。

2.3。组织和管理

术后一天29日的伤疤被随机分为五组,每组16疤痕:一个控制(安慰剂)组,三个OA治疗组,一个积极的团体治疗contractubex(缩写为魂斗罗。梅尔兹制药GmbH德国法兰克福)。对照组的伤疤是薄涂上基本没有OA每天一次药膏。OA(2.5%、5%和10%,w / v)应用每天一次的伤痕三个治疗组,和contractubex积极的疤痕组织。两个与全层皮肤完好无损的兔子耳朵作为正常组没有治疗。

2.4。测定胶原蛋白和胶原蛋白三世

所有的动物被杀害在posttherapeutic 28天(术后56天),瘢痕组织是分开的其他组织,软骨是移除。重疤痕组织丁,迅速在液态氮冷冻,直到使用。一旦组织从液氮中删除,这是解冻后维持在4°C。1毫升的磷酸盐(pH值7.4)添加到50毫克的组织,组织是均质和离心分离的20分钟3000 g和4°C,和上层清液收集分析。

第三空我和测量通过ELISA试验使用一个适当的商业酶联免疫试剂盒,根据制造商的说明(研发系统公司,明尼阿波利斯,美国)和以前的报告18]。

2.5。RNA隔离和荧光定量一(FQ-RT-PCR)

疤痕组织的总信使rna提取使用TriPure隔离试剂(罗氏诊断、Vilvoorde、比利时)根据我们以前的报告(19),孤立的RNA治疗RNase-free DNase (Promega)。逆转录执行使用互补脱氧核糖核酸合成装备按照制造商的指示(应用生物系统公司)。

兔子基因引物对(MMP1、MMP2、TIMP-1 P311, TGF -、caspase-3 caspase-9)使用表达引物设计软件设计(应用生物系统公司)和列在表中1。管家基因GAPDH是作为内部控制。FQ-RT-PCR进行实时PCR仪(ABI 7900 ht,应用生物系统公司)40周期组成的变性在95°C 30年代,退火在59°C 30年代和30年代在72°C扩展。所有放大和检测进行了在反应微安光学384孔板与光学胶覆盖(应用生物系统公司)。相对mRNA的表达,其中CT表示阈值周期,,,,,,,。

2.6。免疫印迹分析

疤痕组织在裂解缓冲在4°C均质提取蛋白质。浮在表面的蛋白质浓度的测量。40μ克蛋白质从每个样本加载12%聚丙烯酰胺凝胶,由十二烷基硫酸钠/聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS /页)和转移到PVDF膜(微孔、马、美国),半干的传输方法。与此同时,β肌动蛋白蛋白质作为内部控制添加的。膜是有序的孵化1:400稀释的TGF -主要抗体2 h在室温下,与PBST洗3次每次5分钟,孵化与1:5000稀释TGF -二次抗体在室温下2小时,洗3次对PBST每次5分钟。墨迹与ECL试剂检测和量化测量的相对强度与控制使用图像分析软件。

2.7。TUNEL检测凋亡细胞的检测

原位检测的DNA碎片在石蜡包埋组织部分,TUNEL方法进行使用TUNEL细胞凋亡检测设备(南京凯基生物生物技术有限公司,中国),按照制造商的指示和我们之前的描述18)阳性细胞数(×200)。

2.8。测定疤痕海拔指数(SEI)

疤痕组织和软骨与10%的缓冲福尔马林固定3天,嵌入在石蜡,与皮片,彩色使用hematoxylin-eosin ())。光学显微镜是用来检查疤痕增生的程度,表示为SEI。SEI代表疤痕组织的高度比下面的正常组织肥厚性疤痕。1表示没有比伤口面积差异高度与未受伤的皮肤。

2.9。马森的胶原纤维三色的染色

疤痕组织与10%福尔马林固定,嵌入在石蜡,分段,沾着马森的三色的染色设备,遵循制造商的指令(南京凯基生物生物技术有限公司,中国)和我们之前的描述18]。

2.10。统计分析

所有结果均值±SD。数据使用SPSS 13.0统计软件包进行分析。数据为多个比较进行单向方差分析Dunnett紧随其后的测试。的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。齐墩果酸抑制第三我胶原蛋白和胶原蛋白的形成

ECM的最重要的成分是胶原蛋白,包括胶原蛋白和胶原蛋白三世。如数据所示1(一)和1 (b)第三,胶原蛋白的水平我和与对照组相比显著增加正常组。相比之下,在治疗组,胶原蛋白的水平我和III下降与OA显然经过28天的治疗。胶原蛋白I / III的比率,它反映了组织的灵活性,在对照组明显高于正常组(图1 (c))。然而,28天OA管理显著降低的比率与对照组相比。

3.2。齐墩果酸监管mRNA的金属蛋白酶- 1的表达,MMP-2 TIMP-1 TGF -、P311 Caspase-3, Caspase-9

金属蛋白酶- 1,TGF -,P311发挥重要作用在疤痕的形成和发展。信使rna表达水平显著提升对照组与正常组相比,但明显降低组动物治疗剂量的2.5%,5%和10%(表OA连续28天2)。MMP-2 mRNA表达水平没有增加在对照组超过正常组,但治疗组显著增强,尤其是在高剂量组。TIMP-1的mRNA表达基质金属蛋白酶的有效抑制剂,特别是增强对照组,但治疗组明显减少。激活caspase-3 caspase-9可以明显肥厚性成纤维细胞的诱导细胞凋亡。在这项研究中,他们的信使rna表达水平与正常对照组相比下降组而急剧增加和剂量依赖性的治疗组动物的剂量的2.5%,5%,和10%的OA,分别为28天。

3.3。齐墩果酸的蛋白表达降低TGF -

TGF -可以促进组织修复和再生,但其过度表达促进疤痕形成。56术后天后,蛋白表达水平的TGF -在对照组相比,明显增强正常组(图2)。然而,这种蛋白表达显著降低了OA治疗连续28天,这是与mRNA表达一致。

3.4。疤痕海拔指数

在56天postwounding,对照组显著肥厚性疤痕意味着伤疤海拔指数(SEI)(图3)。连续28天contractubex或OA管理以来29 postwounding明显和剂量依赖性抑制疤痕增生治疗组的平均SEI,,,,分别。

3.5。量化TUNEL阳性细胞

兔子耳朵的部分受到OA被染色的可视化支离破碎的DNA,这是显示为黄色的谷物和凋亡细胞(图表示4(A))。肥厚性疤痕的特点之一是真皮成纤维细胞异常增殖,但OA明显瘢痕成纤维细胞的诱导细胞凋亡的研究。如图4(B), TUNEL阳性细胞的数量在对照组高于正常组,表明瘢痕成纤维细胞的细胞凋亡增加,但明显低于治疗组与剂量的2.5%,5%和10% OA连续28天,这表明OA引出更多的瘢痕成纤维细胞的细胞凋亡。

3.6。马森的三色的染色结果

生产过剩的拼贴肥厚性疤痕的另一个特点。马森染色的疤痕组织进行了56天postwounding。光显微镜检查显示瘢痕组织中胶原纤维的典型特征(图5 (b))相比,对照组未受伤的皮肤组织(图5(一个))。胶原蛋白包被厚,密度,杂乱无章,更加丰富。相比之下,拼贴纤维减少,更薄、更经常远程治疗组与OA,被发现是剂量依赖(数字5 (d),5 (e),5 (f))。

4所示。讨论

肥厚性疤痕拥有生产过剩的属性的成纤维细胞和胶原的过度沉积。肥厚性瘢痕成纤维细胞(hsf)有更高的增殖能力,细胞因子生产,比正常成纤维细胞合成胶原蛋白(20.]。因此,抑制增殖和诱导凋亡的hsf肥厚性疤痕的主要治疗方法。我们之前的调查显示,OA显然导致hsf从人体皮肤组织细胞凋亡。在这项研究中,原位检测细胞凋亡是用于确认OA-facilitated凋亡hsf的疤痕组织。有趣的是,OA治疗28天明显和剂量依赖性增加TUNEL阳性细胞的数量和mRNA表达caspase-3和9的疤痕组织的兔子耳朵,表明OA负责更多的瘢痕成纤维细胞的细胞凋亡。

胶原蛋白,主要由成纤维细胞和分泌细胞外基质(ECM)的最重要组成部分,是主要的结构蛋白的皮肤。虽然在正常人体皮肤胶原蛋白I是最丰富的,我们的研究结果表明,胶原蛋白的内容我三世高于胶原蛋白在正常兔皮,表明不同组成比例的胶原蛋白我胶原蛋白三世在人类皮肤和兔皮之间。56天的操作后,胶原蛋白的水平我和III显然增加了兔子耳朵的肥厚性疤痕组织对照组与正常组相比,但OA急剧逆转这些变化和剂量依赖性。此外,胶原蛋白I / III的比率也明显减少了OA治疗28天。病理检查显示胶原纤维明显减少OA治疗组与对照组相比。同时,28天OA管理明显减少疤痕海拔指数(SEI)的兔子耳朵。这些结果表明,OA不仅减少瘢痕增生,但也会增加疤痕合规。然而,行动的机制尚不清楚。

我们的信使rna表达水平进一步观察矩阵metalloproteinase-1(金属蛋白酶- 1),矩阵metalloproteinase-2 (MMP-2) metallopeptidase inhibitor-1 (TIMP-1)、转化生长因子β1 (TGF -),P311疤痕组织,这是密切相关的生产过剩的成纤维细胞和胶原的过度沉积。伤口修复包括细胞迁移、增殖和组织重构。这些要求和监管过程是通过基质降解蛋白酶。胶原酶是唯一已知的酶能够启动间质胶原蛋白的分解,如类型I, II, III和IV。金属蛋白酶- 1起着关键作用的改造,不断在完好无损的和患病的条件(21),降解的关键酶I型和III型胶原蛋白的伤疤。MMP-2还可以降解胶原蛋白I型,尽管降解胶原IV型是它的主要功能22]。TIMP-1可以绑定到几乎所有MMP的活跃的网站,从而不可逆地抑制酶活性(23,24]。

另一方面,相当多的证据表明,许多细胞因子是重要的组件的过程中伤口修复和疤痕形成。TGF -,最密集的调查与许多类型的纤维化相关分子,刺激炎症细胞的浸润,促进成纤维细胞增殖,血管生成,和ECM的合成,而持久的自分泌环TGF -回报肥厚性疤痕(25]。

在当前的研究中观察到,金属蛋白酶- 1的mRNA表达,TIMP-1, TGF -特别是增加疤痕组织的对照组。虽然这些研究结果与先前的结果是一致的从人体皮肤肥厚性疤痕26,27),它似乎很难理解。据推测,存在一个反馈调节机制。过度TGF -瘢痕成纤维细胞的加速生产过剩,而进一步瘢痕成纤维细胞分泌更多的金属蛋白酶降解胶原蛋白。同时,TIMP-1瘢痕成纤维细胞抑制金属蛋白酶- 1所过度生产活动通过结合其活跃的网站。有趣的是,OA治疗28天明显的信使rna表达水平下降。不同于之前的参数,增强MMP-2表达式没有出现在对照组瘢痕组织,类似于以前的报告(28]。但OA,尤其是在高剂量,极大地提高了MMP-2表达水平,这表明监管MMP-2可能扮演非常重要的角色在OA抑制肥厚性疤痕的过程。

P311信使rna和蛋白质的表达通常不存在于正常的人类真皮组织但明显调节人类肥厚性瘢痕组织(29日,30.]。干扰P311基因表达可以减少TGF -信使rna表达在人类肥厚性瘢痕成纤维细胞(30.]。然而,P311 mRNA表达显然是兔皮的正常组织中发现在这项研究中,可能与不同种类的动物。同样,P311 mRNA表达显著增加的对照组瘢痕组织但在OA治疗组明显减少,表明OA抑制TGF -信使rna表达的差别可能通过对这些P311 mRNA的表达。

瘢痕成纤维细胞合成胶原蛋白我和III, ECM的主要组件,以及排泄金属蛋白酶- 1,MMP-2 TIMP-1 TGF -,P311,调节胶原蛋白的合成和降解。在这些结果的基础上,我们假设OA减轻肥厚性疤痕形成主要通过抑制hsf hsf的增殖和诱导细胞凋亡,为成纤维细胞的异常生物行为中起着重要的作用肥厚性疤痕形成和发展的过程(31日]。

5。结论

总之,OA减轻生产肥厚性疤痕在兔耳模型一样,可能通过抑制hsf hsf的增殖和诱导细胞凋亡,从而进一步地降低了TGF -生产P311基因表达的抑制,减少TIMP-1分泌,增加MMP-2活动,随后移植降解的胶原蛋白我和III。OA可能是一个潜在的药物治疗人类肥厚性疤痕。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(没有。81173462)和开放研究基金的系统性研究的国家重点实验室培育基地,开发利用中药资源。