文摘

蓝升麻一直在北美东部用作草药。这是常用的作为传统药物治疗更年期症状,风湿疼痛,抗炎治疗。特别是,提取蓝升麻的根已经使用传统药物消炎退热剂。在目前的研究中,我们调查的影响蓝升麻组件伊诺的抑制表达或促炎细胞因子后小胶质细胞的活化与脂多糖(LPS)。伊诺的表达,TNF -α,il - 1β,il - 6是由免疫印迹或基因表达。蓝升麻治疗抑制海拔LPS-induced伊诺在小神经胶质细胞浓度的方式表达。蓝升麻的选民也抑制TNF的表达α,il - 1β,il - 6。此外,蓝升麻提取物抑制cox - 2的表达,进气阀打开,促炎细胞因子在小鼠的肾上腺。这些结果说明蓝升麻的成分发挥抗炎作用的抑制伊诺和促炎细胞因子的表达。因此,蓝升麻可能治疗炎症相关疾病的潜在治疗。

1。介绍

中枢神经系统包括两个主要类型的细胞、神经元和胶质细胞含有星形胶质细胞,少突胶质细胞、小胶质细胞(1]。小胶质细胞发挥重要作用的主要免疫细胞感染、创伤、炎症、缺血、神经变性,神经炎症条件(2- - - - - -5]。小胶质细胞激活中枢神经系统的脑损伤。在不同病理条件的大脑,小胶质激活引起各种炎症介质如细胞因子、神经细胞死亡,和异常蛋白质聚合。虽然小胶质激活宿主防御的必要和重要,overactivation micoglia神经毒性。因此,小胶质激活的进程中发挥着重要作用神经退行性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病(6]。

脂多糖(LPS)是代表小胶质活化剂。活化的小胶质细胞的炎症反应似乎是一致的,尽管刺激的性质不同。尤其是有限合伙人所感觉到的toll样受体(TLR)通常被用于诱导炎症反应(7]。LPS-stimulated已知小胶质细胞释放促炎细胞因子和氧化剂如TNF -α、il - 6、il - 1β和一氧化氮8]。他们的活动中和抗炎反应,防止过度损坏主机。一些细胞因子的生产过量或不足会导致不成比例的病理或免疫抑制9]。

因此它可能是重要的功能紧密调节小胶质激活的程度可能是一个很好的目标抵抗治疗神经退行性疾病。过去的十年里,一直在努力开发抗炎剂能够抑制小胶质激活。然而,消炎药是有限的长期政府由于副作用。因此,新型抗炎剂需要用更少的副作用。

周围神经系统的参与(pn)是相对常见的一些神经退行性proteinopathies大脑和可能pathogenetically和诊断重要(11]。病理过程可能目标同时pn和中枢神经系统。在多个系统、萎缩和大量胶质细胞质内含物被广泛分布在中枢神经系统(12]。神经原纤维缠结可以发生在交感神经和脊髓神经节tauopathy虽然他们似乎开发独立于大脑的阿尔茨海默病病理。周围神经节和内脏器官也受到多麸醯胺酸参与疾病(13]。pn的进一步说明和表征损伤会影响神经退行性proteinopathy活体的活检诊断,尤其是在帕金森病。

幼儿根(蓝升麻)是北美东部的草药。这是常用的传统药物治疗更年期症状,风湿疼痛,抗炎治疗。特别是,提取蓝升麻的根和根状茎的管理在传统药物抗炎、退热剂。蓝升麻包含许多生物碱、苷类的生物碱methylcysteine和糖苷caulosaponin(甾体皂苷)似乎贡献大部分的生理活动。蓝升麻的催产剂(加速分娩)产生的影响显然是糖苷caulosaponin,导数的三萜皂苷hederagenin。这些物质被认为是植物雌激素,因为他们的类固醇骨干。抗糖皮质激素的化学结构相似,但这些化合物抗炎效果的贡献还有待调查。在目前的研究中,我们评估了在体外和体内的影响蓝升麻LPS-induced BV2细胞细胞因子和老鼠。本研究的目的是阐明蓝升麻的消炎成分在体外和体内LPS-induced生产抗炎细胞因子的表达。

2。材料和方法

2.1。试剂

有限合伙人(大肠杆菌O111: B4)获得Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。细胞培养成分从英杰公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。所有其他试剂从Sigma-Aldrich获得。根粉蓝升麻(4.0千克)(Caulophyllum thalictroides)在室温下与甲醇提取。合并后的提取物在减压蒸发负担一个棕色的粉末(592克)。部分(292.0 g)溶解在H₂O和提取层。H₂O层提取与正丁醇和蒸发获得干燥的棕色物质(234克,粗皂苷)。正丁醇的一部分可溶(100克)通过柱色谱法解决了分数。Caulosides模拟分离(cauloside, 177毫克;cauloside B, 375毫克;cauloside C, 1.93克;cauloside D, 4.8 g),确定为三萜皂苷通过柱净化和核磁共振光谱法详细描述(10]。蓝升麻原油皂素和caulosides模拟(图1)请提供从Ikhlas汗博士(美国女士NCNPR,密西西比大学)。

2.2。动物和代理处理

所有的实验都使用雄性ICR小鼠体重28 - 30 g从东方有限公司购买,有限公司(韩国首尔),根据指南的动物保健和使用指南的梨花女子大学,韩国。老鼠被安置6或8 /笼子里,水和食物随意允许访问,保持在23°C的环境温度湿度40 - 50%和12 h昼夜光周期07:00-19:00(光)。

七周前雄性老鼠注射生理盐水或有限合伙人(1毫克/公斤)。有限合伙人在生理盐水溶解,腹腔内注入。蓝升麻粗提物(200毫克/公斤)是口服药物注射LPS之前30分钟。控制动物注射同等体积的生理盐水。

2.3。细胞培养

小鼠BV2细胞系(w . Kim慷慨的礼物,韩国生物科学和生物技术研究所、大田、韩国),感染后是不灭的v-raf / v-myc重组逆转录病毒,展品反应小胶质细胞的表型和功能特性(14]。BV2细胞维持在37°C公司5%₂杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM)补充10%的边后卫,100 g / mL链霉素和100 U /毫升青霉素。BV2细胞生长在24-well盘子的浓度细胞/其次是适当的治疗。

2.4。亚硝酸盐的检测

没有生产从激活小胶质细胞由测定亚硝酸盐的量决定的,一个相对稳定的氧化产物,不,像前面描述的那样15]。细胞有或没有孵化有限合伙人在不同浓度的化合物的存在与否24 h。亚硝酸盐积累的上层清液被格里斯反应评估。简而言之,一个整除的条件培养基50μL与同等体积的混合1%磺胺在水和0.1%N5%磷酸1-naphthylethylenediamine盐酸盐。吸光度是确定在一个自动标540海里。

2.5。免疫印迹分析

BV2细胞被洗两次与冰冷的磷酸盐(PBS)和细胞溶解在冰冷的修改裂解缓冲(150毫米氯化钠,50毫米三,1毫米EDTA, 0.01% Triton x - 100和蛋白酶抑制剂,pH值8.0),和细胞碎片通过离心。样本化验使用bicinchoninic酸蛋白质浓度的试剂(美国皮尔斯化学,罗克福德,IL)。浮在表面的整除,直到使用存储在70°C。蛋白质是由SDS-polyacrylamide凝胶电泳分离和转移到聚乙二烯二氟化物膜。膜被tris-buffered脱脂牛奶5%生理盐水/渐变20的解决方案。这些墨迹与肿瘤坏死因子的抗体——孵化α、il - 6和伊诺(细胞信号技术Inc .,丹弗斯,妈,美国)。GAPDH(圣克鲁斯生物技术有限公司、圣克鲁斯、钙、美国)进行内部控制。洗后tris-buffered盐水/渐变20、山葵peroxidase-conjugated二级抗体(细胞信号技术Inc .),和这些墨迹使用增强化学发光检测开发工具包(通用电气医疗集团,都圣吉尔斯,白金汉郡,英国)。

2.6。聚合酶链反应。

ICR小鼠注射刺激(i.p)与有限合伙人在没有或蓝升麻的原油24 h。总RNA分离出肾上腺ICR小鼠使用试剂盒(英杰公司)根据制造商的指示。互补脱氧核糖核酸的合成,2μ克总RNA反向转录使用上标第一链合成系统(表达载体)。互补脱氧核糖核酸被放大使用引物聚合酶链反应(PCR) cox - 2 (R F: AAGACTTGCCAGGCTGAACT: CTT CTGC AGTCCAGGTTCAA),伊诺(R F: GTGTTCCACCAGGAGATGTTG: CTCCT GCCCACTGAGTTCGTC), TNF -α(女:TGTCTCAGCCTCTTCTCATT, R: GTATG AGATAGCAAATCGGC), il - 1β(F: AGCAACGACAAAATA CCTGT R: CAGTC CAGCCCATACTTTAG)和il - 6 (F: CCACTTCACAAGTCG GAGGC, R: CCAG CTTATCTGTTAGGAGA)。PCR产品1%琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙锭染色的可视化。

2.7。统计分析

所有的值被表示为均值±S.E.M.,comparisons between groups were performed using analysis of variance followed by the Student-Newman-Keuls test for multiple comparisons. The results are representative of three independent experiments done in duplicate. Differences with,被视为具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。蓝升麻成分抑制LPS-Induced没有生成和伊诺小胶质细胞中表达。

调查蓝升麻成分的抗炎效果,没有测量的LPS-induced生产蓝升麻成分的存在与否BV2小胶质细胞。小胶质细胞与蓝升麻成分(1-50 cotreatedμg / mL)和有限合伙人(100 ng / mL) 24 h。大多数这些化合物抑制活化的小胶质细胞的一代没有剂量依赖性的方式(图2)。这些发现表明,蓝升麻活性成分可以抑制LPS-induced通过抑制炎症反应的一代。因此,这些结果表明,蓝升麻有抗炎反应。在初步测试中,粗皂苷或(1-50 caulosides a - dμg / mL)暴露在与LPS BV2细胞24小时确定蓝升麻皂素的细胞毒性的可能性。细胞生存能力不是由治疗蓝升麻皂素调制(数据没有显示)。伊诺的表达由有限合伙人高度升高,和这个表达式被cauloside模拟或粗皂苷(图3)。这些结果暗示镇压没有代蓝升麻,也许是因为伊诺的抑制蛋白表达。

3.2。蓝升麻成分减少了LPS-Induced促炎细胞因子的表达。

蓝升麻发挥抗炎作用LPS-induced反应伴随着促炎细胞因子的表达。主小胶质细胞被cotreated选民的蓝升麻和有限合伙人24 h。促炎细胞因子蛋白的表达水平,TNF -α和il - 6与蓝升麻成分减少了治疗剂量依赖性的方式(图4)。有趣的是,cauloside cauloside D显示较强抑制细胞因子表达的影响。这些结果表明,蓝升麻成分具有抗炎作用的表达LPS-induced促炎细胞因子与结构在小胶质细胞特异性。

3.3。蓝升麻天然皂素LPS-Induced海拔降低促炎细胞因子表达在老鼠身上

蓝升麻粗皂苷发挥抗炎作用LPS-induced反应伴随着小鼠促炎细胞因子的表达。肾上腺的ICR小鼠口服后收集蓝升麻粗皂苷(200毫克/公斤)有限合伙人注入前30分钟。有限合伙人注射后24小时,信使rna cox - 2的表达水平,进气阀打开,TNF -αil - 1β与蓝升麻,il - 6降低预处理粗皂苷(图5)。这些结果表明,蓝升麻粗皂苷具有抗炎作用的表达LPS-induced促炎细胞因子在周边器官的老鼠。粗皂苷低剂量(50或100毫克/公斤)没有抑制LPS-induced促炎细胞因子表达小鼠的肾上腺(数据没有显示)。

4所示。讨论

本研究的主要目的是确定蓝升麻LPS-induced炎症的作用。小胶质细胞是中枢神经系统的主要免疫细胞的居民16]。小胶质细胞的功能特征得到了越来越多的关注,因为这些细胞炎症反应中起着关键的作用[17- - - - - -22]。小胶质细胞的激活已建议的发展发生在神经退行性疾病如阿尔茨海默氏症和帕金森氏症(6,17]。细菌脂多糖(LPS)内毒素已被广泛用作inflammagen开发炎症细胞。它还报道,有限合伙人治疗诱发神经毒性通过激活小胶质神经元和神经胶质的文化混合(23]。

体内研究也证明活化的小胶质细胞产生大量的活性氧(ROS),一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子等促炎细胞因子-α和白细胞介素- 6 (il - 6),反过来,导致神经损伤(3,24- - - - - -27]。因此,治疗与抗炎药物可以似乎是最有前途的选择用于治疗神经退行性疾病。

因此在目前的研究中,有限合伙人被用来诱导炎症。由于一氧化氮(NO)的一个主要炎症介质和神经炎症疾病中起着重要的作用,蓝升麻的抑制作用没有进行生产LPS-stimulated小胶质细胞。蓝升麻选民强烈抑制没有生产LPS-stimulated BV2小胶质细胞。多项证据表明,伊诺的表达,没有的关键酶,调节激活的神经胶质细胞。没有牵连的形成多样的生物活性(28]。负责合成的酶没有从精氨酸,一氧化氮合酶(NOS)存在于两种主要形式:组成型NOS (cno)和诱导NOS(间接宾语)。诱导一氧化氮合酶(间接宾语)一般不出现在静息细胞表达在一些病理生理条件,同时还会产生大量的没有针对炎症信号,如细胞因子和有限合伙人(29日]。虽然很明显,没有在炎症中起着重要的作用,病理过程的赞成或消炎没有根据没有浓度可能不同。和不过度损坏主机和通常被用于诱导神经细胞在中枢神经系统的炎症反应。因此,生产的抑制伊诺inflammatory-mediated疾病治疗中可能有潜在的治疗价值(30.]。

我们的研究结果表明,蓝升麻成分抑制生产没有和伊诺表达在细胞与LPS刺激的剂量依赖性的方式。有限合伙人是刺激反应炎症产生TNF -α。目前,inflammation-mediated疾病的治疗研究抑制肿瘤坏死因子-α生产由有限合伙人释放小胶质细胞(31日]。在接下来的研究中,蓝升麻成分的抑制作用与TNF的表达α和il - 6了,因为这些细胞因子也被称为大促炎介质炎性疾病的进展。在这些研究中,蓝升麻成分治疗降低TNF的表达α由有限合伙人在BV2小神经胶质细胞剂量依赖性的方式。尤其是肿瘤坏死因子-α,它可以加强神经细胞受损的促炎细胞因子和costimulator被认为是介导在伊诺基因的调控,主要是通过增殖蛋白激酶(MAPK)和NF -B信号通路。也ROS途径中扮演着重要的角色,细胞毒性介质或信号分子的胶质细胞对这些刺激的反应。在我们的研究中,蓝升麻成分显著抑制LPS-induced生产以及伊诺和促炎细胞因子TNF的表达α和il - 6。这些抑制剂可能抑制MAPK级联的激活,包括ERK p38 MAPK、和物,以及NF -B,从而连接与LPS-induced ROS信号转导和转录激活。因此,可能需要进一步的研究来确定蓝升麻的转录水平和抗炎机制所涉及的调制NF -κB通路。

有趣的是,蓝升麻,caulosides模拟,显著抑制LPS-induced没有生成高浓度(50μg / mL)。然而,伊诺的表达被caulosides强烈抑制在低浓度(1 - 5μg / mL)。这些结果表明,不生产不是仅仅依赖伊诺的表达。LPS刺激因素的生产以及促炎细胞因子。也通过NF -细胞因子影响伊诺的表达式κB信号。有限合伙人时被TLR4与不同的细胞外蛋白质枸杞多糖,CD14、MD-2诱导信号级联导致NF -的作用κB和促炎细胞因子的生产。Caulosides模拟显示,几乎同样的效果在LPS-induced伊诺表达式,但Caulosides A和D显示对TNF -相对强劲的影响α在我们的实验中表达。进一步实验LPS-induced信号变化时都是用变量caulosides caulosides将定义的更详细的机制。变量影响的可能性之一caulosides TNF -模拟α或il - 6表达是水溶性的。甾类化合物在水溶液中几乎不溶。可能附加糖在类固醇可以提高溶解度和吸收进入细胞。有趣的是,caulosides A和D有更好的抑制活性比caulosides B和C炎症在我们的实验中。首席运营官——Cauloside D有三个糖,这些糖将胞内酯酶的分离,和Cauloside D成为Cauloside细胞。羟基Cauloside B比Cauloside a .因此,Cauloside B是更多的极性和不溶于水。

快速免疫细胞因子诱导组织损伤,感染,或炎症。细胞因子在大脑通过一个或多个机制。目前还不清楚哪些nonmutually独家机制参与特定的神经免疫病理生理学接口(32]。出现了促炎细胞因子的基础上他们的外围的行动。垂体前叶细胞内细胞因子及其受体的表达。在炎症性压力,产生细胞因子,与LPS刺激周边地以及在下丘脑和垂体。垂体细胞因子表达和行动已经广泛地查阅[33,34]。关于蓝升麻的抗炎作用,我们假设蓝升麻减少促炎细胞因子表达小鼠的肾上腺。这个想法是符合动物和人类的数据显示,中断或肾上腺功能的衰减与慢性炎性疾病的风险增加(35- - - - - -38]。在目前的研究中,蓝升麻皂素显著减少促炎细胞因子反应肾上腺。期间减少肾上腺功能的潜在机制活跃炎症尚不清楚。总之,蓝升麻成分导致压制生产,伊诺表达式,以剂量依赖性的方式和促炎细胞因子表达。这些结果表明,蓝升麻可以作为抗炎剂。

确认

这项工作得到了韩国研究基金会(MRC, 2010 - 0029355),由韩国政府(最高明的)。