文摘
在类风湿性关节炎(RA)滑膜增生导致关节损伤的重要病理基础。janus激酶和信号传感器和转录激活(Jak-STAT)通路起着至关重要的作用在滑膜增殖诱导血小板源生长因子(PDGF)。探索curcumol anti-cell扩散机制,纯粹从中国药用植物中提取的单体片姜黄粉末在synoviocytes pathway-related Jak2-STAT1/3信号分子的变化被观察到在体外。在这项研究中,呈synoviocytes RA患者(FLS)收集和培养。测量以下参数:细胞增殖(WST-1试验),细胞周期(fluorescence-activated细胞分类,流式细胞仪),STAT1和STAT3活动(电泳迁移率改变分析,EMSA)和蛋白质磷酸化Jak2的表达,STAT1和STAT3免疫印迹。结果表明:curcumol可以抑制RA-FLS PDGF-BB引起的扩散和DNA合成方式存在剂量依赖的相关性在体外。STAT1的转录因子的活动和STAT3 PDGF-BB刺激后明显升高()。Super-shift实验确定了STAT1或STAT3蛋白在复杂。此外,不同浓度curcumol可能下调的DNA结合活动STAT1和STAT3 ()和抑制Jak2的磷酸化而没有影响蛋白质STAT1和STAT3的表达。积极的变化之间的相关性被发现细胞增殖和dna结合活动STAT1和STAT3的分别()。总之,curcumol可能抑制FLS的扩散和DNA合成诱导通过衰减Jak2磷酸化PDGF-BB,表达下调STAT1和STAT3 DNA结合蛋白的活动,这可能为RA的临床治疗提供理论基础。
1。介绍
类风湿性关节炎(RA)是一种慢性的破坏性病变关节的特点是慢性增生性滑膜炎,炎症细胞渗透到关节的滑膜组织和软骨破坏。呈synoviocytes (FLS的)和炎症细胞如巨噬细胞和T细胞产生促炎细胞因子,如白介素(IL) 1β和肿瘤坏死因子-α,RA的发病机制中起重要作用[1]。在类风湿性关节炎,滑膜衬里可以从正常1 - 3细胞扩大到15或多个细胞厚度因为synoviocytes数量的增加。考虑RA滑膜组织的特点,如显著的增殖和侵犯邻近组织,对比与转换或肿瘤组织是自然的。RA滑膜组织或细胞并不是真正的恶性,但他们有许多功能的转换,表示“部分转换”。这些特性包括anchorage-independent增长,失去接触抑制癌基因激活,单克隆或寡克隆扩张,可检测端粒酶活性,体细胞基因突变(2,3]。因此,疗法用于治疗肿瘤的可能有效的治疗RA。临床经验表明,RA治疗可能比简单的更有效的抗炎治疗如果synoviocyte可以抑制增殖和血管翳生产,并促进细胞凋亡。脉冲小剂量的甲氨蝶呤治疗类风湿性关节炎治疗的黄金标准(4]。因此,意义屏幕从天然抗肿瘤药物有效成分,研究其对synoviocyte扩散的影响和内在机制参与RA。
根状茎Curcumae(粉末姜黄;Ezhu中文)是一种传统的中药,用于消除血瘀和减轻疼痛在中国一千多年。有效成分的精油被认为是根茎Curcumae,包括curdione、curcumol, germacrone。Curcumol是精油的主要组件之一的根茎Curcumae的结构guaiane-type sesquiterpenoid半缩酮。它展品特性,如抗肿瘤、抗炎、anti-hepatic纤维化,细胞毒性较低的抗氧化和抗菌活动(5- - - - - -8]。肿瘤细胞系的增殖和RNA合成来自女性患者包括MCF7 MM231,海拉,OV-UL-2被curcumol抑制在体外(9]。结果表明:curcumol诱导细胞死亡占主导地位的凋亡的方式通过caspases-independent ASTC-a-1细胞线粒体通路(10]。然而,很少有人知道curcumol-induced抗效应的特点及分子机制。
在这个实验中,我们用curcumol synoviocytes RA的治疗在体外和评估的细胞毒性效应curcumol细胞生存能力,细胞周期阻滞,信号传感器和转录激活(STAT) 1和STAT3的活动,和蛋白质磷酸化的表达Janus激酶(激酶)2,STAT1和STAT3。这项研究的目的是探索curcumol在抑制细胞增殖的效应和机制层面的Jak2-STAT信号转导引起血小板源生长因子(PDGF) bb。
2。材料和方法
2.1。材料
Curcumol (C15H24O2本)是分离姜黄姜黄油(蒸汽从根茎Curcumae)结合晶体沉淀在较低温度(0 - 5°C)与无水乙醇重结晶作用和特点是色谱curcumol参考物质(获得国家控制药品和生物制品研究所,批号:CUL081007T,用于测定)。curcumol的纯度大于98%使用HPLC-UV峰值归一化法。工作解决方案是由乙醇溶解的化合物在实验之前。人类PDGF-BB从PeproTech购买(美国新泽西州)。WST-1细胞增殖和细胞毒性试验设备是获得注册机(中国南京)。兔子anti-phospho-Jak2 (Tyr1007/1008)多克隆抗体anti-STAT3买来Biovision(美国CA)。鼠标anti-STAT1单克隆抗体来源于BioLegend(美国CA)。LightShift化学发光EMSA装备购买从皮尔斯(美国IL)。
2.2。人类FLS的隔离和文化
人类FLS的原发性滑膜组织中分离得到三个RA患者符合修改后的美国风湿病协会标准(11),经历了整个关节置换手术或滑膜切除术,像前面描述的那样12]。短暂,新鲜的滑膜组织被剁碎,与0.5毫克/毫升的I型胶原酶消化(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)剧烈摇晃在37°C 4 h。包含发布的浮在表面的细胞被删除,和消化过程重复两次。细胞被用于段落4 - 8人,在这段时间里,他们被组成的均匀的人口。细胞生长在37°C下湿润,5%的公司2大气高glucose-containing杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) (Gibco BRL,宏伟的岛,纽约)补充10%胎牛血清,2更易/ L谷氨酰胺,青霉素100单位/毫升,100μ链霉素的g / mL。这项研究是由西南医院伦理委员会批准,所有参与者和给他们的参与书面知情同意。
关于可行的细胞被添加到每个96孔细胞培养板的细胞增殖试验,和添加到每个细胞six-well培养板的其他检测。细胞随机分为几个组:正常对照组(正常FLS的),PDGF-BB组(25 ng / mL PDGF-BB 30分钟),剩下的组不同浓度的处理curcumol preinduced PDGF-BB 30分钟。Curcumol第一次被溶解在绝对乙醇,和最终的解决方案是稀释介质不同浓度。绝对的最终浓度乙醇不应超过文化总量的1%。溶剂对照组(包含PDGF-BB乙醇和1%绝对没有curcumol)是应用于细胞周期检测。然后,板在37°C孵化有限公司5%2大气24 h。细胞的核和胞质蛋白得到相应的方法。
2.3。细胞增殖实验
FLS的被添加到每个96孔细胞培养板和孵化一夜之间在37°C下5%的股份有限公司2在湿润孵化器允许细胞附着井。然后,细胞接受PDGF-BB和不同浓度(25、50、100、200、400和800年μg / mL)的curcumol 24 h,和curcumol的影响细胞的增殖是由WST-1 (4 - [3 - (4-iodophenyl) 2 (4-nitrophenyl) 2 h-5-tetrazolio] 1, 3-benzene disulfonate)分析根据制造商的指示13,14]。
2.4。细胞周期的决心
细胞周期分布进行了分析使用fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)。简而言之,被PDGF-BB诱导后和治疗与不同浓度(25、50、100μg / mL)的curcumol 24 h, six-well板细胞收获,与PBS洗两次,固定在70%乙醇在4°C 1 h和离心机。颗粒是治疗核糖核酸酶(20毫克/毫升)在室温下为30分钟,然后用碘化propidium孵化(50毫克/毫升)30分钟(10]。
2.5。细胞提取
six-well板的FLS的处理不同浓度(25、50、100μcurcumol g / mL),核提取物是由一个修改的方法15,16]。上层清液的细胞培养板被丢弃,细胞被洗了三次在寒冷的磷酸盐(PBS)。不依从细胞颗粒状和resuspended 1.5毫升冷PBS。这些细胞被颗粒状10年代和100年resuspendedμL冷缓冲区(10更易与L HEPES-NaOH (pH值7.8),15更易/ L氯化钾,1 L MgCl更易20.1 L更易与EDTA 1更易与L二硫苏糖醇,1更易/ L PMSF和1毫克/毫升亮抑酶肽)通过挥动管。细胞被允许膨胀在冰上了15分钟,然后涡通过添加10% NP-40 10 10年代μl .样本离心机30年代。颗粒resuspended在50μL冷缓冲B(20更易与L HEPES-NaOH (pH值7.9),1.5 L MgCl更易20.2,0.42 mol / L氯化钠,更易与L EDTA, 25%的甘油,0.5 L更易与二硫苏糖醇,0.5 L更易PMSF和1毫克/毫升亮抑酶肽)和孵化冰为高盐萃取30分钟。细胞碎片被离心1分钟和上层的分数(包含dna结合蛋白质)是存储在−70°C。由布拉德福德的蛋白浓度测定方法(17]。
2.6。电泳迁移率改变分析(EMSA) STAT1和STAT3的活动
的分析是基于DNA蛋白质复合物迁移慢于游离DNA双链寡核苷酸在原生聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶,导致“shift”标记的DNA带的迁移。乐队的检测是通过“LightShift化学发光EMSA工具包”使用nonisotopic检测dna蛋白质相互作用的方法。两双链寡核苷酸包含人类STAT1站点(P1: 5′猫GTT ATG猫ATT有条件现金援助GTA AGT-3′;P2: 5′法TAC gg AAT ATG猫AAC ATG 3′)和STAT3的网站(P1: 5′都有条件现金援助TCT GGG AAT移行细胞癌标记ATC-3′;P2: 5′手枪CTA GGA ATT CCC AGA gg ATC-3′)和生物素end-labeled。绑定在21日进行化验μ包含3 L具有约束力的反应混合物μ40 g核提取蛋白质、DNA结合蛋白缓冲和fmol biotin-labeled DNA探针。super-shift化验,提取首先被孵化STAT1和STAT3抗体20分钟紧随其后添加相应的生物素探针。反应在室温下孵化了30分钟,在nondenaturing 12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了200 V 1.5 h使用高离子强度条件。证实了特异性结合的200倍超额含有人类STAT1的标记双链寡核苷酸或STAT3网站反应混合物分离,分别。作为额外的控制,200倍的冷寡核苷酸轴承NF -κB结合位点被添加到反应混合物分离。竞争反应是孵化前10分钟的标记寡核苷酸。转移膜立即交联后15分钟在紫外线透照器配备312海里灯泡。利用鲁米诺化学发光检测方法/过氧化增强器解决方案和一个稳定的解决方案(美国皮尔斯)被用来描述由制造商和膜暴露在x光片2分钟前发展。乐队进行扫描,和相对强度分析进行分析软件(18,19]。
2.7。免疫印迹蛋白质磷酸化Jak2的表达(p-Jak2) STAT1和STAT3
six-well板的FLS的处理浓度的curcumol 25μ50 g / mLμg / mL和细胞溶解消散缓冲区包含1% Triton x - 100, 50更易与L玫瑰,pH值7.5,10%的甘油,150更易/ L氯化钠,1.5 L更易EGTA 10 L更易与焦磷酸钠,100 L更易与氟化钠,2更易与L原钒酸钠,10μ1 g / mL抑肽酶,更易与L phenylmethylsulfonylfluoride。溶菌产物是通过离心分离15分钟在4°C。溶解后,蛋白质含量是由布拉德福德的量化方法。等量的蛋白质被加载在每个车道的sds - page(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶和转移到聚偏二氟乙烯薄膜(PVDF) 25更易与L三,192 L更易与甘氨酸,20%甲醇80 mA 4 h。过滤器被封锁,以减少非特异性结合的孵化阻断缓冲区(3%脱脂牛奶,0.01 M PBS, 0.02% Tween-20)过夜。这些墨迹被孵化与兔多克隆antiphosphorylated Jak2或STAT1 STAT3抗体在1:1000稀释1 h,分别。与PBS-Tween-20洗后,这些墨迹与二次孵化抗体结合辣根过氧化物酶阻断缓冲区1 h。广泛的屁股都洗PBS-Tween-20和开发的增强化学发光(ECL)方法(美国皮尔斯),然后暴露在x射线胶片2分钟。蛋白质信号是由一个图像扫描量化密度计,和每个蛋白质信号的强度是相应的规范化β肌动蛋白染色信号(20.]。
2.8。统计数据
数据提出了均值±标准差(其中)。统计分析是由学生的评估以及(正常控制和PDGF-BB集团)之间或单向(PDGF-BB之间和药物治疗)方差分析Dunnett的紧随其后以及多个比较使用SPSS统计程序。一定程度的被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。不同浓度的Curcumol对细胞增殖的影响和DNA合成FLS的RA患者
PDGF-BB组相比,细胞增殖、DNA合成FLS的明显改变curcumol(治疗组中)。随着curcumol浓度增加,OD值逐渐降低,表明不同程度的细胞增殖抑制。抑制率(%)计算的方程:。数据显示随着curcumol浓度增加(25 - 800μg / mL), synoviocyte增殖的抑制率逐渐增加(8.15%,11.47%,13.17%,15.00%,15.33%,和36.37%),分别为。我们进一步发现使用流式细胞仪测定细胞周期分布的细胞G1, G2, s .结果表明,PDGF-BB刺激增强DNA合成比正常对照组(52.49%和13.87%)。DNA合成不是PDGF-BB与溶剂对照组明显不同。curcumol浓度的增加,细胞S期的比率从35.76%逐渐减少,28.74%到14.52%,表明curcumol抑制DNA合成的synoviocytes浓度的方式。这些数据表明,不同浓度的curcumol抑制synoviocyte核扩散和DNA合成(图1和图2)。从初步研究基于数据,三种不同浓度的curcumol (25μ50 g / mL,μ克/毫升和100μg / mL)选择了下面的实验。
3.2。不同浓度的效果Curcumol STAT1和STAT3在FLS的RA患者的活动
的特异性改变乐队在EMSA验证了竞争分析:所有乐队的转变被孵化抑制多余200倍的无标号STAT1和STAT3探针和不变的竞争等类似的另一个无关紧要的寡核苷酸NF -κ(数据未显示)。在缺乏刺激,STAT1和STAT3 dna结合蛋白RA synoviocyte活动很弱在正常对照组。与25 ng / mL PDGF-BB刺激后,STAT1和STAT3活动显著增加()。治疗后与不同浓度的curcumol (25μ50 g / mL,μg / mL, 100μg / mL), STAT1活动减少()和STAT3活动抑制非常显著()。此外,STAT1和STAT3抗体super-shift化验显示绑定乐队滞后明显增加STAT1或STAT3抗体后,展示STAT1的存在或STAT3蛋白在绑定乐队(dna蛋白质复合物)(表1,数据3和4)。积极变化之间的相关性被发现的细胞增殖、dna结合活动STAT1和STAT3 curcumol不同浓度(,;,),分别。
3.3。不同浓度的效果Curcumol p-Jak2的蛋白表达,STAT1和STAT3 FLS的
免疫印迹分析表明,p-Jak2蛋白质在RA synoviocytes激活,稍微增加与25 ng / mL PDGF-BB(刺激后)。蛋白质STAT1和STAT3的表达调节后明显PDGF-BB刺激相比,正常控制(;),分别。治疗后与curcumol 50的浓度μg / mL,没有明显改变STAT1和STAT3蛋白表达(),而Jak2磷酸化的抑制非常显著()(表2和图5)。
4所示。讨论
Curcumol是一种有效的抗癌药物用于中药。作为一个有效的策略来防止致癌作用,植物化学物质在中医草药用于防止致癌作用通过作用于不同细胞活动包括调节细胞凋亡(21]。Curcumol抑制了肿瘤细胞的扩散和RNA合成(MCF7 MM231,海拉和OV-UL-2)在体外虽然它没有影响正常的乳腺细胞(9]。它已被证实在体外培养B型synoviocytes RA患者积极分裂细胞的致癌基因的表达特征。因此,synoviocytes从RA患者的增长失控,导致过度增生的滑膜和血管翳侵入2]。因此,RA治疗可能指的肿瘤治疗方法。我们的数据表明,某些浓度curcumol从25μ克/毫升到100μg / mL可以抑制RA-FLS PDGF-BB引起的扩散和DNA合成在体外,这表明curcumol可能候选人治疗风湿性关节炎的药物之一。
janus激酶(激酶)作为治疗目标产生极大的兴趣近年来由于独特的角色,这些酶扮演看门人在信号转导过程中(22- - - - - -24]。罗马的神命名的盖茨和门(Janus),这四种酶(Jak1, Jak2、Jak3 Tyk2)控制信号众多细胞因子,因此在收购中发挥核心作用,先天免疫和造血作用25]。Jak-STAT通路是多种细胞因子信号的目标,包括干扰素-γ、2、il - 4、il - 6、IL-7 il - 10、il - 12, IL-15,所有这些都被认为是生物在类风湿性滑膜炎症的重要作用[26,27]。七统计已确定,初步人体滑膜组织的工作表明,STAT1表达和活动增加RA滑膜和STAT3促进RA滑膜成纤维细胞的生存28- - - - - -30.]。soc(抑制细胞因子信号)抑制因素的负反馈调节Jak-STAT信号通路(31日]。使用retroviral-mediated Stat3的显性负突变体基因转移,称为Stat3-YF,发现过度Stat3-YF有效地阻止了内生Stat3基因表达激活和Stat3-dependent,包括socs3和myc基因的表达。Stat3-YF-transduced RA synoviocytes未能成长在文化、表现出明显减弱(3H]胸腺嘧啶核苷掺入,自然死亡30.]。这些发现表明,STAT1和STAT3在synoviocyte扩散激活中起着重要的作用。此外,PDGF-BB disulphide-bonded之一二聚的PDGF亚型,由四个多肽链。反过来,PDGF受体(PDGF-R)可能发生α或β为或α/β形成(32]。绑定的二聚的配体的细胞外部分两个PDGF-R链引发PDGF-Rs二聚和细胞质的自身磷酸化酪氨酸残基。PDGF受体是大量表达在synoviocytes RA患者,并与PDGF刺激增强synoviocytes anchorage-dependent和独立发展。在RA滑膜,synoviocytes、中性粒细胞和巨噬细胞产生大量的PDGF,导致细胞质Jak2酪氨酸磷酸化和STAT1 STAT3核蛋白质激活通过绑定到膜PDGF-R [33,34]。目前的研究表明,转录因子的活动STAT1和STAT3 PDGF-BB刺激后明显升高()。Super-shift实验确定STAT1或STAT3在复杂的蛋白质。额外的治疗curcumol抑制Jak2和减少了dna结合蛋白的磷酸化STAT1和STAT3的活动。此外,积极的变化之间的相关性被发现STAT1和STAT3(细胞增殖和活动)。因此,Jak2-STAT1/3信号通路可能是上游机制curcumol对细胞增殖的抑制作用。
总之,潜在的抗curcumol RA-FLS被调查。这些结果首次表明,curcumol可能抑制FLS的扩散和DNA合成诱导通过衰减Jak2磷酸化PDGF-BB,表达下调STAT1和STAT3 DNA结合蛋白的活动。虽然需要进一步澄清的复杂机制curcumol-induced抗,curcumol也是非常有前途的一个新的潜在代理RA的临床治疗。
目前,不同浓度的curcumol应用探索相应的机制在体外(6,9,10]。没有文学与人类相关的应用程序在活的有机体内,所以它仍然是未知curcumol浓度得到的病人。信号转导是由哪些细胞生化事件传输一个信号从细胞表面通过细胞膜和细胞质。细胞增殖引起的不同细胞因子涉及到许多相关的信号分子,包括受体激酶,二级信使[35]。因此,有必要进一步探索的影响curcumol FLS的扩散引起的其他细胞因子(肿瘤坏死因子-α、碱性纤维母细胞生长因子和转化生长因子)在未来。
作者的贡献
h . Wang和y方贡献同样这项工作。
确认
这项研究得到了国家自然科学基金(没有。30973827)和重庆科委自然科学基金(没有。2008 bb5133)。