探索Tanshinone诱导细胞凋亡的分子机制花絮”对大鼠肝星状细胞激活

文摘

自激活肝星状细胞(HSC)是主要的事件在肝纤维化的进展,HSC的选择性间隙应该是一个潜在的治疗策略。丹参根乙醇提取物(志)明显改善肝纤维发生DMN-administrated鼠模型。接下来,tanshinone花絮(Tan花絮),斯密的主要化合物,显著抑制大鼠HSC可行性,导致细胞凋亡。蛋白质组工具阐明增加prohibitin参与细胞周期阻滞在谭花絮”的治疗而击倒prohibitin可以减弱Tan IIA-induced细胞凋亡。此外,谭花絮介导的C-Raf易位与prohibitin激活MAPK和抑制HSC的一种蛋白激酶信号。MAPK拮抗剂抑制ERK的磷酸化是必要的谭IIA-induced伯灵顿的表达和细胞色素c。PD98059也废除了谭IIA-modulated PARP的乳沟。我们的研究结果表明,谭花絮”可能有助于促进ERK-Bax-caspase HSC的凋亡通路通过C-Raf / prohibitin复杂。

1。介绍

肝纤维化是细胞外基质(ECM)过度沉积的蛋白结果慢性肝损伤由于病毒、自身免疫、药物引起,淤胆型和代谢疾病1- - - - - -4]。在肝纤维化的进展,各种细胞因子和分子包括转化生长因子-β1 (TGF -β1)和血小板衍生生长因子(PDGF)反过来刺激肝星状细胞(hsc),然后进行表型从静止细胞转变成增生性纤维发生的细胞(5- - - - - -8]。激活肝星状细胞也可以调解释放促炎细胞因子和组织金属蛋白酶的抑制剂(TIMP),这可能会引起胶原的沉积,进一步纤维化(9]。与持续的肝损伤、肝纤维化可能发展为肝硬化,诱发肝衰竭和肝细胞癌(10]。因为肝星状细胞在肝纤维化的进展的主要原因,因此,除肝星状细胞的凋亡可能有效预防甚至逆转肝纤维化(11]。

的根源丹参Bunge(唇形科),俗称Dan-shen,用作中药治疗microcirculatory疾病在亚洲(12- - - - - -14]。Salvianolic酸B,水溶性化合物丹参,已经被证实能减弱心脏成纤维细胞迁移,胶原蛋白和细胞因子的分泌15]。此外,水提取物丹参吸引了越来越多的关注,由于其对二甲基亚硝胺的antifibrotic影响——(静)诱导的大鼠肝纤维化模型(16,17]。然而,这仍然是未知的,如果脂溶性化合物丹参可以负责肝脏的保护作用。的主要组件丹参,谭活动花絮,二萜奎宁衍生品,据报道改善氧化应激诱导细胞凋亡或分化在人类癌不同细胞系(18,19]。因此,二萜奎宁衍生品可能是潜在的药物处方antifibrosis由于growth-inhibitory效果。尽管最近的文档提供的证据表明,谭花絮可以诱发大鼠神经细胞凋亡HSC-T6细胞(20.),潜在的药物靶点和机制仍有待探讨。在这项研究中,我们评估了凋亡效应Tan花絮”对大鼠肝星状细胞和分子机制。

在肝纤维化过程中,大量的蛋白质和分子将改变在数量和质量21]。此外,蛋白质量化功能蛋白质组学中是一个关键参数,有可能反映疾病的不同阶段(22]。传统分析方法只提供了一个可怜的理解复杂的底层机制或生物功能。因此,高通量蛋白质组学技术结合先进的生物信息学数据挖掘提供了一种新途径大规模筛查和纤维化标志物和病因23,24]。这里描述我们的方法来表示不同蛋白质概要文件生成功能“签名网络”和相关架构参与蛋白质反应Tan花絮”治疗。

这种综合方法,我们发现谭花絮”能有效地诱导大鼠肝星状细胞激活的细胞凋亡。更重要的是,我们已经确定了几个目标蛋白可能为相关的分子机制提供新的见解antifibrotic Tan花絮”的效果。

2。材料和方法

2.1。材料

特定的抗体14-3-3,Na⁺/ K⁺腺苷三磷酸酶caspase-3 9, PARP COXIV买来圣克鲁斯(圣克鲁斯、钙、美国)。多克隆抗体TCTP、prohibitin Rho-GDI,细胞色素C, GAPDH和β肌动蛋白是来自EPITOMICS(伯林盖姆、钙、美国)。多克隆抗体伯灵顿,bcl - 2, C-Raf, AKT, phosphor-AKT、ERK (MAP激酶),和phospho-ERK买来(美国贝弗利,MA)细胞信号传导等。PD98059恩佐得到生命科学(美国纽约)。

2.2。斯密的准备和隔离Tan花絮

的根源美国miltiorrhiza(2公斤)从台湾中医药房购买,用乙醇提取。法解决方案然后集中给红糖浆(290克)。过滤和无菌提取存储在−80°C进行进一步的动物实验。纯化和表征的棕褐色的花絮在我们之前已报告文献[19]。

2.3。动物

雄性Wistar鼠体重200 - 225克从Lasco购买有限公司(台湾),随机分为三组,每组三个(控制:生理盐水治疗,静,静/志诚对待)。DMN-induced纤维化组老鼠腹腔内注射静(10毫克/公斤体重;σ,圣路易斯,密苏里州,美国)每周连续三天,和志诚(10毫克/公斤体重)是口头管理为4周(每隔一天16,25]。对照组只盐水处理。在第四个星期,所有的老鼠都牺牲了。他们的肝脏切除标本是立即中性缓冲福尔马林固定在10%病理和免疫组织化学研究。涉及动物的主题研究委员会长庚大学,台湾,已经批准了这项研究。

2.4。组织学和免疫组织化学

肝脏组织中性缓冲福尔马林固定的5%是沉浸在石蜡,然后切成5μ米的部分。样品片是沾hematoxylin-eosin (H / E)和马森的三色的(MT)组织学评估。免疫组织化学与α在PBS -SM-actin(1: 150稀释;Neomarkers)是应用于标本,如前所述[25,26]。组织学变化进行评估通过使用光学显微镜(奥林巴斯BX51,奥林巴斯光学有限公司,东京,日本)在非连续,随机选择200 x 400 x组织学字段。数字显微照片被处理dp - 72(奥林巴斯、东京、日本)。

2.5。TUNEL分析

TUNEL染色进行ApopTag +过氧化物酶原位细胞凋亡检测设备(微孔)评价DNA损伤后不同治疗方法。评估是通过末端脱氧核苷转移酶介导细胞凋亡dUTP生物素缺口末端标记(TUNEL)使用4μ米厚的部分根据制造商的指示。染色和清白的细胞的数量然后计算每张幻灯片5随机选择的领域内大功率场光学显微镜下(×200放大)。

2.6。细胞培养,MTT试验

永生化大鼠myofibroblast细胞系HSC-T6是一种礼物的斯科特·l·弗里德曼博士(纽约西奈山医学院,纽约)。Waymouth HSC-T6细胞保持介质含10%胎牛血清(的边后卫)37°C在湿润的气氛中5%的有限公司₂。包含10%的边后卫HepG2细胞在DMEM培养基培养24小时(h),共1×10⁵细胞被播种在24-well板24 h和静止由孵化一夜之间介质中含0.2%的边后卫。测定细胞MTT试验可行性后前面描述的治疗与不同浓度的谭花絮24 h。可行性百分比计算(OD的药物治疗/ OD的控制样品)×100。

2.7。流式细胞仪细胞周期分析

HSC-T6细胞没有治疗或与棕褐色花絮(在不同浓度)24 h与冰冷的乙醇和固定过夜。细胞被resuspended在染色溶液含碘化propidium(π,50μg / mL)和DNase-free核糖核酸酶(100μ在37°C g / mL)在黑暗中1 h和分析fluorescence-activated细胞分选仪流式细胞分析仪(FACScalibur,正欲,富兰克林湖,新泽西,美国)。结果显示的代表三个独立的实验。

2.8。二维凝胶电泳(2 de)和图像分析

细胞颗粒随着在裂解缓冲包含7 M尿素,2 M硫脲,4%的家伙,2% IPG缓冲区(Amersham生物科学,乌普萨拉,瑞典),65毫米德勤,10毫米PMSF和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(美国AMRESCO,梭伦,哦)冰和受到声波降解法。溶菌产物离心机在10000 rpm在4°C 30分钟去除不溶性材料。上层清液的收集和使用布拉德福德的蛋白质浓度测定试验(AMRESCO)。蛋白质提取(300μg)被应用于isofocusing凝胶,在8000 V 90套。后分离,平衡,第二个丙烯酰胺凝胶电泳进行10%(美国Bio-Rad大力神,CA) 40 mA /凝胶。所有凝胶被银染色,然后扫描可视化使用映象。蛋白质斑点量化使用神童SameSpots软件(非线性动力学、纽卡斯尔、英国)。每个点强度卷(%)是处理背景减法和现货总额正常化;结果发现体积百分比用于对比组。变化在95%置信区间(2.0倍以上)被认为是统计学意义(26]。所有的实验都重复3次从三个独立的实验。

2.9。为胶液进行消化和MALDI-MS / MS分析

Silver-stained斑点切除和凝固态与胰蛋白酶消化根据先前描述的程序(26]。简单地说,25毫米NH的蛋白质减少₄HCO₃包含10毫米德勤和55毫米碘乙酰胺烷基化。然后,用胰蛋白酶消化的蛋白质(20μg / mL)在一夜之间37°C。胰蛋白酶的消化后,肽和0.5%柠檬酸和酸化装上一个MTP AnchorChip 600/384特遣部队(Bruker-Daltonik、不来梅、德国)。MALDI-MS分析进行一个Ultraflex MALDI-TOF质谱仪(Bruker-Daltonik)。光谱收集从400年拍摄每个光谱/ m / z 600 - 3000和四点内部校准的校准(m / z 956.5355, 1296.6860, 1758.9335, 2465.198)。单一同位素的肽质量被分配和主要用于Swiss-Prot序列数据库搜索与BioTools 2.2软件(Bruker-Daltonik)和吉祥物搜索引擎(矩阵科学、英国伦敦)。搜索参数设置如下:最大允许肽质量50 ppm,考虑误差1每肽不完全解理。已知的角蛋白肽质量、内部标准和胰蛋白酶被排除在外。对MS / MS,最强烈的前体离子信号/噪声比> 25后选择排除常见的背景信号。MS / MS模式是1 keV操作,和产品的亚稳分解提高激光功率检测。及数据获取与内部校准和MS / MS数据使用默认仪器校准。

2.10。免疫印迹分析

12日的溶解产物蛋白质分离或15%变性凝胶和转移膜。阻塞后,一夜之间,屁股被孵化与特定的初级抗体在4°C和进一步孵化peroxidase-labeled anti-mice或兔免疫球蛋白(Santa Cruz) 2 h。在TBST洗涤后,增强化学发光(美国CA PerkinElmer)是用于蛋白质检测。乐队强度量化使用GeneTools图像软件(英国Syngene) GAPDH和β肌动蛋白被用作内部控制(25]。

2.11。使用MetaCore生物网络分析

我们上传的蛋白质组的差异表达蛋白质识别工具MetaCore软件(GeneGo v . 5.1建立16271年,圣约瑟夫,MI,美国)来分析可能的网络参与HSC-T6 Tan-IIA引起的细胞凋亡(27]。

2.12。半定量rt - pcr

从HSC-T6细胞总RNA被隔离,单链10进行互补脱氧核糖核酸的合成μg总RNA的rt - pcr互补DNA合成系统根据制造商的指示(美国表达载体)。引物用于PCR实验在以下列出。Prohibitin: 5′-ATGGCTGCCAAAGTGTT-3′(感觉),5′-CTGGGGGAGCTGGAGG-3′(反义);β肌动蛋白:5′-TTGTCACCAACTGGGACGATA-3′(意义);5′-GATCTTGATCTTCATGGTGCT-3′(反义)。变性的条件包括94°1分钟,在53°退火1.5分钟,扩展为72°为2.5分钟。PCR进行18周期prohibitin和23个周期β肌动蛋白。每个PCR产品解决了1.5%的琼脂糖凝胶和溴化乙锭合并。记录强度被发现是数字化图像使用高分辨率扫描仪(GBOX人力资源;英国Syngene) [27]。的β肌动蛋白转录是作为内部控制规范化互补脱氧核糖核酸在每个样品的浓度。

2.13。基因沉默的小干扰RNA

HSC-T6细胞被镀上6-well板块(1×10⁵细胞/),保持24小时不使用媒介,和转染混合物Opti-MEM, 8μL / Lipofectamine 2000(表达载体、圣地亚哥、钙、美国),和0.5μ小干扰rna(模拟)或g /好炒prohibitin siRNAs(智能池;英杰公司)6 h [27]。这些siRNAs的序列可以从制造商。在转染后48小时,细胞治疗有或没有谭花絮和MTT测定细胞生存能力评估。

2.14。HSC-T6细胞间的分离

制备膜和细胞质分数如前所述执行28]。简单地说,1×10⁸HSC-T6细胞有或没有谭花絮是悬浮在冰冷的缓冲C (CNM舱蛋白分离设备,Biochain研究所)根据制造商的指示。细胞质和线粒体分数,细胞悬浮在试剂(培养细胞线粒体隔离设备,热科学),根据制造商的指示。最后,线粒体、膜和细胞质分数进行了收集和分析通过免疫印迹分析。

2.15。统计分析

SAS软件包(SAS、卡里、数控、美国)被用来分析数据。意味着使用确切概率测试群体间的值进行比较。条形图给出的意思SD。统计分析的平均值进行了使用方差分析(方差分析)在SPSS软件(美国SPSS,芝加哥,IL)。在*的差异被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。斯密对肝脏病理变化的影响一只老鼠模型中sma表达引起的静

成堆的证明表明,静能诱导肝星状细胞增殖myofibroblast-like activate-quiescent细胞导致肝纤维化。验证斯密对肝纤维化的保护作用在活的有机体内,我们有检查大鼠肝组织的组织学变化。作为H / E染色表明,肝脏的正常对照组显示完整的肝小叶结构和中央静脉和辐射肝索虽然静应用程序导致严重的肝损伤,这表现为明显的正弦充血,肝细胞大量坏死,淋巴细胞浸润(黑色箭头)。相反,志诚治疗这些病理损害明显减轻(图1(一)上面板)。再次,马森的三色的染色显示,静息导致严重的肝纤维化,大量胶原蛋白的积累与控制样本显示蓝色的信号。志诚减的脂肪变性、纤维化和胶原蛋白表达(图1(一)、较低的面板)。此外,一丝的积极信号αsma在控制老鼠的肝脏和显著增加α通过免疫组织化学染色sma决心在静息状态下接触。SMEE-treated组,很虚弱α斯密sma信号被确认,表明治疗能有效地消除引起的肝星状细胞激活静息在活的有机体内(图1 (b))。接下来,我们进一步评估肝脏组织凋亡水平在不同的治疗方法。如图1 (c),很少见TUNEL-positive凋亡细胞发生在控制样本而静接触导致温和的表达TUNEL-positive信号在肝星状细胞在肝细胞而不是。相反,积极彩色星状细胞显著增加静/志诚组比正常肝和静息组。这些发现暗示志诚可以诱导细胞凋亡在肝星状细胞而不是肝细胞DMN-induced在大鼠肝纤维化。

3.2。抑制作用和细胞毒性Tan花絮鼠HSC-T6细胞HepG2细胞

探讨医药Tan对HepG2花絮和HSC-T6细胞的影响,这两个细胞系被暴露于0 30μM 24 h, MTT比色细胞生存能力分析。在鼠HSC-T6细胞,谭花絮显著剂量依赖性地抑制细胞生长和细胞生长抑制值为7.12 50%μM在HepG2细胞的细胞生存能力没有明显抑制下谭花絮”应用程序(IC₅₀= 22.18μ米),这表明Tan花絮”能有效地降低细胞的可行性激活HSC-T6细胞在不损坏肝细胞(图2(一个))。HSC-T6激活细胞死亡通过流仪结果进一步评估。如图2 (b),只有一小部分HSC-T6对照组的细胞凋亡峰表示,只有8.27%的正常HSC-T6细胞显示一个分布在G2 / M期。治疗后3.75和5μM Tan花絮24 h,细胞凋亡和G2 / M期略有增加。在浓度为7.5μ米褐色花絮24 h,流仪分析大规模转向凋亡阶段各自的比率为58%。我们下个决心PARP和激活的乳沟还在谭IIA-exposed HSC-T6细胞在不同浓度。相应地,PARP和活动形式的蛋白水解乳沟caspase-3 (kDa 19日)和caspase-9 (40 kDa)是剂量依赖性的方式(图所示2 (c))。同时,免疫印迹分析表明Tan花絮诱导从线粒体细胞色素c的释放到胞质。在我们的实验中,COXIV被用作特定线粒体标记表示一个完整的细胞内的分数(图之间的分离2 (d))。这些结果表明,7.5μ米褐色花絮”有效的激活凋亡HSC-T6细胞通过细胞色素c / caspase-associated通路。因此,我们使用7.5μ米褐色花絮”的进一步研究。

3.3。蛋白质组学分析在HSC-T6 Tan IIA-Caused凋亡细胞和网络分析

进一步探索Tan花絮诱导细胞凋亡的分子机制的激活HSC-T6细胞,2 de概要文件连同MALDI-MS分析被用来揭示全球蛋白质Tan花絮”治疗后的变化。图3(一个)证明了控制样本的代表凝胶图像可视化银染色。总共1052个蛋白质斑点出现在二维地图和计算机辅助分析的蛋白质斑点显示13目标重要和有意义的变化。结果在所有三个重复是一致的和可再生的。三维和特写的图片选择蛋白质差异蛋白质表达(图所示3 (b))。所有13个蛋白质被MS / MS分析,明确确定,一个典型的例子是图所示3 (c)。Prohibitin最大匹配的肽,26日代表92%的序列覆盖率,为特征。光谱分析和蛋白质功能的综合结果总结在表1。进一步证实蛋白质含量的变化在谭花絮”治疗,进行免疫印迹分析。与蛋白质组学的结果,我们发现水平显著增加prohibitin控制相比,而TCTP GDIR1, 14-3-3ε(图差别表现出非凡的对这些3 (d))。同时,进行了半定量rt - pcr确定Tan IIA-caused prohibitin调节蛋白质与变化的信使rna。我们的数据表明,mRNA水平prohibitin Tan IIA-treated组显著调节的控制,揭示一个好相关的蛋白表达prohibitin通过免疫印迹分析(图3 (e))。这些结果表明,谭花絮可能增强prohibitin表达式之后通过转录和转译的水平。

评估全球交互显示差异表达蛋白质的蛋白质组分析和相关机制的意义antifibrosis Tan花絮”的影响,蛋白质通过应用MetaCore分析工具进行了分析。如图3 (f),排名前十的浓缩网络表示,与谭花絮”治疗后差异表达的蛋白质主要是参与以下过程:缺氧反应和氧化应激(),细胞cycle-G1 / S ()和细胞cycle-meiosis ()。

3.4。击倒的Prohibitin变弱HSC-T6细胞凋亡的治疗下Tan花絮

蛋白质的目标,prohibitin HSC-T6细胞显著调节下谭花絮”治疗,它被连接到不同的细胞通路,如细胞凋亡和细胞信号。因此,我们未来研究的可能作用在调制prohibitin诱导的凋亡通路Tan花絮在分子水平上。显示在图4(一)prohibitin,沉默的小干扰rna显著改善细胞凋亡细胞相比没有击倒7.5 prohibitin回应μ棕褐色的花絮。同时,不影响细胞的生存能力被发现在prohibitin废除集团对控制样本。这一发现表明,prohibitin应该至少在一定程度上参与凋亡信号由Tan花絮”造成的。

3.5。谭花絮诱发凋亡细胞死亡通过C-Raf / Prohibitin复杂介导的激活MAPK /伯灵顿/半胱天冬酶信号通路

新兴证据表明prohibitin可以绑定到C-Raf,进而激活MAPK级联。进一步解决信号事件潜在HSC-T6细胞的凋亡反应后谭花絮”应用程序中,我们调查的细胞定位和表达水平C-Raf免疫印迹分析。显示在图4 (b)谭花絮”的刺激,增加细胞内的胞质易位C-Raf观察膜蛋白质。Prohibitin,另一方面,显示主要定位在膜。在此,Na⁺/ K⁺腺苷三磷酸酶作为一个特定的膜标记来演示一个完整的分离膜和胞质分数β肌动蛋白被用作加载控制。此外,激活MAPK途径prohibitin和C-Raf复杂可能引发下游信号与诱导细胞凋亡有关。我们接下来估计MAPK的家人是否蛋白质,ERK1/2,有助于Tan IIA-induced凋亡细胞死亡。7.5后磷酸化ERK1/2(活跃)显著增加μ米褐色花絮治疗与控制,而预处理与特定抑制剂PD98059 (50μ米)显著抑制ERK1/2磷酸化刺激的花絮。在这个结果的同时,谭IIA-suppressed磷酸化与PD98059 AKT也增加了治疗,这意味着Tan花絮”通过激活ERK1/2导致细胞凋亡,阻止一种蛋白激酶信号(图5(一个))。基于我们的研究结果,谭花絮”可能直接通过激活ERK1/2 HSC-T6细胞的诱导凋亡通路,我们调查了表达水平mitochondrion-dependent proapoptotic蛋白质ERK1/2抑制剂的存在。图中所示5 (b)谭花絮可以移植伯灵顿/ bcl - 2比例伴随着促进细胞色素c表达式。此外,抑制磷酸化ERK1/2由特定抑制剂显著减弱这些蛋白质的水平。正如所料,调节的乳沟caspase-3 9和PARP由7.5μ谭米花絮”政府与此同时降低PD98059应用程序(图5 (c))。

4所示。讨论

各种中草药处方已广泛用于肝脏保护或治疗肝脏疾病(29日]。在目前的研究中,我们调查了斯密的抑制作用对肝肝星状细胞激活在活的有机体内。志诚可以有效地抑制胶原蛋白和积累α因此,-SM-actin保护肝脏免受纤维发生在静息状态下的刺激。同时,志诚DMN-activated诱导细胞凋亡的肝星状细胞,通过TUNEL检测。斯密的主要天然活性化合物是谭花絮应促使antifibrotic效果。根据我们的数据,谭花絮”表现出强烈抑制作用的可行性HSC-T6细胞HepG2细胞的细胞毒性相对温和,而这表明Tan花絮可以选择性地抑制激活HSC-T6在不损害正常的肝细胞。此外,我们表明,7.5μ谭米花絮HSC-T6激活细胞的诱导凋亡在24小时通过促进细胞色素c的释放和激活半胱天冬酶系统以及PARP的乳沟。

细胞凋亡是多因子的和复杂的过程,大量的蛋白质的动态变化会涉及(30.]。功能蛋白质组学工具可以揭示潜在的药物靶点和解决全球细胞机制通过微分蛋白资料的分析31日]。我们的结果发现,11个蛋白质斑点显示Tan花絮”治疗后显著改变强度比控制。这些蛋白质作为网络分析的输入被分成几个类别根据其已知的功能:线粒体氧化应激、细胞周期调控和细胞凋亡。蛋白质的选择描述可能诱导细胞死亡的关键HSC-T6给出如下。

第一个最高级的网络主要是负责对氧化应激的反应。有趣的是,一些活性氧(ROS)相关的蛋白质,包括PRDX2 PRDX3, PRDX6显示体积的戏剧性的变化在谭花絮曝光。这些蛋白质属于PRDX家庭与抗氧化防御尤其是肝细胞。先前的报道表明,高水平的PRDX6通常是与细胞内ROS和可以通过减少间接修复受损细胞膜磷脂peroxidized [32,33]。在我们的研究中,PRDX3和PRDX6 HSC-T6细胞显著增加后谭花絮”管理。此外,DCF荧光强度表明,谭花絮治疗明显诱导细胞内活性氧的生产与控制样本在6 h(见(图)在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2012/734987)。因此可能谭花絮促进代ROS和最终导致upregulation PRDX蛋白(34]。如果继续ROS,细胞将进一步参与细胞凋亡调节蛋白的表达,导致细胞死亡。网络分析也表明,细胞周期调控中起着关键作用Tan IIA-mediated凋亡的影响。与之前的研究一致(20.),我们已经证明,谭花絮治疗可以逮捕在G1期细胞流式细胞仪分析和诱导细胞凋亡。这些发现使我们考虑其他蛋白质的功能在antifibrotic Tan花絮”的影响。

在我们的研究中,prohibitin超表达在谭IIA-treated细胞观察,揭示了蛋白质组,免疫印迹分析和半定量rt - pcr。Prohibitin是一个丰富、广泛表达蛋白参与了多种细胞功能和可能被视为一个关键调节器将细胞生存和凋亡信号(35]。先前的研究表明,prohibitin缺陷可能与细胞凋亡有关,高水平的prohibitin可以促进细胞分化和抑制细胞增殖36,37]。然而,prohibitin的角色在细胞生存能力和生存仍然是有争议的。基于蛋白质的概要文件和ROS调查,谭花絮治疗可能引发氧化应激随后将诱导细胞的prohibitin内容见(图),H₂O₂应用程序导致upregulation prohibitin水平的1.5倍。在最近的研究中,prohibitin被确认为一个调制器C-Raf信号通路(38),我们也观察到C-Raf招募从胞质膜在谭花絮”应用程序。值得注意的是,prohibitin位于线粒体的膜是调节响应Tan花絮曝光。C-Raf蛋白质从而与prohibitin互动,充分激活。在谭活动花絮,C-Raf prohibitin复杂可能激活MEK / ERK信号通路。在我们先前的研究显示,ERK磷酸化可能导致启动p53 / p21-dependent机制,促进proapoptotic Bax蛋白的水平,抑制bcl - 2表达HSC-T6细胞(25]。这里,ERK激活其次是伯灵顿磷酸化和PARP乳沟也表示在西方墨点法数据。一致,预处理PD98059显著减毒Tan IIA-induced ERK1/2磷酸化和随后的伯灵顿激活。因此,化学PD98059最终会抑制磷酸化伯灵顿/细胞色素c-mediated PARP HSC-T6退化和细胞凋亡。综上所述,需要调节prohibitin Tan IIA-triggered凋亡通过激活C-Raf / ERK /伯灵顿/半胱天冬酶信号通路。顺序激活ERK bcl - 2蛋白水平下降导致细胞色素c的释放之后,半胱天冬酶蛋白质activaion和PARP乳沟,细胞凋亡的一种不可逆转的步骤。同时,prohibitin也被报道促进Ras / MAPK / ERK之间的串扰和PI3 K / Akt通路。因此,谭花絮强烈抑制一种蛋白激酶的磷酸化作用促进细胞存活和生长而PD98059治疗可以部分恢复一种蛋白激酶磷酸化减少Tan花絮。总的来说,这些结果暗示prohibitin调制下的抗增殖信号可能会提供一个平台Tan花絮”治疗。

C-Raf蛋白激酶Ras-RAF-MAPK通路的关键组成部分,夫妻细胞质激酶MEK和ERK细胞外信号,进而激活各种转录因子(39]。之前表示,C-Raf激活还取决于特定的域的位移14-3-3 C-Raf [40,41),和绑定14-3-3蛋白被认为是抑制Ras-mediated质膜C-Raf招聘。基于我们的研究结果,一个明显的减少14-3-3级后显示应用Tan花絮”,这可能是激活和密切相关的磷酸化C-Raf大谭花絮”引起的细胞凋亡级待遇。

Ras激活蛋白质传输信号Raf / ERK瀑布和Ras蛋白作为分子开关周期之间积极GTP-bound和蛋白形式(42]。治疗后与棕褐色活动花絮,GDP离解为ρ蛋白质抑制剂(ρGDI)抑制后续绑定三磷酸鸟苷的ρ蛋白质显著下降,表明二维地图。因此,活跃的Ras (Ras-GTP)将因此导致C-Raf激活。

5。结论

总之,我们的结果表明,谭花絮调节ERK通路进而激活伯灵顿通过上调prohibitin招聘C-Raf,同时减少14-3-3的表达和GDI以及一种蛋白激酶磷酸化。随后MAPKs-induced伯灵顿也导致了细胞色素c的释放导致半胱天冬酶proteins-dependent细胞凋亡(图6)。我们所知,没有公布的数据可用的功能蛋白质组分析Tan花絮的抑制作用HSC-T6细胞的凋亡。关键目标蛋白参与调控机制的研究在当前的研究中。

确认

作者要感谢幸田来未制药有限公司,台湾,提供乙醇提取物丹参教授Yann-Lii列伊提供Tan花絮。这项工作是由国家科学委员会的资助(nsc - 99 - 2320 - b - 182 - 015 - my3),长庚大学(EMRPD1A0881)和长庚医院(CMRPD190201和CMRPD190202),台湾。

补充材料

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