文摘

之前的研究表明,电针刺激(EA)能够减少痛觉过敏在啮齿动物模型的持续疼痛,但很少有人了解不同EA的镇痛效果和潜在的性别差异的治疗方案。在目前的研究中,我们调查了五个不同的EA治疗对肿瘤导致的影响在雄性和雌性小鼠痛觉过敏。EA应用于足三里穴位每周两次(EA-2X / 3)开始postimplantation天(PID) 3或预防性植入前三次最长最强劲和持久的antinociceptive产生影响。EA治疗在PID开始每周7只产生一个在雌性动物antinociceptive效果。EA-2X / 3的镇痛效应早在男性,但持续时间在EA的雌性表明性别差异。我们进一步证明EA-2X / 3引出明显降低肿瘤相关炎症就是明证显著减少肿瘤相关中性粒细胞在PID 7。此外,EA-2X / 3产生显著减少肿瘤相关铂族元素₂在衡量microperfusate样本。总的来说,这些数据提供证据表明EA-2X / 3治疗减少肿瘤导致痛觉过敏,这是与减少肿瘤相关炎症和铂族元素₂集中在肿瘤部位建议EA减少肿瘤伤害感受的可能机制。

1。介绍

虽然在西方医学针灸仍然是一个有争议的话题,它是广泛使用在当今临床实践(1),似乎是一个可行的选择治疗许多类型的疼痛(2- - - - - -4包括癌症疼痛[5,6)和化疗所致周围神经病变(7,8]。癌症是一种高度破坏性和渗透性的疾病导致不受控制的增殖,凋亡放松管制,侵袭性转移。多达90%的转移或晚期癌症患者将经历重大癌症相关疼痛。骨转移往往与生活质量,显著减少流动性,以及独立承受耐火材料的痛苦(9]。在泛欧洲最近的一项调查,63%的癌症疼痛患者处方止痛药有经验的突破(10]。虽然取得了一些进展试图阐明机制负责肿瘤导致骨痛(11- - - - - -13),在骨肿瘤疼痛和炎症的潜在作用机制突破痛苦是知之甚少。此外,尽管鸦片的主要癌症疼痛治疗,最近的研究表明,吗啡sarcoma-induced骨骼疼痛,加速骨质流失,自发性骨折(14]。在这方面,关键是做进一步的研究,以便更好地理解骨癌机制,炎症如何影响骨癌症恶化,如果可以找到替代治疗,缓解疼痛和减少肿瘤负荷。

虽然针灸已经存在了几千年,我们现在才开始了解其影响的机制(15尤其是那些与疼痛相关[16,17]。当我们开始研究机制针灸镇痛效果,有重要的问题关于是否出现不同的针灸治疗方案有不同的痛苦和是否存在性别差异的影响与这些治疗方案。在目前的研究中我们假设不同的治疗方案会有微分antinociceptive影响肿瘤导致疼痛。我们也想确定是否有性别差异在不同针灸治疗时间表,因为这是一个在文献中却没有得到足够关注。因此,本研究的第一部分旨在检查的有效性五个不同的EA在减少疼痛和骨肿瘤治疗方案也确定这些方案微分效应在雄性和雌性动物。

针灸似乎也影响免疫系统,因此可以直接影响炎症(18,19),包括减少中性粒细胞入侵在脓毒症(20.]。炎症在癌形成的作用进行了广泛的调查和良好的文档记录21- - - - - -23]。神经源性炎症似乎是某种形式的结肠癌(24]。在这方面,炎症状态是必要的维护和促进癌症进展和完成完整的恶性表型,包括肿瘤组织重建、血管生成、转移和天生的抗癌免疫反应的抑制(25]。而现在一些研究支持针灸减轻炎症的能力(26,27),其潜在影响的炎症阶段癌症或癌症疼痛的炎症组件没有被检查。在目前的研究中,我们假设低频电针刺激(EA)对中性粒细胞和巨噬细胞有抗炎效应招聘在早期肿瘤发展和acupuncture-induced抑制肿瘤相关炎症减少肿瘤导致痛觉过敏。为了测试这些假设,我们利用一个建立后爪骨肉瘤小鼠模型开发明尼苏达大学(28,29日在本研究的第二部分检查上面的关系在活的有机体内。

2。材料和方法

2.1。细胞

K7 M2细胞株是一种礼物从卡纳博士(30.),最初是来源于K7细胞系建立从自发小鼠噩31日]。国家文化类型的集合2472纤维肉瘤细胞克隆,最初来源于结缔组织肿瘤影响鼠标,得到来自美国类型细胞培养(马里兰州罗克维尔市)集合。每个单元格类型是同源的特定的鼠标线。细胞生长和维护符合标准的细胞培养技术。K7 M2融合细胞增长到80% -90% 75厘米²水瓶(康宁,洛厄尔,MA)在杜尔贝科的修改鹰介质(表达载体,卡尔斯巴德,CA)包含1%青霉素、链霉素和植入前10%胎牛血清。国家反恐怖主义中心的2472个细胞种植使用类似协议,强化马血清,10%碳酸氢钠,confluency 80%增长到-90%。细胞培养被安置在一个水套孵化器5%二氧化碳在37°C。

2.2。动物

本研究使用的鼠标后爪骨癌疼痛模型(13,28)检查EA在肿瘤导致痛觉的影响。共有104名女性和166名男性青年BALB / c和20名男性影响小鼠(马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所)被用于这项研究。每组动物的数量被用于每个实验中总结表1。

纯系BALB / c小鼠株用于这些实验是因为这只老鼠应变是同源的K7 M2骨肉瘤中使用这些实验,从而允许这些细胞生长的肿瘤,而被拒绝。骨肉瘤肿瘤研究在目前的调查,因为骨肉瘤是一个极其痛苦的骨肿瘤,影响儿童和青少年和一个同样痛苦的肿瘤的狗,我们想调查潜在的EA治疗osteosarcoma-induced骨痛;摘要:他老鼠用于microperfusion本研究实验,因为他们是同系的纤维肉瘤细胞用于实验。因此,BALB / c小鼠用于行为和免疫组织化学实验,而影响老鼠用于microperfusion实验。摘要:老鼠被选为microperfusion实验,因为根据初步数据我们能够获得更加健壮和可重复的结果执行microperfusion实验时纤维肉瘤肿瘤骨肉瘤肿瘤相比在活的有机体内。动物是维持12小时光/暗周期与食物和水随意。程序进行按照指南推荐的国际研究协会的疼痛,和所有实验协议批准的动物保健和使用委员会明尼苏达大学。

2.3。植入

细胞被注入准备先倒了PBS的培养基和洗涤。胰蛋白酶添加到瓶,放在孵化器3分钟。分离后,细胞悬浮在充足的培养基终止酶活性和离心10分钟1000 g。骨肉瘤、纤维肉瘤细胞在一个已知数量的PBS resuspended计数、量化血细胞计数器,颗粒状和re-suspended PBS。骨肉瘤细胞resuspended最终浓度的110⁶细胞在50μL,而纤维肉瘤细胞re-suspended最终浓度为210⁵细胞在10μL .最初,动物在有机玻璃室使用3%异氟烷麻醉在3 L / min氧气。一旦每个鼠标完全麻醉,维修率为2%异氟烷在1.5 L / min氧气维持短期植入过程。肿瘤细胞被无聊到跟骨骨使用手动注射29.5计针连接到一个无菌胰岛素注射器如前所述[0.3毫升28]。对照组BALB / c小鼠()接受注射生理盐水到跟骨骨而非肿瘤细胞。这些老鼠被用于初始行为测试。注射后,老鼠在笼子里被允许恢复加热垫。动物表现出任何的障碍(例如,移动问题,嗜睡,或大出血)或任何动物的肿瘤生长被安乐死,没有从研究中删除。这个发生在小于5%的动物用于这项研究。

2.4。行为测试

动物被放置在透明玻璃杯子线栅和允许适应了30分钟。机械过敏性测试使用·冯·弗雷灯丝# 2.83,产生62 - 95毫克的力(32),并应用于足底后爪子表面有足够的力量使它微微鞠躬。从正确的后爪,积极响应的数字共有10应用程序都被记录下来。基线·冯·弗雷测量之前获得肿瘤植入或生理盐水注入到跟骨。随后·冯·弗雷每个电针刺激治疗后30分钟测量以及3天,7、10、14、17日和21日。动物生理盐水注入跟没有收到任何EA治疗,而是作为控制肿瘤细胞移植和肿瘤导致痛觉过敏。行为评估进行了光周期期间每天大约在同一时间。执行·冯·弗雷的调查员测试动物和EA的治疗是不可见的(Tumor-EA与Tumor-Sham EA与Tumor-non-acupoint EA与没有Tumor-No EA,即。生理盐水注入)。

2.5。Transcardiac灌注

小鼠戊巴比妥钠麻醉与50毫克/公斤(戊巴比妥钠;热烈欢迎制药公司,迪尔菲尔德,IL)腹腔注射。当老鼠不再回应爪子捏,胸腔很快访问通过腹部孤立心脏。21-gauge蝴蝶导管(作秀的医疗公司,萨默塞特郡新泽西)使用钳插入左心室和担保。右心房被刺破,使排水的血液和固定剂。15毫升的冰冷PBS灌注是紧随其后的是neutral-buffered 30毫升的10%福尔马林的速度3毫升/分钟。灌注后,肿瘤被切除,后缀相同的固定剂在一夜之间在4°C,和30%的蔗糖cryoprotected 24 - 48小时之前在4°C组织切片。

2.6。Microperfusions

如前所述(执行Microperfusion肿瘤28)为了检查EA的潜在影响前列腺素E的浓度₂细胞外液的后爪纤维肉瘤。以前microperfusion研究我们实验室已经开展了关于影响老鼠,,因此,我们建立了基线水平前列腺素,细胞因子和其他潜在的疼痛介质在这个鼠标线。此外,我们发现在初步实验microperfusion技术有更高的成功率影响小鼠纤维肉瘤和骨肉瘤肿瘤在BALB / c小鼠。自后爪纤维肉瘤肿瘤影响小鼠产生一定程度的机械痛觉过敏,类似于骨肉瘤肿瘤(28),因为EA也产生镇痛效应在这个鼠标应变,我们评估了EA对前列腺素E的浓度的影响₂在纤维肉瘤肿瘤而不是骨肉瘤。短暂,我们植入灌注微探针组成的29.5计用2毫米不锈钢皮下注射针开在中间,扩展“推拉”microperfusion设计如前所述28到肿瘤部位,探针与强力胶。使用两个蠕动泵(兔+,Rainin仪器有限公司,哥伦布市哦),我们使用这个推拉技术收集肿瘤分泌物在不同时间点后EA或虚假的治疗。肿瘤与修改后的林格氏溶液灌注流量为10μl / min。初步实验确定该设置出口泵保持恒压探针开放和防止堵塞的调查。肝素(2μl)被用来防止潜在的血液凝结的探针。聚乙烯管(PE-10)是用于连接探针的蠕动泵。动物最初使用3%异氟烷麻醉在有机玻璃室在3 L / min氧气。一旦动物麻醉以爪捏,维修率为2%异氟烷在1.5升/分钟的氧气microperfusion过程期间使用。30分钟后平衡时期,分数在30分钟增量收集治疗(提单)和EA或虚假的治疗后在两个时间点。样本收集和使用蛋白酶抑制剂混合物(σ,圣路易斯,密苏里州)。然后他们被储存在−80°C供以后分析ELISA测定。

2.7。艺电刺激参数

EA,虚假的、或nonacupoint治疗、动物最初与3%异氟烷麻醉/ 3 L氧气,然后维持在2%异氟烷/ 1.5 L氧气对EA的长度,骗局,或nonacupoint过程(30分钟)。EA和sham-EA针灸组、两个不锈钢皮内针(SEIRIN-America韦茅斯,MA)的深度3毫米插入的后肢足三里Zusanli穴位位于胫骨和腓骨之间,大约5毫米外侧前胫骨结节。而不是测试多个穴位,考察其对肿瘤的影响伤害感受,我们专注于一个点,Zusanli,本研究的目的。这允许我们评估差异在EA的频率和时间应用程序中,而不是刺激的影响不同的各个穴位或同时发生的多个穴位的刺激。Zusanli穴位被选中,因为它已经被用于评估EA各种疼痛的效果在啮齿动物模型的持久性和慢性疼痛和被发现产生显著的镇痛33,34]。EA组,Zusanli穴位刺激使用Maxtens 1000双通道刺激器与4赫兹脉冲率,100年μ脉冲宽度,总共30分钟。类似的模式被用来刺激nonacupoint四组(见下面)。

2.7.1。电针刺激治疗方案

据我们所知,很少有控制的研究文献中,检验的影响不同针灸方法(参数)治疗疼痛。目前的研究调查并比较五种不同的潜在anti-nociceptive影响EA范例在足三里穴位注射治疗骨癌疼痛的啮齿动物模型。三个方案,鉴于每周两次和EA每周,基于这些临床用来治疗疼痛(5,35]。五个治疗方案如下:EA实施一次每周从PID 7 (EA-1X / 7);EA每周服用两次从PID 3 (EA-2X / 3)或PID 5 (EA-2X / 5);EA实施一次肿瘤细胞植入后1天(EA / 1次);和EA实施前3次没有治疗的肿瘤细胞植入植入后,我们指定为预防(EA Pro)治疗组。男性和女性的骨肉瘤肿瘤动物实验和控制分为以下四个组:组1:EA组治疗肿瘤,包括5组动物植入肿瘤细胞但每个接收不同的EA治疗方案如前所述(EA-2X EA-1X / 7日/ 3,EA-2X / 5, EA / 1,或EA专业);组2:sham-EA治疗肿瘤组织由5子组的动物植入肿瘤细胞,但每个接收不同sham-EA治疗方案(类似于EA前面描述的治疗方案),包括针灸针植入到足三里,但是没有应用任何电流(Sham-1X Sham-2X / 3, Sham-2X / 5,虚假的一旦/ 1,和虚假的Pro);组3:Tumor-No EA治疗组(植入老鼠体内肿瘤细胞,但没有收到EA或虚假的治疗和随后被安乐死在植入后21天;);和第四组:nonacupoint EA肿瘤治疗组(N / A-2X / 3;),每周接受两次EA nonacupoint位于基地的尾巴如前所述金等。36]。类似于第一组,non-acupoint治疗组每周接受两次EA non-acupoint网站在一段时间内的21天。

虚假的治疗包括针灸针被插入到足三里穴位为30分钟,没有应用电刺激。先前的研究表明在非穿透虚假的针没有显著差异,因此,我们遗漏的控制。(37- - - - - -39]。然而,按照推理,针灸镇痛依赖于机械针操作引发的信号,我们的假EA组针插入,但没有EA当前或机械刺激(40- - - - - -44]。

2.8。免疫组织化学的研究

因为炎症是许多肿瘤类型的一个组成部分,由于针灸已经被证明可以减少炎症,我们假设针灸可以降低肿瘤导致伤害感受通过减少炎症与肿瘤有关。在这里我们用免疫细胞化学分析EA的潜在影响对中性粒细胞和巨噬细胞在肿瘤部位。自从EA-2X / 3治疗计划提供最有效和持久的antinociceptive效果,选择这种治疗进度检查潜在的EA对肿瘤相关炎症的影响。骨肉瘤肿瘤后肢transcardiac灌注后立即被移除,后缀neutral-buffered 10%福尔马林一夜之间在4°C,然后放在cryoprotection 30%的蔗糖。连续组织切片(40微米)通过远端第三(2.5毫米),中间第三(2.5毫米),近端第三(2.5毫米)的肿瘤被横向使用低温恒温器。组织部分通过每个肿瘤分离到300年的三分之一μm增量,以避免重复计算的细胞数。这允许我们样品整个肿瘤直径(平均肿瘤直径7.5毫米)。因此,总共30部分(从中间10从远端第三,第三,从近端第三和10)通过收集每个老鼠的肿瘤和使用标准immunofluorescent程序处理。六个肿瘤部分被随机选择从每个肿瘤和被封锁的第三个1小时0.3% Triton x - 100 / PBS(图则)和5%驴血清在rt,三个随机选择组织的部分从每个三分之一的肿瘤(9节)在一夜之间被孵化在4°C鼠anti-mouse NIMP-R14 (1: 50;Abcam, Cambridge, MA)专门标签中性粒细胞。剩下的九个随机选择的组织部分从一夜之间,肿瘤被孵化鼠anti-mouse MOMA-2 (1: 50;Abcam, Cambridge, MA)专门标签单核细胞/巨噬细胞在肿瘤部位。后310分钟PBS洗,部分被孵化2小时在RT使用Cy 3-conjugated AffiniPure驴Anti-Rat免疫球蛋白g (1: 400;杰克逊免疫,西树林,PA)。部分被洗了310分钟在PBS,风干了15分钟,并使用Pro-Long黄金安装安装中包含4′,6-diamidino-2-phenylindole(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。此外,2从每个三分之一的肿瘤组织部分被用作控制和加工使用的主要或次要抗体的免疫细胞化学的过程,以确定可能的非特异性染色。

2.9。免疫细胞定量分析

中性粒细胞和巨噬细胞在肿瘤部分的量化进行了基于计算机辅助细胞计数方法最近由Vayrynen和同事(45]。外围骨肉瘤肿瘤部分从左边后分析了爪子40 x放大使用尼康Eclipse 80(尼康,梅尔维尔,纽约)显微镜来确定中性粒细胞和巨噬细胞的密度。组织部分是为了保证一致性阈值使用预设软件参数字段的视图和幻灯片之间的动物。三个随机字段选择的外围部分肿瘤的每个部分,并确定每个字段的细胞密度。总共7部分每分析了抗体的动物。另外,6控制部分进行了分析从每个动物的主要或次要抗体的免疫组织化学处理中被省略了。对于这些控制,组织孵化与PBS屏蔽解决方案没有主要的抗体或而不是二级抗体。这些部分作为控制非特异性染色。因为我们没有访问原始抗原用于生成使用的抗体在这项研究中,我们无法执行适当的吸附控制。尼康第1幕(尼康,梅尔维尔,纽约)软件被用来获取的图像进行处理。 Individual cell types (neutrophils or macrophages) were identified by a brighter immunofluorescent staining pattern visible against the darker background. In addition, we used a DAPI counterstain and H&E staining to positively identify cell types. Neutrophils were characterized by their multilobed nucleus and pink cytoplasm, while macrophages are larger cells with pleomorphic nuclei and pale gray-blue cytoplasm that often contain vacuoles. ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MA) was utilized for pixel density collection and analysis. The quantitative analysis that was performed on tumor sections was done entirely by an investigator blinded to the experimental conditions.

2.10。酶联免疫吸附试验(ELISA)测定前列腺素E₂上层清液

一个血清学testfor前列腺素使用商用执行环评工具包(Caymen化学公司,安阿伯市MI)。一个反单克隆抗体是用于microperfusate样本收集的后爪纤维肉瘤肿瘤前30分钟EA过程(确定基线浓度)以及三个连续治疗期间和治疗后30分钟的分数。样本在重复运行,在540 nm photospectrometer,使用Caymen化学公司软件和分析。这个分析是由一名调查员蒙蔽的实验条件。

2.11。统计分析

完成所有数据集进行的统计分析。使用双向方差分析比较组间进行使用Bonferroni与事后比较的方法。针对单一时间点对比组或在一个群体,一个未配对的学生以及采用。只要有必要,成对的学生的以及用于在单个时间点测试统计意义。数据分析和使用Prism 5.0画(GraphPad软件,拉霍亚,CA)。是水平的意义。

3所示。结果

3.1。肿瘤导致痛觉过敏的行为

骨肉瘤细胞植入后爪的BALB / c小鼠诱导痛觉过敏通常nonnoxious机械刺激来衡量使用·冯·弗雷单丝(2.83)相比,他们的生理盐水注入控制(图1(一));*,* *,* * *,* * * *;摘要:fibrosarcoma-induced痛觉过敏数据如图1 (b)和类似于出版之前28]。这个肿瘤导致机械痛觉过敏,所定义的数量显著增加反应·冯·弗雷单丝应用程序,显然早在postimplantation第三天(PID)和贯穿实验的持续时间。

3.2。骨肉瘤与纤维肉瘤痛觉过敏的控制

植入K7M2细胞系或国家反恐怖主义中心2472细胞株产生显著肿瘤导致机械痛觉过敏通过PID(图141 (b))。没有显著差异的两个细胞系(图之间的痛觉过敏1 (b);)。EA-2X / 3产生显著降低肿瘤导致痛觉过敏在纤维肉瘤和骨肉瘤植入老鼠。

3.3。的影响不同的治疗方案:EA治疗足三里显著减弱肿瘤导致痛觉过敏

3.3.1。EA-1X / 7 (EA实施每周开始PID 7)

EA-1X / 7产生显著降低肿瘤导致机械痛觉过敏在雄性和雌性动物明显在EA刺激后15分钟,30分钟后处理达到顶峰,回到pre-EA水平治疗后60分钟(数据没有显示)。这立即antinociceptive EA的效果也明显EA-2X / 3, EA-2X / 5和EA-once / 1对待动物,但不是在任何sham-EA对待动物。然而,当治疗的效果进行评估,EA-1X / 7(图1 (b)只在PID 7)显著衰减机械痛觉过敏在女性cancer-bearing动物相比Tumor-No EA对照组(* *)。相反EA治疗一周一次没有影响肿瘤导致男性肿瘤小鼠痛觉过敏的任何时间点测试。虚假的治疗给每周开始7天没有影响肿瘤导致机械痛觉过敏在雄性或雌性动物(图1 (c))。

3.3.2。EA-2X / 3(电针刺激开始每周服用两次PID 3)

在雄性老鼠,显著减少肿瘤导致痛觉过敏观察开始于PID 7 Tumor-No EA对照组相比,这是通过PID明显减少14。在女性肿瘤的老鼠,显著减少肿瘤导致痛觉过敏首次观察到PID 10,这一直持续到PID(图172(一个);*,* *,* * * *)。总的来说,雄性动物更敏感EA-2X与女性相比,此方案的,因此,产生较早,更健壮的男性antihyperalgesic效果。EA-2X是唯一的治疗方案产生显著的镇痛在14 PID的时间点在雄性和雌性动物,这个雌性小鼠的镇痛效应仍然通过PID 17。相比之下,虚假的EA治疗在第三天开始每周两次对肿瘤导致机械痛觉过敏(图没有影响2 (b))。

3.3.3。EA-2X / 5(电针刺激开始每周服用两次PID 5)

与EA-2X / 3治疗的效果不同,EA每周两次在PID 5日开始生产没有长期镇痛效应在雄性或雌性动物(图2 (c))。同样的,虚假的EA-2X / 5没有影响肿瘤导致机械痛觉过敏(图2 (d))。

3.3.4。EA-ONCE / 1(电针刺激管理在PID 1)

EA治疗时只给予一次PID 1显示趋势减少肿瘤相关伤害感受tumor-no EA组相比,这并没有达到统计学意义在雄性或雌性动物在任何的时间点测试(图3(一个))。虚假的EA-Once / 1对肿瘤导致机械痛觉过敏(图没有影响3 (b))。

3.3.5。EA-PRO(电针刺激接种肿瘤细胞植入前3次)

最后,早期预防性治疗产生一个健壮的antihyperalgesic效应在PID 3、7和10在雌性和雄性动物的PID 3和7比tumor-no EA雄性和雌性对照组(图3 (c);* *,* * *,* * * *)。这种antihyperalgesic效果没有在所有的时间点测试后PID 10 (PID 14、17和21)。虚假的EA给予预防性(虚假的EA Pro)没有影响肿瘤导致痛觉过敏。

3.3.6。EA控制

虚假的EA(虚假EA-Once / 1假EA-1X / 7日,假EA-2X / 3,虚假的EA-2X / 5,和虚假的EA Pro)没有显著影响肿瘤导致痛觉过敏在任何时间点测试表示之前(数字1 (c),2 (b),2 (d),3 (b),3 (d);)。EA-2X / 3产生以来最长最强劲和持久的镇痛效果,我们重复这个方案在第二组的动物被用于后续的免疫组织化学量化肿瘤内的中性粒细胞和巨噬细胞密度(见下面)。此外,由于PID 7 anti-hyperalgesic效果是明显的男性,但是女性直到第十天,这组实验只是对雄性小鼠肿瘤和控制执行。冯·弗雷分数的这组在一起的一个假象EA-2X / 3和non-acupoint治疗组(N / A-2X / 3)如图4(一)。值得注意的是刺激nonacupoint位于基地的尾巴未能产生镇痛效应在任何时间点的测试。

3.4。中性粒细胞减少但不是EA-2X / 3治疗后巨噬细胞密度

为了评估EA在肿瘤相关炎症的影响,我们利用免疫组织化学量化中性粒细胞和巨噬细胞存在于部分的密度通过参与小鼠肿瘤部位相比对待EA-2X / 3, sham-EA每周两次(Sham-2X / 3),或non-acupoint EA每周两次(N / A-2X / 3)。EA-2X / 3治疗产生显著减少中性粒细胞密度(平均数据4 (b)和5(一个)7)在肿瘤PID相比tumor-no EA (* * * *(* *),Sham-2X / 3)和N / A-2X (* * *)组。图像分析测量平均中性粒细胞密度PID 7 EA-2X / 3, tumor-no EA Sham-2X / 3, N / A-2X / 3,,,分别(图4 (b))。中性粒细胞密度由PID 14日回到观察tumor-no EA组(图4 (d);)。巨噬细胞的平均密度仍可比所有组无论时间点(;数据4 (c),4 (e),5 (b))。没有非特异性染色观察免疫组织化学控制幻灯片。

3.5。EA-2X / 3对肿瘤相关前列腺素的影响(铂族元素₂)

我们确定铂族元素₂浓度在microperfusates来自男性影响老鼠再次之前和之后30分钟的EA刺激。数据表明,铂族元素的浓度₂增加肿瘤细胞外液的网站相比,生理盐水(nontumor细胞)注入控制动物。重要的是,意味着肿瘤铂族元素₂浓度明显下降后EA-2X / 3(图的应用6)。最后,生理盐水注射对照组接受EA-2X / 3治疗还展示了铂族元素的减少₂浓度比生理盐水注入控制动物接受任何EA治疗。意思是铂族元素₂盐水浓度,肿瘤,萨尔+ EA-2X,肿瘤+ EA-2X,,,分别为(*,生理盐水+ EA-2X与肿瘤+ EA-2X;*肿瘤与肿瘤+ EA-2X;*,生理盐水和萨尔+ EA-2X)。

4所示。讨论

针灸疗法已被证明是有效的管理与癌症化疗副作用,放疗和最近一些研究显示,也可以有效地用于治疗癌症疼痛本身(5,7,35,46- - - - - -49]。然而,尽管研究记录的数量的积极影响针灸在肿瘤疼痛35]最近的两个系统评价的随机临床试验未能提供强有力支持针灸在癌症疼痛的一个重要影响50,51]。这些评论不讲针灸,因为他们的无能一样的不足和缺乏严密性在大多数acupuncture-associated随机临床试验文献中,遭受方法论的缺陷。这些缺陷包括研究设计不足,使用控制不当,可怜的报告的结果,缺乏或不足致盲、小样本大小和高估的结果。因此,建立EA的有效性的问题治疗癌症疼痛或其他类型的疼痛可能不会躺在EA方法本身,而是在设置适当的方法参数,创建适当的研究设计和样本大小和建立适当的控制5]。在这方面,有几个优势研究antinociceptive的潜在影响针灸在癌症疼痛的啮齿动物模型,因为它可以控制肿瘤的发展,样本大小,方法参数,研究设计在实验室环境。

大多数以前的研究,使用动物模型来分析潜在anti-nociceptive针灸对肿瘤导致痛觉的影响提供强有力支持的假设针灸可以缓解肿瘤导致的疼痛(6,51- - - - - -54]。使用一个骨肉瘤骨癌的模型,我们表明,不同的EA方案产生立即,但临时效果持续大约30分钟后治疗。这是一致的结果Mao-Ying et al。53)表明一个EA治疗黑色素瘤细胞在植入后8天的后爪治疗后立即产生了显著的镇痛效应达到最大效应后15到20分钟内EA。长期影响,我们只显示EA在PID两次每周开始前3或预防肿瘤细胞植入显著降低肿瘤导致机械痛觉过敏在几天到几周。小说之一,因此,本研究的结果是,不同的治疗方案产生长期anti-nociceptive结果不同,早期治疗有每周两次产生最持久的镇痛尤其是女性。Mao-Ying et al。53EA)还表明,重复治疗(每隔一天给一次从PID黑色素瘤植入后8)显示持久的镇痛效果,虽然从天16时没有治疗效果。缺乏效果当EA治疗开始后让人想起我们发现每周两次治疗开始PID 5,而不是PID 3否定长期镇痛效果。时间两者之间的差异研究(治疗PID 3开始,但不是PID对骨肉瘤5是有效和PID 8,但不是PID 16黑素瘤)可能反映了不同的肿瘤模型的结合使用(骨癌对皮肤黑素瘤)和不同的行为测试(冯·弗雷和辐射热)。在李和同事的一项研究[52),EA是足三里日常管理9天肿瘤细胞注射后,他们报告说,EA治疗显著延长爪子撤军延迟从接种后5天。同样Zhang et al。54)EA每日环跳PID 14至18在模型大鼠前列腺骨癌,看到显著抑制癌症热痛觉过敏。虽然我们没有尝试每天治疗在目前的研究中,我们的结果支持这一概念,早期和频繁的治疗(在我们的例子中EA每周两次开始3天以后给肿瘤细胞植入)对癌症疼痛有着持久的镇痛的影响。虽然我们不能使固体建议治疗人类癌症的小鼠疼痛基于目前的结果,我们的数据表明,越早开始治疗,镇痛效果会更有效。此外,一个给定的每周两次的针灸治疗方案可能比一个更有效的每周或更少。虽然我们测试的影响EA-2X / 3治疗炎症和铂族元素₂在肿瘤部位释放,我们没有测试其他的治疗方法对这些参数的影响,这可能有助于EA-2X / 3^”年代的镇痛效果。显然需要做更多的工作来确定其他的治疗方法也影响肿瘤相关炎症和/或前列腺素浓度。

除了工作的隆德和她55)没有控制的研究文献中,已经检查了不同针灸对疼痛的影响男性和女性。隆德和她55]假设性别有助于减轻疼痛的变量结果针灸,他们表明感官阈值改变了男性,而不是女性针灸治疗。我们的研究结果表明,anti-nociceptive预防性EA和EA-2X / 3治疗效果持久的雌性动物与男性相比,但EA-2X / 3开始治疗早期的镇痛效果和更健壮的雄性动物。相比之下EA-1X / 7和EA-Once / 1治疗对肿瘤导致的疼痛影响很小只有雌性动物表现出明显降低在PID EA-1X / 7治疗后7。总的来说,这些数据表明,性别差异确实存在对EA治疗和符合最近的一份报告显示男女之间不同的大脑活动在针灸治疗(56]。虽然我们的数据不是直接规定为人类的针灸治疗方法,这将表明女性癌症患者的早期治疗可能更有益,而男性可能受益于更频繁的治疗。然而,直到对EA的进一步研究性别差异在人类患者执行,这将是审慎的考虑性别和性别的因素在规划针灸治疗,针灸治疗的反应可能男人和女人之间的不同。尽管如此,关键是未来的针灸临床试验,那些失明和包括安慰剂针灸,考虑潜在的性别差异。

在过去的十年中证据积累表明有一种强烈的炎症和癌症之间的联系(17,22- - - - - -24]。Infection-driven炎症的发病机制的研究中已经涉及人类肿瘤的-20% ~ 15% (22),慢性炎症似乎进行肿瘤发生对于许多类型的肿瘤(25,57),似乎大多数肿瘤炎症组件,和增加的证据表明,白细胞浸润可促进肿瘤表型,如血管生成、增长,入侵(58]。此外,广泛的促炎细胞因子、趋化因子、前列腺素和细胞外蛋白质是密切参与癌变前的和恶性转化细胞在慢性炎症(22]。虽然这些炎症介质之间的相互作用和致癌效应细胞和肿瘤进展很复杂,很可能这些介质的释放有助于肿瘤疼痛(12,59]。

针灸刺激是为了减少炎症(60- - - - - -62年和也减少inflammatory-induced疼痛63年]。的足三里穴位被用在许多研究评估的antinociceptive影响针灸,和这个相同的穴位也被用于研究针灸的潜在抗炎能力(61年,64年]。电针刺激足三里降低cox - 2表达在疼痛和炎症模型65年]。在目前的研究中,我们发现,EA在足三里为每周两次30分钟的密度显著降低中性粒细胞在肿瘤部位,这与EA的anti-nociceptive效果。虽然我们没有确定的机制EA减少中性粒细胞密度在目前的研究中,从我们实验室以前的工作表明,EA可以减少中性粒细胞迁移到网站的炎症通过交感神经通路的激活,释放去甲肾上腺素和激活β肾上腺素能受体对抑制中性粒细胞迁移(60,66年]。同样,da Silva)和他的同事们(67年)表明,刺激SP-6穴位小鼠腹膜炎模型中抑制中性粒细胞浸润。虽然这是一个可能机制EA-induced减少中性粒细胞在肿瘤部位密度,也有可能中性白细胞密度降低了细胞凋亡,减少自通过凋亡机制中发挥着重要作用在中性粒细胞数量维持体内平衡,这是短暂的细胞和容易进入细胞凋亡(68年]。

而减少中性粒细胞在肿瘤部位密度可能是部分负责EA-associated减少肿瘤导致痛觉,这决不是整个故事。显示在图5 (b),中性粒细胞在肿瘤部位的密度回到观察肿瘤控制动物没有EA肿瘤细胞植入后14天,时间点仍有重大EA-induced anti-nociceptive影响肿瘤导致机械痛觉过敏。因此,其他14日postimplantation anti-nociceptive机制在起作用的时间点,显然不涉及减少中性粒细胞密度。另一个潜在的候选肿瘤导致痛觉是前列腺素(铂族元素₂)。组织损伤或炎症条件存在时,前列腺素合成和释放反应。我们展示了在目前的研究中铂族元素的浓度₂减少在肿瘤microperfusates EA-2X后30分钟,这是可能的,这可能是一个因素,有助于减少肿瘤导致痛觉过敏。由于铂族元素₂已被证明导致疼痛intraplantar注入老鼠体内后(69年),很可能与肿瘤有关铂族元素的增加₂有助于肿瘤导致痛觉过敏。EA-induced减少细胞外铂族元素₂集中在肿瘤部位可能是部分负责anti-nociceptive EA的效果。

5。结论

这项研究调查了五个不同电针刺激的影响(EA)治疗时间表小鼠骨肿瘤导致雄性和雌性动物的痛觉过敏。我们表明,早期和频繁的EA (EA-2X / 3)管理是有效控制肿瘤导致痛觉过敏,而治疗后和较少应用。重要的是,我们证明有性别差异与不同的治疗方案,这可能是临床治疗病人的重要考虑。在这方面两预防性EA镇痛的效果和EA-2X / 3治疗持续时间在雌性动物,而男性显示更早和更健壮EA-2X / 3治疗的反应。最后,我们提供了新的证据,EA可以减少肿瘤导致的疼痛在一定程度上减少肿瘤相关炎症和铂族元素₂生产在肿瘤部位。治疗关键是EA时间表是仔细考虑在治疗急性和慢性疼痛尤其是癌症疼痛和潜在的性别差异被考虑。显然需要做进一步的研究,以便更好地理解骨癌机制,炎症如何影响骨癌症恶化,如果替代医学治疗方法可以找到缓解癌症疼痛和减少肿瘤负荷。

术语表

PID:	Postimplantationday
EA:	电针刺激
:	前列腺素E2
凸轮:	Complementaryandalternativemedicine。

利益冲突

作者确认他们没有利益冲突与这项工作。

确认

作者要感谢伊莱恩·奥布莱恩和希瑟要画的技术援助。本研究支持格兰特(5 r01 / CA084233)在国立卫生研究院国家癌症研究所。