地塞米松抵制足细胞损伤通过稳定TRPC6表达和分布

文摘

成员TRPC6规范化瞬时受体电位通道(TRPC)亚科,是一个重要的阳离子选择性离子通道在足细胞。足细胞是高度分化的细胞位于内脏面对肾小球基底膜和无数脚流程、nephrin, podocin, TRPC6定位。足细胞之间的缝隙隔膜(SD)和相邻的脚过程形成一个选择性滤过屏障的蛋白质。TRPC6很正常足突细胞功能的关键。调查TRPC6在足细胞的功能及其与蛋白尿的关系在肾脏疾病,我们过度TRPC6在足细胞嘌呤霉素aminonucleoside (PAN)和观察到脚的变化过程,TRPC6蛋白质分布和mRNA的表达。因此,在这项研究中,我们进一步研究了特定的信号机制的作用prosurvival地塞米松(DEX)对足细胞修复的影响。我们的研究结果表明,足细胞过程overexpressing TRPC6明显减少。这些变化可以通过敏捷通过阻断获救TRPC6通道。此外,我们的结果也显示改善TRPC6安排mRNA的表达和蛋白质的细胞,减少分布。从这些结果,我们因此建议过度TRPC6在足细胞可能是根本性的变化有关的障碍SD和蛋白尿。 DEX may be maintained the structure and function integrity of SD by blocking TRPC6 signal pathway and played an important role in mechanisms of anti-proteinuria.

1。介绍

TRPC6近年来确定与蛋白尿和定位密切相关的蛋白质分子结构。蛋白尿是一种常见的肾脏功能障碍的肾小球起源和肾脏疾病的本身就是一种风险因素(1]。有越来越多的实验和临床文献显示,足细胞数量是一个重要的决定因素的发展蛋白尿和肾小球硬化症2]。锅是用来为足细胞损伤引起的细胞模型。敏捷被广泛用于治疗各种肾小球疾病的特点是足细胞损伤和蛋白尿,包括膜性肾病、微小病变性,FSGS,狼疮肾炎。然而,信号机制antiproteinuria敏捷没有定义良好的影响。在这项研究中,我们进一步研究了特定信号的作用机制保护敏捷对足细胞损伤的影响。我们的结果表明,在足细胞overexpressing TRPC6,细胞过程明显减少。这些变化可能获救的治疗细胞与敏捷阻止TRPC6通道。此外,足细胞overexpressing TRPC6敏捷处理显示改善TRPC6安排mRNA的表达和蛋白质的细胞,减少分布。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

有条件地永生的小鼠足细胞克隆(请开发部主任礼物教授彼得·蒙代尔如是说,和杰丁教授,北京大学第一医院)是培养在33°C rpmi - 1640含10%胎牛血清(美国Gibco,马里兰州),100 U /毫升青霉素、链霉素和10 U /毫升的鼠标重组r-interferon (PEPRO理工大学,伦敦,英国),然后转移到37°C的分化删除r-interferon [3]。在两周后足细胞的成熟的典型性格。在下面描述的研究,所有growth-restricted足细胞的实验研究。

2.2。实验设计

为了检查的影响敏捷PAN-induced足细胞损伤,足细胞种植生长限制性条件下12天的孵化与媒体的存在1中含有10%的边后卫μmol / L敏捷(西格玛化工有限公司)。敏捷才删除每个实验的结束。来确定敏捷降低一系列的伤病,以下实验后进行1 h(敏捷孵化:平底锅。确定引起的足细胞损伤的机制,我们接触足细胞锅(西格玛化工有限公司)的浓度为50μ克/毫升。48 h后孵化与锅敏捷的存在与否,然后观察和收获8 h, 24 h,分别和48 h。实验重复三次。

2.3。rt - pcr分析

从足细胞总RNA提取使用试剂盒试剂根据制造商的指示,和RNA浓度确定样品后溶解在diethylpyrocarbonate-treated水。孤立的RNA (1μg)每个样本的使用作梦交易受到逆转录Ace (TOYOBO有限公司日本)根据生产的协议。互补脱氧核糖核酸(3μL)是用于PCR扩增。由上海英杰公司sequence-specific引物的设计与合成生物技术有限公司有限公司引物如下使用。TRPC6上游和下游引物,分别如下。转发:5 GTTAATTGCGATGATCAATAGTT-3。反向:5-GACTTGGTACAAGATTGAAGG-3。调查:5-FAM-CCAGGAAATTGAGGATGATGCGGACGTG-BHQ1-3、产品长度是143个基点。GAPDH上游和下游引物如下。转发:5-GGTGAAGGTCGGTGTGAACGGAT-3。反向:5-CCACTTTGCCACTGCAAATGGCAG-3。调查:FAM-CTGGTGACCAGGCGCCCAATACGGCC-BHQ1、产品长度是118个基点。 The PCR amplification was started with 2 min of denaturation at 94°C, which was followed by 34 cycles (for GAPDH, 30 cycles) of denaturation at 94°C for 30 s, annealing at 55°C for 30 s (GAPDH, 55°C for 30 s), and polymerization at 72°C for 75 s (GAPDH, 30 s). The final extension lasted 7 min at 72°C and then ended at 4°C. PCR products (5 μL)分离1% ethidium bromide-stained琼脂糖凝胶和后扫描凝胶成像系统(生物Rad公司)。独立实验重复3次。

2.4。免疫印迹分析

足细胞在缓冲lyzed含有1% tritonx - 100, 150毫米氯化钠,1毫米EDTA, 50 mM Tris-HCl (pH值7.7),氟化钠1毫米,1毫米NaVO3,蛋白酶抑制剂鸡尾酒(西格玛化工有限公司)。七十五微克的总蛋白质加载运行8%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转运蛋白的凝胶成立硝化纤维素膜(西格玛化工有限公司)。然后,膜在Tris-buffered盐水冲洗Tween-20 0.02% (ttb),其次是沉浸在5%低脂牛奶。随后,膜与兔子孵化anti-TRPC6抗体(西格玛化工有限公司);鼠标anti-GAPDH抗体(σ化工有限公司)。与ttb冲洗三次后,细胞膜是孵化HRP-conjugated山羊anti-rabbit或鼠标免疫球蛋白(西格玛化工有限公司)在室温下45分钟,然后使用ECL开发化学发光试剂(西格玛化工有限公司)。特定蛋白质乐队使用微扫描和量化与GAPDH,免疫印迹检测系统(通用电气医疗集团,都圣吉尔斯,英国)。我们重复每个使用蛋白质免疫印迹分析从三个不同的和独立的实验。

2.5。疣状

TRPC6与4%多聚甲醛固定,然后permeabilized,阻塞tritonx 0.3%牛血清白蛋白- 100和5%。主要的抗体,兔子anti-TRPC6抗体(西格玛化工有限公司),是申请隔夜在4°C。FITC-conjugated山羊anti-rabbit或鼠标免疫球蛋白(西格玛化工有限公司)和核染料赫斯特被用于在室温下45分钟。最后,盖玻片被安装和图像采用免疫荧光显微镜(德国蔡司)。确定的百分比RPC6定位在细胞核的细胞,我们至少200核数在每个实验一式三份。

2.6。统计分析

数据报告为平均数±标准差与n等于实验的数量。统计评估了使用一个单向方差分析(双边检验),其次是LSD(等于方差假设)或Dunnett T3(等于方差不是假设)的事后测试两组之间,以及使用非参数测试(Mann-WhitneyU以及作为后续测试。的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。敏捷PAN-Induced足细胞变化的影响

足细胞倒置显微镜下观察和拍照。足细胞是由图像计算的相对面积J和SPSS 13.0。的细胞体和核PAN-induced足细胞明显减少。细胞,细胞间相互连接,像树枝伸出。脚过程出现收缩,PAN-inducted足细胞的面积显著减少到75%在8 h ();脚的过程显然是收回,细胞体在24小时降低到46% ();缩水至27% (),脚过程的一部分发生失踪或丢失在48 h。然而,敏捷的待遇后,足细胞的面积也显著大于8 h, 24 h, 48 h,差异显著()。基于这些发现,我们开发了PAN-induced损伤可能预防敏捷的假设。图1。

3.2。敏捷对Pan-Induced TRPC6 mRNA的表达

TRPC6 mRNA结果表明目标乐队中可以看到第三和第四的车道(150个基点)。我们的研究表明,有Trpc6 mRNA表达3日和4日的样本,但是表达很低,建议Trpc6 mRNA表达很低在正常情况下,不能由琼脂糖凝胶电泳显示。TRPC6 mRNA表达没有显著改变在PAN-induced 8 h和24 h。但TRPC6 mRNA表达显著增加在48小时();TRPC6 mRNA表达并没有显示出显著变化DEX-treated 8 h;TRPC6 mRNA表达显著减少在24小时和48小时()。图2(一个)。

在正常情况下,TRPC6在足细胞表达很低。GAPDH作为内部控制,与对照组相比,发现TRPC6 mRNA表达PAN-induced 8 h后没有明显改变。但TRPC6 mRNA表达略有增加24小时和48小时();TRPC6 mRNA表达显著减少DEX-treated 8 h后,24小时和48小时(),数据2(b)和2(c)。

3.3。敏捷对PA-Induced TRPC6蛋白表达

免疫印迹分析表明,TRPC6 GAPDH,分别有特定的乐队在36 kd和106 kd。在正常情况下,足细胞有一定量的TRPC6蛋白表达。与对照组相比,TRPC6蛋白表达PAN-induced 8 h没有明显变化,但在24小时和48小时();TRPC6在DEX-treated 8 h蛋白表达没有明显改变;在24小时下降;成为正常的()。蛋白表达显著降低了48小时(),数据3(一)和3(b)。

3.4。敏捷对PAN-Induced TRPC6分布足细胞的变化

TRPC6在控制线性和均匀分布,小在细胞质中;PAN-inducted 24 h, TRPC6不连续性分布在细胞膜,细胞质增加;在48 h, TRPC6分布在细胞膜,增加细胞膜的一部分丢失或聚集成颗粒,广泛分布在细胞质中。但DEX-treated后,TRPC6,显著提高在不同的时间点,更均匀分布在质膜,成为正常。图4。

4所示。讨论

TRPC6属于大瞬时受体电位总科的非选择性阳离子通道(4,5]。这个总科由一群六跨膜离子通道domain-containing,分为6个亚科;TRPC3;TRPC6, TRPC7大约有75%的同源性,共同构成heteromeric聚合物,并形成功能通道(6]。首先,韦恩et al。7)和Reiser et al。2),2005年,确定致病基因之一导致家族性局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)。进一步的研究表明,TRPC6蛋白质和SD分子之间相互作用,共同构成隔膜孔复杂。这一发现将使足突细胞结构蛋白和离子通道联系在一起。最近的研究也表明,TRPC6在脚过程中表达。TRPC6在足细胞的胞体和在初级过程密切附近SD与nephrin, podocin, CD2AP [8]。TRPC6是一个组件的SD multiprotein复杂,参与足细胞的生理和病理生理的作用9]。

糖皮质激素被广泛用于治疗肾小球疾病的特点是足细胞损伤和蛋白尿10]。有人推测,糖皮质激素通过免疫抑制和抗炎机制起到治疗作用[11]。脚的过程和SD为肾小球过滤的形成做出贡献。它扮演着一个重要的角色在维持足突细胞的功能。足突细胞损伤可能导致泄漏的蛋白质进入尿液。所以损伤足细胞和他们的SD通常会导致明显的蛋白尿。锅,足突细胞毒素,是广泛用于诱导大鼠实验性肾病综合症(12- - - - - -14),在体外研究中,潘脚过程中结果抹杀和可变剂量依赖性凋亡[15]。作为一种新的SD分子,TRPC6是一个重要的分子保持足细胞的结构和功能以及调节信号转导在足细胞和其他SD分子相互作用,如nephrin podocin, CD2AP [16- - - - - -18]。赖泽等人发现TRPC6在足细胞表达膜。nongenetic形式的肾小球疾病,如微小病变性(非传染性疾病),膜性肾小球肾炎(MGN)和FSGS, TRPC6 overexpresion可以直接影响足细胞的细胞骨架组织(19]。莫勒等人也发现TRPC6超表达与足细胞损伤的发展。所有这些表明,TRPC6超表达是导致足细胞损伤的关键因素。PAN-injected老鼠,TRPC6水平显著增加(19]。推倒TRPC6可以有效防止足细胞凋亡引起锅(12]。盘脚过程中结果抹杀和可变剂量依赖性凋亡[20.,21]。基于这些发现,我们假设TRPC6也参加PAN-induced足细胞损伤。敏捷抵制足细胞损伤通过稳定TRPC6表达和分布。我们研究的主要目的是确定是否敏捷介导的特定cytoprotective效应通过阻断TRPC6-signaling通路和阻塞TRPC6渠道也许有利于保护足细胞免受损伤。

我们的研究发现,在PAN-induced DEX-treated 8 h, TRPC6蛋白表达无显著变化。但明显高于PAN-inducted 24小时和48小时();在DEX-treated TRPC6蛋白表达显著降低24小时和48小时()。免疫荧光染色显示TRPC6显示一个线性均匀分布在对照组,一点点在细胞质中;PAN-inducted 24 h, TRPC6主要是点状的分布在细胞质膜和增加。在48 h, TRPC6分布在细胞膜,增加部分丢失,聚集成颗粒,广泛分布在细胞质中;TRPC6更敏捷治疗后均匀分布。细胞质的分布明显较弱。足细胞的区别,这是与其他分子,是TRPC6在PAN-inducted足细胞表达增强,DEX-treated后的分配增加而减少。这是TRPC6作为阳离子通道蛋白的特殊地位。但具体机制不是很明确,有待进一步研究。我们的研究结果表明,TRPC6可能是药物的目标在未来维持足细胞的功能。 So blocking TRPC6 channels may be a new therapeutic strategy in proteinuric renal diseases.

我们的证据也表明,阻止TRPC6通道可能是蛋白尿的治疗中获益。这创造了令人兴奋的可能性,阻断TRPC6通道内的足突细胞可以转化为持久的临床患者FSGS好处。充满了我们的研究表明,TRPC6损伤信号,诱导的锅,然后激活下游分子,造成了损伤信号转导,所以脚过程响应收回和丢失。TRPC6异常表达和分布导致失衡TRPC6渠道和函数。足突细胞滤过率的变化引起蛋白尿的发生;敏捷可能使下游分子,已被激活,灭活,足细胞恢复原有结构通过阻断TRPC6信号通道,从而维护SD结构和功能完整性通过稳定TRPC6表达式,并在anti-proteinuria起到了保护作用。

总之,TRPC6超表达可能在足细胞的一个根本性的变化导致蛋白尿和肾功能的损害。也许,阻塞TRPC6通道可能是肾脏疾病的诊断和治疗目标候选人。我们的研究表明,TRPC6信号通路参与敏捷的信号转导机制抑制足细胞损伤引起的。敏捷稳定TRPC6通过绑定到其受体表达。我们的研究将提供更清楚的分子机制的理论基础敏捷antiproteinuria也提供新的见解特别有益的敏捷对足细胞损伤的影响。

信息披露

作者宣称他们的合作者和贡献同样这项工作。

利益冲突

作者宣称没有利益cinflict。

确认

这项工作得到了广东省自然科学基金项目(项目号5000424),广东省(没有的技术项目。2005 b36001019),广州的科技研究项目(没有。2006 z3-e0231)。作者感谢教授Peter Mundel(美国)和杰丁教授(北京大学第一医院)足突细胞克隆。他们感谢广州第一市医院中心实验室的技术帮助。

引用

1. k . Zandi-Nejad a . a .艾迪r . j . Glassock和b·m·布伦纳“为什么蛋白尿是一个不祥的肾脏疾病的生物标志物吗?”肾脏国际,补充,卷66,不。92年,S76-S89, 2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. j .赖泽k . r . Polu c·c·穆勒et al .,“TRPC6是肾小球缝diaphragm-associated通道所需正常肾功能,”自然遗传学,37卷,不。7,739 - 744年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. j . Reiser开发部主任p·蒙代尔如是说,a z . m . Borja et al .,“重组的细胞骨架和细胞接触诱导分化过程中出现的工艺条件不灭的老鼠足突细胞细胞系,”实验细胞研究,卷236,不。1,第258 - 248页,1997。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. c . Montell“TRP总科的阳离子通道,”科学的抽烟可以,卷2005,不。272,p . re3 2005。视图:谷歌学术搜索
5. 即美国拉姆齐、m . del和d·e·克拉珀姆“介绍TRP通道”年度回顾的生理卷,68年,第647 - 619页,2006年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. a·迪特里希h . Kalwa b·r·罗斯特和t . Gudermann”的diacylgylcerol-sensitive TRPC3/6/7亚科的阳离子通道:功能特性和生理相关性,”弗鲁格档案欧洲生理学杂志》上,卷451,不。1,第80 - 72页,2005。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. m·p·韦恩,p . j .康伦k . l . Lynn et al .,“医学:TRPC6阳离子通道的突变导致家族性局灶性节段性肾小球硬化症,”科学,卷308,不。5729年,第1804 - 1801页,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. j .赖泽k . r . Polu c·c·穆勒et al .,“TRPC6是肾小球缝diaphragm-associated通道所需正常肾功能,”自然遗传学,37卷,不。7,739 - 744年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. c·c·穆勒,c, m . m . Altintas et al .,“感应TRPC6频道收购形式的proteinuric肾病,”美国肾脏病学会杂志》上,18卷,不。1,29-36,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. t .和田j . w .皮平c·b·马歇尔s . v .格里芬和s . j .让“地塞米松预防足突细胞嘌呤霉素诱导细胞凋亡aminonucleoside: p53和Bcl-2-related家族蛋白的作用,“美国肾脏病学会杂志》上,16卷,不。9日,第2625 - 2615页,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. t .和田j . w .皮平m . Nangaku和s . j .让“地塞米松prosurvival好处的足细胞需要细胞外signal-regulated激酶磷酸化,”肾元、实验肾脏学,卷109,不。1,pp. e8-e19, 2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. 朱x, z, z, x, f .他和c,”效应的下调TRPC6在嘌呤霉素aminonucleoside-induced小鼠足细胞凋亡,”华中科技大学学报医学科学卷,29号4、417 - 422年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. 黄懿慧Kim m . Goyal寇尼特d . et al .,“足突细胞耗竭和PAN-treated鼠肾小球硬化症有直接关系,”肾脏国际,60卷,不。3、957 - 968年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. c . x, z h·陈,c . h .曾w·s·秦,l·s·李和z h . Liu”Triptolide保护足细胞从嘌呤霉素aminonucleoside诱导损伤体内和体外,”肾脏国际,卷74,不。5,596 - 612年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. j . s . f . Liu叮,问:f .风扇和h张“嘌呤霉素引起的足细胞损伤模型的建立aminonucleoside,”北京保达雪雪,40卷,不。6,586 - 589年,2008页。视图:谷歌学术搜索
16. w·Kriz“TRPC6——一个新的足突细胞基因参与局灶节段性肾小球硬化症,”分子医学的趋势,11卷,不。12日,第530 - 527页,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. m . Estacion w·g .辛金说道,s w·琼斯·m·a·b·阿普尔盖特和w·p·先令,”人类TRPC6表示HEK 293个细胞形式的非选择性阳离子通道有限的Ca^{2 +}渗透。”生理学杂志,卷572,不。2、359 - 377年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. h·张,j .丁问:风扇,s .刘”TRPC6老年病和II-induced足细胞凋亡可能源于ERK激活和NF -κB易位”,实验生物学和医学,卷234,不。9日,第1036 - 1029页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. c·c·穆勒,c, m . m . Altintas et al .,“感应TRPC6频道收购形式的proteinuric肾病,”美国肾脏病学会杂志》上,18卷,不。1,29-36,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. t .和田j . w .皮平c·b·马歇尔s . v .格里芬和s . j .让“地塞米松预防足突细胞嘌呤霉素诱导细胞凋亡aminonucleoside: p53和Bcl-2-related家族蛋白的作用,“美国肾脏病学会杂志》上,16卷,不。9日,第2625 - 2615页,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. j . s . f . Liu叮,问:f .风扇和h张“嘌呤霉素引起的足细胞损伤模型的建立aminonucleoside,”北京保达雪雪,40卷,不。6,586 - 589年,2008页。视图:谷歌学术搜索

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