文摘

尤金尼亚uniflora被称为Pitanga樱桃灌木,主要分布在热带和亚热带美洲。这种植物是种植在许多国家和适用于生产果汁,冷冻纸浆,和茶。此外,它可以用作治疗炎性疾病。我们报道了一个富含黄酮类分数(HE-Bu)从叶子减少引起的致命性盲肠的结扎和穿刺(CLP),脓毒症的临床相关的模型。的口服HE-Bu后期死亡率减少了30%,预防中性粒细胞积聚在肺部,降低TNF -α和il - 1β血清水平,显著降低伊诺和回肠cox - 2蛋白表达的细胞。化学调查显示杨梅酮、槲皮素rhamnosides这个分数的主要组件。结果表明,HE-Bu保护小鼠脓毒症和表示,这个可食植物产生的化合物可以被视为潜在的佐剂对脓毒症治疗。

1。介绍

尤金尼亚unifloral .(桃金娘科)是一种热带和亚热带灌木广泛分布在美国国家(1]。这是通常被称为Pitanga樱桃或巴西樱桃。关于其对人类健康的影响,水果和树叶都是用作民间医药治疗疾病相似,虽然树叶显示的优点是常年不断,而今年水果可以在短时间内(2]。新鲜或干的叶子已经使用经验医学,自15世纪(3),治疗炎症和胃部疾病,风湿病,发烧,和高血压4,5]。一些研究已经证实尤金尼亚uniflora具有抗炎、抗菌和抗真菌特性(4,6- - - - - -8]。这些利益通常归因于许多次生代谢产物的存在出现在叶子,其中包括许多挥发性类萜油,类黄酮,和浓缩hydrolysable单宁,leucoanthocyanidins,类固醇和/或常用药用(9]。

提出了类黄酮在许多植物提取物,不断药理研究的重点。尽管他们很好抗氧化活性(10- - - - - -12),他们表现出许多其他属性,如抗炎、抗菌,抗衰老,抗癌,抗过敏药,hypocholesterolemic血管舒张,(10- - - - - -15]。在一起,类黄酮的抗炎和抗氧化性质可以解释植物提取物对各种疾病的功效,如骨质疏松症和风湿病(15]。治疗内容属性归功于黄酮类大肠uniflora对炎症性疾病被报道,但不是处理这种植物的能力在降低死亡率由实验败血症引起的,这与炎症密切相关(16]。

脓毒症是一个重要的健康问题,发病率和死亡率的主要原因在许多重症监护病房。这种情况的特点是促炎介质的生产过剩,这经常发生各种有毒伤害后,尤其是细菌感染,由于腹部手术,阑尾炎,缺血性肠溃疡、穿孔或17]。

脓毒症的常见原因是暴露在脂多糖(LPS),革兰氏阴性细菌膜的结构组件,或肽聚糖和lipoteichoic酸、结构组件的革兰氏阳性细菌的膜(17]。主要临床症状包括发热、低血压、vasoplegia,中性粒细胞浸润,可能导致多器官功能障碍并最终死亡。细菌组件在血液中引起各种炎症介质的过度免疫系统的细胞,如interleukin-1β(il - 1β)、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)、白细胞介素- 6 (il - 6)、interleukin-8(引发)、一氧化氮(NO)和前列腺素类。这大量的炎症介质被认为导致感染性休克和死亡率(18]。

因此,植物化学的分析获得富含黄酮类的零头尤金尼亚uniflora离开了,这个分数的生物学性质,如对死亡率的影响,中性粒细胞迁移,细胞因子的水平,和伊诺和cox - 2组织表达,用小鼠脓毒症模型进行评估。

2。材料和方法

2.1。植物材料

新鲜的叶子尤金尼亚uniflora收获在联邦大学的校园Centro Politecnico巴拉那河、库里提巴,公关,巴西。工厂是根据一个真实的示例沉积的同一大学的植物学凭证标本存放的地方。

2.2。样品制备
2.2.1。化合物的提取和分离的树叶

新鲜的叶子大肠uniflora(100克)在300毫升的两次提取n己烷回流。提取相结合,在室温下干燥(~ 22°C),并存储在−20°C。树叶残提交hydroalcoholic提取,在300毫升乙醇70% (v / v),重复三次。提取过滤掉,结合,干下减压,给原油hydroalcoholic提取(他)。

他被极性程度分级使用液-液分区如下:1 g是溶解在H2O(200毫升),添加CHCl紧随其后3(200毫升)和激烈的搅拌。混合物被卸载漏斗,直到两个阶段的形成,分离。的CHCl3分数(HE-Chl)干下减压和储存在−20°C。额外的200毫升的水部分完成了乙酸乙酯,紧随其后的是相同的分离过程,形成一个有机的分数(HE-EA),蒸发和存储。随后,n丁醇(200毫升)添加到剩下的水层,混合,和分离的两个新阶段:丁醇(HE-Bu)和水(HE-Aq),蒸发压力降低和存储,另外,−20°C。

2.2.2。化学衍生化

为了确定它的化学成分,这些碎片HE-Bu(2毫克)甲酸水解在0.5毫升的45% (v / v) 14 h, 100°C (19]。样品是干下N2流,然后混合在一起n-butanol-H2O (1): 1, v / v),产生两层分离,蒸发了。有机层由液相色谱分析评估,而水是提交给NaBH连续下降4和乙酰化pyridine-acetic酐(200μL;1:1,v / v)分析单糖成分,通过气相色谱分析-质谱法(gc - ms) [19]。

2.3。分析方法
2.3.1。超高液相色谱-光谱法(UHPLC-MS)

这是在一个Acquity-UPLC系统(美国水域,MA),由一个二进制泵、样品管理器,柱温箱。检测提供了一个光电二极管阵列检测器(PDA)和三重四极,喷雾电离质谱(质)Quattro LC(美国窟,MA)。分离是水域BEH-C18列上,50×2.1毫米长度和1.7μ米颗粒大小,使用作为溶剂,甲酸1% (v / v),甲醇溶剂B。样品在室温(22°C)举行,柱温箱保持在60°C。使用的溶剂B是一个梯度,从0%到40%,超过7分钟,然后到80%在10分钟,支持初始条件(溶剂100%)11分钟,流量为400μL·敏−1。示例HE-Bu·毫升(1毫克−1)在MeOH-H溶解2O (1): 1, v / v)。注入的体积是3μL和检测提供了PDA (200 - 400 nm)和质(m / z100 - 1100)。电喷雾质谱的能量被设定在2.5 kV毛细管和55 V锥(负离子模式)。串联是通过碰撞诱导dissociation-mass谱(CID-MS),使用氩作为碰撞气体。碰撞能量范围从50到80 eV。

2.3.2。气相色谱分析-质谱法(gc - ms)

这是瓦里安土星2000 R,配备了毛细管柱db - 225 ms (J&W), 30米长。质谱是由离子陷阱探测器,与电子电离(EI)操作70 eV。之前每个单糖转化为醋酸alditol和标识使用真实的标准。

2.4。动物

瑞士男性白化小鼠(3个月大的时候,重25 - 30 g)从联邦大学的巴拉那河被用于生物测试。他们保持在标准实验室条件下,在12 h光/暗周期和温度控制( °C)。标准颗粒食品(Nuvital,库里提巴,公关,巴西)和水随意。所有实验程序以前大学机构伦理委员会的批准(授权编号430)。

2.5。试验协议
2.5.1。通过盲肠的结扎和穿刺过程诱发败血症(CLP)

小鼠随机分为5组,包含10个/组小鼠:虚假的操作;CLP +车辆(水+乙醇3%;订单);CLP + HE-BU 75 mg·公斤−1订单。CLP + HE-Bu 150 mg·公斤−1订单。CLP + HE-Bu 300 mg·公斤−130,订单管理μL的治疗方案,关于动物的肉体的权衡(~ 30 g)。氯胺酮(80 mg·公斤−1)和甲苯噻嗪(20毫克公斤−1)腹腔注射麻醉手术前的老鼠。如前所述Polymicrobial脓毒症诱导了CLP (20.]。中线切口~ 1.5厘米进行腹部。盲肠仔细孤立和远端50%的结扎。盲肠被戳破了两次与无菌针20量度和挤压挤出伤口的粪便。盲肠取代,两层的腹部被关闭。Sham-control处理动物是完全相同的,但是没有盲肠的结扎或穿刺。每个老鼠收到皮下无菌生理盐水注入液体复苏手术后(1毫升)。老鼠被放置在一个加热垫,直到他们从麻醉中恢复。食物和水随意在整个实验过程中提供。存活率为7天监测,每12 h。在此期间,车辆(水+ 3%乙醇)是口头的日常管理。

在接下来的实验中,1 h在手术之前,老鼠口服治疗车,HE-Bu(75、150、或300毫克公斤−1,订单),和6 h后术后,所有老鼠都牺牲了。他们的组织从肺,小肠(回肠)和血液收集和冷冻供以后使用,以确定髓过氧化酶(MPO)活动和调查血清中细胞因子的生产和伊诺和cox - 2组织表达。地塞米松,一种抗炎药物,类固醇是用于控制和管理皮下注射剂量为0.5毫克/公斤。

2.5.2。肺MPO活性

MPO活性,中性粒细胞涌入的评估,确定了根据建立协议(21),6 h后术后。简而言之,肺组织均质在0.5毫升的50 mM钾缓冲pH值6.0与0.5%溴化hexadecyltrimethylammonium,用冰,然后在14000转离心15分钟在4°C。上层清液稀释(1:20)在反应缓冲区(9.6毫米3,3,5,5-tetramethylbenzene 150 nmol·L−1H2O2在50 mM磷酸钾缓冲)和阅读在620海里。结果表示为光密度变化每毫克的蛋白质(以布拉德福德试验)。

2.5.3。测定细胞因子水平

肿瘤坏死因子-α(TNF -α)和白介素(IL) 1β浓度测定小鼠血清使用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(研发系统,明尼阿波利斯,美国)根据制造商的指示。

2.5.4。免疫印迹分析

回肠样本与PBS洗两次,然后匀浆和细胞溶解提取缓冲(作文mM:三羟甲基氨基甲烷/盐酸20(液pH值7.5;150年QBiogene),氯化钠,Na3签证官4氟化钠、焦磷酸钠10日20日,冈田酸0.01(σ),平板电脑的蛋白酶抑制剂(罗氏),和1% Triton x - 100 (QBiogen))。总蛋白(20μg)分离8% SDS-polyacrylamide(σ)凝胶在80 V 2 h。被分离出蛋白质electrophoretically到聚乙二烯二氟化物膜(Bio-Rad)在100 V 120分钟。膜被封锁阻止缓冲区包含3%低脂奶粉、Tris-buffered生理盐水(Bio-Rad),和0.1%渐变20(σ)(TBS-T) 1 h。膜被孵化的主要抗体伊诺和cox - 2(1: 1000稀释),一夜之间在4°C。洗后,膜被孵化与二级抗体(peroxidase-labeled anti-mouse免疫球蛋白,稀释1:5000)在室温下60分钟。检测β微管蛋白的蛋白质被用于标准化和量化伊诺和cox - 2。Prestained标记(英杰公司)是用于分子质量决定。免疫反应性的乐队是由增强化学发光检测(Bio-Rad)。

2.6。统计分析

数据表示为意味着±SE 5或10为每组小鼠检查。统计误差是由单向方差分析;事后测试是Bonferroni。计算Graphpad Prism 5.0执行。P值< 0.05被认为是重要的。生存分析比较由logrank测试。这些计算进行与SigmaStat v3.10 (Systat软件公司、里士满、钙、美国)。零假设被拒绝时 。

3所示。结果与讨论

尤金尼亚uniflora已经知道目前的各种有利影响包括抗菌,抗真菌,退热剂;抗氧化、抗炎和antinociceptive活动(4,6- - - - - -8]。然而,没有报告的能力大肠uniflora减少实验脓毒症的结果,尽管其消炎和抗菌活性。脓毒症是在这项研究中,一个幼童腹壁薄弱引起的小鼠盲肠的结扎和穿刺(CLP)调查富含黄酮类的影响获得的分数尤金尼亚uniflora叶子(HE-Bu)。这个CLP模型模仿人类,脓毒症来自肠道病原体引起的,这被认为是与临床密切相关的情况(17]。

明显观察到杀伤力是延迟与HE-Bu小鼠口服管理(见图1(一))。老鼠接受车辆开始死在12 h和24小时CLP后,死亡率达到26.7%和60.0%,此前36 h和96 h CLP后,分别。总体死亡率在这个组,在观察期结束后,为73.3%,和相应的曲线下的面积是8.117(任意单元)。的杀伤力明显延迟与HE-Bu小鼠口服治疗。他们的曲线下的区域增加到12.420,12.726,和12.492治疗后HE-Bu 75, 150和300 mg·公斤−1,分别。在研究结束时,这些HE-Bu团体的整体存活率为25%,50%,57%。没有死亡发生sham-operated老鼠和其相应的杀伤力曲线下的面积值为16.800(任意单位)。这个结果可能归因于抗炎活性,这与先前的文献的研究结果是一致的(5]。

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(b)
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图1
HE-Bu获得尤金尼亚uniflora叶子防止sepsis-induced杀伤力和抑制髓过氧物酶活动(测量后6 h术后)。(10动物/组)小鼠口服接种不同剂量的HE-Bu(75、150或300 mg·公斤−1)、汽车(3%乙醇)或地塞米松(0.5 mg·公斤−1南卡罗来纳州)。MPO图:值代表±SEM手段。* * * ,* * 指示值与中电+车辆集团;# # # CLP +车辆与骗局。方差分析Bonferroni测试紧随其后。由logrank生存图:生存分析比较测试。这些计算进行与SigmaStat v3.10 (Systat软件公司、里士满、钙、美国)。零假设被拒绝时 。

相信脓毒症可能会导致异常的炎症反应,导致细胞损伤和器官功能障碍。嗜中性粒细胞浸润是一个重要的病理生理的改变与脓毒症有关。这些细胞造成直接损害组织通过释放炎性介质、细胞因子,superoxide-derived自由基,溶酶体酶,如MPO、放大系统性炎症反应,引起多器官功能衰竭(22]。

考虑到MPO溶酶体酶,由多形核白细胞,和相关的生产次氯酸(强大的氧化剂),HE-Bu治疗MPO活性的影响也被研究。CLP手术明显增加肺组织MPO水平与虚假的组(46.9%)(图1 (b))。组织MPO的增加显著预防HE-Bu 150和300毫克/公斤,抑制的37.2%和57.6%,分别与汽车集团(图1 (b))。地塞米松、抗炎药用于控制强烈的MPO活性抑制肺(54.2%)。因此,HE-Bu阻止了海拔MPO活性,间接表明减少中性粒细胞招募回肠,也在氧化组织损伤(图1 (b))。这是特殊的意义,因为氧化应激被称为肠道粘膜屏障功能障碍的可能机制在脓毒症状态,放大和延续最初的系统性炎症反应23]。

一些先前的研究已经表明,一些细胞因子,特别是TNF -α和il - 1β与脓毒症综合征密切相关;因此,抑制促炎细胞因子在脓毒症早期生产过剩可能会减少其风险(17]。在这项研究中,TNF - HE-Bu能够明显减少α以及il - 1β血清水平(数据2(一个)和2 (b)),它可能与死亡率降低。

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图2
HE-Bu获得的效果尤金尼亚uniflora在肿瘤坏死因子-α(一)和il - 1β在感染的小鼠血清(b)生产。老鼠,除了虚假集团收到车辆,HE-Bu 75, 150。和300 mg·公斤−1(订单)或地塞米松(0.5毫克公斤−1南卡罗来纳州。),管理1 h CLP手术前,和细胞因子水平进行评估发病后6 h。每组代表均值±SEM四到五的动物。* ,* * 和* * * 指示值与中电集团+车辆;# # 和# # # CLP +车辆与骗局。方差分析Bonferroni测试紧随其后。false-operated组(假的)也提供这个测试。

肿瘤坏死因子-α和il - 1β细胞因子水平降低虚假手术控制老鼠。相比之下,6 h CLP手术后,细胞因子显示增加了50.8%和50.2%,分别比虚假的组(数字2(一个)和2 (b))。HE-Bu显示显著减少细胞因子治疗生产与生理盐水组。HE-Bu·150和300毫克公斤−1肿瘤坏死因子的水平——减少α33.6%和38.8%,il - 1的水平β也抑制了32.3%和38.5%,分别。肿瘤坏死因子水平的增加α和il - 1β有显著预防地塞米松(0.5 mg·公斤吗−1),大约有44%的抑制在这两种情况下,与汽车相比集团(数字2(一个)和2 (b))。

除了细胞因子、一氧化氮(NO)和类花生酸也参与过度促炎介质响应在脓毒症。生产过剩的没有诱导一氧化氮合酶(间接宾语)与脓毒性休克,视为败血症的病人死亡率的主要原因(22]。伊诺是诱导炎症反应刺激如细菌脂多糖(LPS)和促炎细胞因子(如il - 1、TNF -α)。一旦表示,伊诺产生大量的不长时间,造成细胞损伤。化合物抑制伊诺表达式或伊诺活动有抗炎作用,其影响的基础上,在各种形式的实验诱导炎症(24]。

另一个重要的炎症细胞的先天免疫系统cyclooxygenase-2 (cox - 2)。这诱导同种型环氧酶酶催化的形成炎症前列腺素类,如前列腺素、血栓素,它可以调解一个重要的炎症反应。系统性cox - 2越来越被认为是一个重要的球员sepsis-induced炎症。事实上,COX-2-deficient老鼠免受sepsis-induced炎症和死亡(25]。

在这项研究中,我们检查了HE-Bu的影响,通过免疫印迹,伊诺和回肠细胞cox - 2表达的感染性老鼠。HE-Bu(75、150和300毫克公斤−1伊诺的水平降低了35.2%,33.5%,和75.5%(数据3(一个)和3 (b))。cox - 2表达降低了12.7和62%,与高剂量的HE-Bu对待动物。地塞米松显著影响伊诺和cox - 2表达,分别减少了69.5%和80.8%(数据3(一个)和3 (c))。这些结果清楚地表明,HE-Bu能够降低的水平研究促炎的酶(伊诺和cox - 2)的作用是越来越认可在脓毒症的病理生理学。

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图3
HE-Bu从大肠uniflora抑制伊诺(b)和cox - 2 (c)表达在回肠受感染的老鼠。老鼠接受HE-Bu 75、150或300 mg·公斤−1、汇票或地塞米松。伊诺和cox - 2的水平取决于免疫印迹分析。代表免疫印迹(a)。结果显示为±SEM 2到3种不同的实验手段。# # # CLP +车辆与骗局。* * 和* * * ,HE-Bu和车辆。

考虑到绝大炎症和免疫反应在脓毒症的早期阶段涉及大量的介质,是十分关键的控制这一复杂的炎症级联,因此管理脓毒症作用[17]。因此,天然产品包含各种组件,在不同的炎症级联管理时可能会对脓毒症治疗的优势与传统药物目标一个中介。在这项研究中,许多黄酮类化合物HE-Bu从被发现大肠uniflora叶子,由主要由苷槲皮素、杨梅酮,通过使用离线质(图4和表1)。

表1
化合物被UHPLC-MS的识别。

图4
(a)色谱图的分数HE-Bu检测到PDA 360海里。所有峰吸光度曲线黄酮醇(b)的特征。(c)均裂的示意图表示的CID-MS山峰7 (d)和12 (e)确认为杨梅酮、槲皮素rhamnosides分别。

目的是识别更多的化合物,HE-Bu酸水解,其次是一个液-液分区。UHPLC-PDA-MS有机层进行了分析,证实了槲皮素、杨梅酮的存在与真实材料相比(σ)。在场的单糖在gc - ms技术分析了水相alditol醋酸盐,显示阿拉伯糖的存在(20%)、鼠李糖(28%)、半乳糖(21%)和葡萄糖(31%)。考虑到没有其他单糖,阿拉伯糖和鼠李糖的类黄酮可以表示没有任何误解,而半乳糖和葡萄糖不能。如上所述,黄酮醇发生在果实的糖基化位点大肠uniflora是3 -O位置和可能发生在叶子遵循类似的模式(26]。

然后,提交HE-Bu UHPLC-PDA-MS分析获得了在反相(图1(一))。在PDA,所有检测到的峰值 在350 - 360海里(带我)~ 255 nm(乐队II),黄酮醇(图的特征4(b))27]。色谱图包含两个主要的峰值,峰值7确定为myricetin-rhamnoside deprotonated离子的形成m / z463 (mh)−和一个主要片段m / z316发生均裂产生的糖苷键,产生一个激进的离子从黄酮醇(核心人物4(b)和4(c))28]。类似的,第二个主要(12)出现在峰值m / z447年,一个主要片段m / z300年,与quercetin-rhamnoside(图一致1(c))。这标志着激进的碎片形成苷配基也表明3 -O -糖基化的网站(29日,30.]。

化合物的低丰度与其他苷槲皮素、杨梅酮是一致的,包含不同的单糖(表1)。然而,四个出现附加了一个额外的没食子酸基,收益率deprotonated离子m / z631(1)峰值,与myricetin-hexosyl-gallate一致,m / z615(峰值4和5)quercetin-hexosyl-gallate,和m / z599(8)峰值quercetin-rhamnosyl-gallate。除了高峰8,这种类型的配糖体之前已经报道过在其他植物,如槲皮素3 -O-glucosyl-6′′-O没食子酸盐,Tellima开大花的和蓼属植物hydropiperl . (31日,32),最近在茶树(33]。

据报道,槲皮素变弱致命的系统性炎症由内毒素引起的,即使开始治疗后早期肿瘤坏死因子响应,而且槲皮素能够抑制伊诺和cox - 2基因表达在巨噬细胞34]。结果表明:杨梅酮具有抗炎性质(35),它可以抑制il - 1β全身的细胞内炎症介质(36]。此外,杨梅酮被发现cox - 2酶的潜在抑制剂(37]。因此,这两类黄酮可以解释,至少在某种程度上,在这项研究中观察到的保护作用对小鼠脓毒症。

4所示。结论

总之,我们已清楚地表明,HE-Bu抑制促炎的重要参数:脓毒症引起的致命性,中性粒细胞涌入,促炎细胞因子,伊诺和cox - 2的表达。这些有益的效应可能与存在HE-Bu苷槲皮素、杨梅酮。这项工作可能导致的药理性质的确认大肠uniflora和他们的化学成分。此外,它还可以建议一个新产品,经过临床研究证实属性,可以作为辅助治疗败血症,没有替换的借口的资源应用于临床。

缩写

中电控股: 盲肠的结扎和穿刺
HE-Bu: 富含类黄酮素的分数
肿瘤坏死因子-α: 肿瘤坏死因子-α
il - 1β: Interleukin-1β
没有: 一氧化氮
伊诺: 诱导一氧化氮合酶
cox - 2: 环氧酶2
MPO: 髓过氧物酶
UHPLC-MS: 超高液相色谱-光谱法
气相: 气相色谱分析-质谱法。

作者的贡献

y . d . Rattmann和l . m . de Souza的贡献同样这项工作。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢巴西资助机构:披肩(Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量比),CNPq(蹂躏Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府),和Fundacao南洋杉金融支持。