文摘
斑马鱼(鲐鱼类)最近成为一个公共模型领域的遗传学、环境科学,毒理学,尤其是药物筛选。斑马鱼已成为生物医学相关的模型在活的有机体内高含量的同时测定药物筛选和多个效果参数,包括行为、选择性、和毒性在整个有机体的内容。斑马鱼行为试验已经证明是一个小说,快速和高通量的方法发现刺激神经组织的精神,memory-modulating化合物。最近的研究发现药物代谢系统的功能相似性在斑马鱼和哺乳动物,提供一个线索,为什么一些化合物是活跃在斑马鱼在活的有机体内但不是在体外理论,以及提供理由支持使用斑马鱼屏幕识别高活性化合物。在这里,我们讨论的优点的斑马鱼模型评价药物代谢和药理作用的模式与新兴组学方法。为什么这个模型适用于确定铅化合物与多因子的天然产品治疗疾病的发病机理和血管生成的不平衡,如帕金森病、癫痫、毒性、脑出血、血脂异常,和高脂血症,是解决。
1。介绍
斑马鱼(鲐鱼类)是一个热带淡水鱼,它已经成为最受欢迎的脊椎动物生物模型在生物研究。斑马鱼一直被用作模型研究发育生物学和胚胎学。最近,斑马鱼已成为领域的著名遗传学、环境科学、毒理学研究,尤其是药物筛选(1,2]。
斑马鱼很小,甚至成年人只有3 - 4厘米,合适的,因此,对于动物实验与有限的空间实验室。高繁殖力使每个成年女性交配产生数以百计的鸡蛋/每隔几天。胚胎生长发育迅速。受精后,120 h(高通滤波器)、心脏、肝脏、大脑、胰腺、肾脏和其他器官是完全发展。斑马鱼心血管、神经系统和代谢途径非常类似于哺乳动物的解剖,生理,分子水平。斑马鱼的基因组非常类似于人类基因组,与大约87%相似度(2]。药理反应是与人类相比较,表明应用程序识别测试化合物的治疗潜力。幼虫只有1 - 4毫米长,可以生存在一个标准的384孔板几天通过使用存储在卵黄囊的营养。分析研究只需要少量(10 - 100 ng)的测试化合物,如小分子,很容易通过皮肤吸收和鳃,或直接吞咽后72高通滤波器。斑马鱼的胚胎和幼虫早期光学透明,它允许实时成像在活的有机体内。这些有利的特性相结合,使斑马鱼的理想模型研究天然产物的生物活性分析包含复杂的化学成分。
2。斑马鱼和人类之间的相关性和可预测性的药物反应
利用斑马鱼作为模型药物筛选总会提高的问题是否药物先导化合物发现的有益作用在斑马鱼的临床相关性。虽然已经表明斑马鱼和人类基因组是高度相似的,应该做的一项研究后比较人类和斑马鱼的生理反应接触一系列的药物。Mittelstadt试验了九与QT延长药物在斑马鱼的影响,发现八这些化合物(普鲁卡因胺除外)引起的心房和心室率(表之间的分离1)[3]。类似的研究是由Berghmans,测量了斑马鱼的心房和心室率响应七知道QT-induced药物和2 -控制和发现7 9个化合物,包括消极的控制,显示预期的影响(表1)[1]。两项研究集中在视动的反应被Berghmans独立后,理查兹他们都发现斑马鱼显示很高比例的可预测性(~ 78% ~ 70%)的药物反应(表1)[1,4]。斑马鱼也是一种很好的模型筛选药物与潜在的责任。冬天的动物模型提供了72%的整体可预测性报道17个积极控制和5个中的13个8负控制显示预测的影响(表1)[5]。口服抗vegf代理包括苹果酸舒尼替和斑马鱼ZM323881有效地阻止了低氧诱导视网膜新生血管形成。(6]。两个已知的抗血管新生化合物,SU5416 TNP470,表明在哺乳动物系统抗血管新生活动,也证明了降低血管形成在斑马鱼7]。一系列已知的镇静剂化合物如氯氮平、氟西汀,褪黑素,安定,与戊巴比妥有类似的反应在斑马鱼和所有这些化合物导致减少运动活动。(8- - - - - -10]。同时,斑马鱼也显示类似的反应毒素诱导病理后果模仿帕金森病和癫痫,将在以后的章节。这些证据表明斑马鱼展示良好的相关性与临床相关性和支持其潜在药理评估模型(1,3- - - - - -5]。
3所示。斑马鱼和哺乳动物之间的相似的药物代谢:组学方法提供了线索
这是一种常见的现象,许多化合物代谢组织自然发生,肝脏和胃肠道等活动在体外但bioactivated在活的有机体内成为一个活跃的代谢物。一个先锋研究斑马鱼屏幕上寻找细胞循环调节器和确定14活跃候选人从图书馆的2000种化合物(0.7%正面击中)。活性化合物的细胞cycle-modulating活动识别斑马鱼的屏幕被验证在细胞系来源于斑马鱼和哺乳动物(11]。有趣的是,只有一半的活性化合物被证明是活跃在胚胎和细胞系之一,表明一些化合物是活跃的在活的有机体内但不活跃在体外。利用斑马鱼进行药物筛选以及各种药理学领域的研究受到越来越多的关注药物吸收、代谢、分布和排泄(12]。然而,很少有文献报道的详细系统的研究调查药物吸收后的命运以及参与药物代谢酶的识别斑马鱼幼虫。
我们最近研究解决药物吸收和新陈代谢在斑马鱼的胚胎和幼虫。我们使用质/女士来识别和概要icaritin代谢物及其糖苷衍生物在斑马鱼鱼仔13]。Icaritin是prenylated黄酮类化合物被认为是一种活性成分草Epimedii,已广泛应用在中国的草药治疗不孕症、骨质疏松症、四肢无力的症状。结果清楚表明,代谢途径涉及icaritin及其糖苷衍生物在斑马鱼幼体类似报道哺乳动物(图1)。通路的第一步是这些化合物的糖酶切除一部分消费后胃肠道粘膜的细胞或酶分泌的结肠菌群(14]。水解类黄酮衍生物的生产自由糖苷配基、共轭的硫酸盐化作用,glucuronidation、甲基化或以不同的组合方式与步骤,由第二阶段控制代谢的酶。
为了研究斑马鱼幼虫表达基本摘要是否参与拟议的生产icaritin代谢途径及其糖苷衍生物,结合转录组和蛋白质组学的方法被用来确定这些酶(13]。事实上,转录组分析程序确定51独特的mRNA转录(总共13310 nonredundant mRNA转录)属于三类参与第一阶段药物代谢的关键酶(15),包括细胞色素P450的家庭,flavin-containing单氧酶,和环氧化物水解酶在斑马鱼幼虫。此外,mRNA转录的几个关键二期药物代谢酶(16),包括UDP-glucuronosyltransferase sulfotransferases儿茶酚-O甲基转移酶,谷胱甘肽-年代转移酶,被确定。然而,蛋白质组学方法确定只有三个蛋白(2998种不同的蛋白质)属于谷胱甘肽-年代转移酶,二期解毒酶的主要类型。结果表明icaritin的新陈代谢及其衍生物在斑马鱼鱼仔和哺乳动物模型是高度保守的。
此外,calycosin,黄芪的活性组分,发现促进血管生成在斑马鱼和人类内皮细胞的激活雌激素受体和增殖蛋白激酶(MAPK)信号通路17]。我们最近接受论文描述药物吸收和新陈代谢使用calycosin作为探针在斑马鱼幼体(18]。十calycosin由glucuronidation的代谢物,糖基化,硫酸盐化作用、氧化、或任意两个组合的新陈代谢斑马鱼幼体被质/ MS(图确定1)。结果显示calycosin的动力学变化及其代谢物在斑马鱼幼虫。先前确定本研究发现药物代谢物在哺乳动物中,确认了药物代谢系统的保护在斑马鱼和新颖的代谢产物,提供洞察的可能性,发现小说在斑马鱼药物代谢产物的多样性。此外,大量的calycosin及其代谢物稳步增长在治疗后24小时(18),它反映了共同药物管理局斑马鱼和哺乳动物之间的差异。不同于常见的药物管理局路线,如胃灌溉和口服,用于啮齿类动物,斑马鱼的药物治疗通常是由保持整个鱼科汉解释说在含药孵化的媒介。这种方法使斑马鱼在恒定的环境中药物浓度和药物化合物不断进入人体通过消化道和呼吸道系统。未来深入系统地调查吸收,分布,代谢,排泄(ADME)在斑马鱼是十分必要的。
一期和二期的高相似性新陈代谢在斑马鱼上可以归因于高度保守的基因表达谱在肝脏和肠道微生物群与人类和老鼠一样,分别是(19,20.]。在其他小型无脊椎动物药物筛选模型生物,比如果蝇黑腹果蝇已经确定了一些非常有前途的铅化合物,特别是对于延缓衰老的(21]。尽管如此,高度保守的药物代谢的概念证明斑马鱼和哺乳动物之间的强烈支持斑马鱼作为脊椎动物模型的有效性而不是其他无脊椎生物模型对药物发现和药物代谢研究。
4所示。血脑屏障(BBB)在斑马鱼的存在
BBB至关重要的维护一个稳定的环境监管的离子平衡和营养运输和潜在的有毒分子的堵塞。的内在复杂性cell-matrix-cell neural-vascular单元的相互作用在细胞培养、基因功能分析困难组织外植体,甚至动物模型。斑马鱼已经成为总理脊椎动物模型对于分析复杂的细胞间的相互作用在活的有机体内和胚胎发育的遗传机制22]。大脑内皮细胞显示免疫反应性Claudin-5和Zonula Occludens-1 (ZO-1),这意味着这些细胞紧密连接的存在。Claudin-5的表达和ZO-1脑微血管中发现从3 dpf,伴随的BBB的成熟(23]。张等人发现,斑马鱼胚胎发展3 dpf BBB功能,与早期的表达在中央动脉Claudin-5 2 dpf (24]。
我们最近研究槲皮素的神经保护作用阐明功能性BBB的存在在斑马鱼鱼仔3 dpf和BBB通透性的作用在决定神经保护药物的有益作用在帕金森病(PD)在活的有机体内。槲皮素是最常见的天然黄酮类化合物之一。虽然它和结构相关的类黄酮已被证明在各种神经保护能力在体外和在活的有机体内实验模型(25- - - - - -27),槲皮素的神经保护作用仍有争议。然而,槲皮素没有保护黑质神经元的氧化的侮辱在活的有机体内在经过BBB,可能是由于效率低下在活的有机体内条件(28]。有一个迫切需要适当的在活的有机体内研究以证实槲皮素的神经保护作用和识别结果之间的差异的原因在体外和在活的有机体内。为了解决这个争议,我们服用槲皮素在不同成熟阶段的BBB在斑马鱼和我们发现它可以预防而不是拯救6-OHDA (DA神经元损伤28]。槲皮素为斑马鱼幼体时前3 dpf BBB并不完善时,它可以迅速蔓延整个大脑,产生一种保护作用对6-OHDA毒性。然而,当槲皮素后为斑马鱼3 dpf,带来的障碍成熟BBB槲皮素进入大脑,防止拯救6-OHDA侮辱在多巴胺(DA)神经元。这个结果支持早期的发现存在的72年在斑马鱼BBB高通滤波器(23,24]。
5。行为在斑马鱼中屏幕
斑马鱼显示学习,睡觉,药物成瘾,神经行为表型可量化和比较与那些在人类10,29日]。斑马鱼行为试验已经证明是一个小说,快速、高通量方法的发现刺激神经组织的,精神,和memory-modulating化合物(30.- - - - - -32]。在过去,一个主要障碍,精神药物的发现是由于无法预测小分子将如何改变复杂的行为。最近,Rihel等人报道,斑马鱼表型的多维性质使分子的层次聚类类似的效果。这行为分析显示守恒的精神分子的功能和预测的作用机制差特征化合物(30.]。此外,Kokel和他的同事使用自动筛选分析评估数以千计的化合物,发现不同类型的刺激神经组织的分子导致截然不同的运动行为模式。他们得出的结论是,斑马鱼行为分析可以迅速识别小说精神化学品和预测他们的分子靶点31日]。
6。斑马鱼生物测定筛查选择性
现在毒性药物开发的第一个障碍。从2003年到2010年,药物从第一阶段的总体成功率FDA批准仅为9% (33]。高百分比的药物发展失败的不同阶段,包括动物实验或临床试验,由于nontolerated副作用和毒性。作为在体外研究,通常是基于细胞或分子,如酶或配体结合化验,药物筛选与这些化验预测潜在的治疗作用对一个特定的分子目标和/或细胞类型;然而,隐藏的毒性和副作用,因为与其它分子相互作用的药物或其代谢物的目标,目前还不完全清楚。
最近,许多药物撤出市场由于人类ether-a-gogo-related (hERG)心脏毒性34]。hERG钾离子通道有一个重要的角色在心脏动作电位复极化,和离子通道的封锁会导致QT间隔的延长,与带条de同构密切相关,一个潜在的致命性心律失常(35]。因此,hERG(我基米-雷克南)临床前安全性数据的任何调查的重要组成部分在FDA新药提交推荐我指南(36]。斑马鱼可能存在一个不错的选择模型对大规模筛选药物毒性的QT延长通过ERG通道。斑马鱼hERG及其同族体(虫族)高度的保守氨基酸序列相似性虫族显示99% drug-binding和孔隙域与人类直接同源(37]。抑制或可拆卸的虫族基因导致心律失常和特点2:1房室阻滞(2心房跳动耦合1室打)(37]。制药行业改变了策略,试销化合物库的hERG心脏毒性筛查治疗靶点。根据我S7A指南,中枢神经系统的研究包括行为、学习和记忆、神经化学、视动的和/或电生理检查之前推荐的产品批准(38]。斑马鱼中枢神经系统可能是一个好的模型评估,因为动物拥有匹配定义的区域包括下丘脑和大脑嗅球(39]。提出了海马体的外侧区位于大脑皮层在斑马鱼39,40]。此外,重要的神经递质系统,如胆碱能、5-hydroxytryptaminergic,多巴胺和去甲途径也存在于大脑斑马鱼(41,42]。斑马鱼也有类似的神经药理反应包括运动活动(10],昼夜起搏[43),和药物成瘾44]人类。这些证据支持,斑马鱼可能生理相关的神经毒性化合物筛选模型。
评估胃肠道并发症的药物开发期间可能也很重要,因为不良反应可能导致消化道出血引起的死亡(45]。显示的斑马鱼生理学在胃肠道系统与人类相似。例如,小肠是内衬的大多数细胞类型除了Paneth细胞(46,47];平滑肌的蠕动由一对控制和受肠神经系统48]。然而,它没有胃49)和一层黏膜下层结缔组织区分上皮和平滑肌层(46]。此外,在研究的10个已知化合物对斑马鱼胃肠收缩的影响,5个中的10个化合物显示预期效果(1)(表1)。相对较低的可预测性是由于cromakalim再现性低,尼古丁,nitrendipine重复实验(1)(表1)。然而,斑马鱼仍有潜在的预测在胃肠道不良反应系统(1]。有越来越多的研究预测化合物的毒性和不含这些化合物是有毒的药物发现过程的早期预测(50]。
药物疗效和毒性是两个重要的标准是销售和斑马鱼模型允许同时测量这两个参数。存活率和/或死亡率是/是一种常见的和直接的参数用来表示一种化合物的毒性。胚胎的心脏是金色的参数用于指示服药治疗斑马鱼胚胎的生活状态。因此,致命毒性的化合物对斑马鱼胚胎反映在心跳率可以同时监测的观测活动,如抗血管,与感兴趣的化合物。此外,其他中毒的迹象,比如斑马鱼胚胎的发育滞后,可以观察到低水平的色素沉淀在身体和眼睛,更大的卵黄囊,短树干对药物治疗的反应。例如,我们正在进行的筛选抗血管活动的一系列酸酯衍生物,我们确定了结构修改在一个化工集团相同的支架,它表现出更高的抗血管新生力量活动和较低的毒性斑马鱼胚胎(51]。这个试点研究作为概念验证,表明斑马鱼的优势对HUVEC细胞作为血管生成试验是斑马鱼允许筛查活动和内容在活的有机体内毒性。
在研究斑马鱼的抗血管新生化合物之外,我们可以评估分子的选择性作用,如细胞循环逮捕,血管细胞在一个活的有机体。斑马鱼胚胎使胰蛋白酶化到活细胞悬液与dna染色染料染色DRAQ5 (Biostatus有限公司、英国)后续细胞循环分析(图2)。的微分效应复合内皮GFP-expressing细胞的细胞周期和non-GFP-expressing细胞可能由流式细胞术。使用这种技术,白藜芦醇衍生物反式3、5、4′-trimethoxystilbene (TMS)被发现在内皮细胞显著诱导细胞循环逮捕更多的(约20 - 30%的只有5 - 10%的GFP-negative GFP-positive细胞和细胞)在斑马鱼胚胎(图3),确认TMS产生一个更具体的细胞毒性影响内皮细胞比其他细胞类型在体外,更重要的是,在活的有机体内(52]。然而,仍有一个整体的G2 / M期细胞增加整个细胞群,表明经颅磁刺激引起细胞循环逮捕在其他细胞类型(图3)。这一发现提供了一种解决争议的问题关于是否白藜芦醇及相关化合物引起细胞循环逮捕通过G1和G2 / M期细胞培养在体外(53]。本研究在斑马鱼胚胎,显示G2 / M细胞循环逮捕的感应GFP-positive经颅磁刺激内皮细胞的活的有机体,提供洞察化合物的生理意义。对斑马鱼的概念确定选择性的抗血管新生行动内皮细胞是由类似研究的结果,在川陈皮素(5、6、7、8、3′,4′-hexamethoxyflavone)展出以不同的方式影响细胞循环逮捕通过诱导G0 / G1期积累GFP-positive内皮细胞(54]。除了细胞周期的分析,类似的方法可以采用探测细胞对不同细胞生理参数,如氧化应激和线粒体功能,由不同的污渍。这种方法允许检查候选人选择性药物如何作用于特定的细胞类型在一个活的有机体。
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7所示。Phenomics和生物活性分析
Phenomics最初是一个区域涉及的生物学表型的研究作为一个整体有机体。基于图像来反映生物的表型变化的运动行为不同的细胞类型,器官和生理系统在野生型和转基因斑马鱼提供机会评估多种药理活性的化合物(图4)。药理作用的化合物可以解码系统生物学的方法通过数据挖掘多维表型数据的有机体(55]一起测量的相对水平的mRNA转录(转录组)、蛋白质(蛋白质组)和代谢物组件(代谢物)。最近,这种组学方法结合日益成为药物发现和毒理学。组学数据提供更多的信息比典型的表型分析,包括观察胚胎的形态变化以及行为和死亡率。与现有的表型组学数据的耦合端点检测,更多细节的机制和毒性化学可以用来解释因果关系。尽管表型的变化是相同的,如卵黄蛋白原,这表明雌激素暴露在鱼被17 b-estradiol调节,双酚A,染料木黄酮(56),行动的方式可能有所不同。这种可能性可以显示这些化学物质引起的基因差异表达基于转录组分析(56]。
8。综合斑马鱼的转录组和蛋白质组学分析
因为药物的治疗作用在正常化病变可以来自不同的细胞通路在复杂的监管网络在活的有机体内研究可以提供更多的信息在体外化验使用纯化目标。mRNA转录和蛋白质是主要负责生物功能在细胞和分子的能力检查的转录组和蛋白质组生物体的生理变化发生提供了一个健壮的概述,可以大大增加面向目标的生物数据。因此,我们最近一个RNA-seq技术用于转录组分析和完全可自动化的RP-RP 2猎枪蛋白质组学数据链路控制系统解决斑马鱼的药物代谢系统和下游转录效应的药物。最近发展的深度测序和2 d RP-RP质/ MS技术确定12560 mRNA转录(每RNA样本来自大约500万读)与匹配的带注释的基因(13,57斑马鱼)和1752独特的蛋白质溶解产物,分别在一个分析(58]。
当前的转录组分析工具中使用斑马鱼是微阵列和RNA-seq。RNA-seq或深度测序的RNA样品使用下一代测序技术正在成为一种受欢迎的转录组分析工具,因为它是一个开放的平台,不需要预定义的探针。原则上,RNA-seq概要已知和小说成绩单和它收益率数据和更高的分辨率,更广泛的动态范围,并降低背景噪音,虽然它只需要少量的RNA样品比微阵列(59]。
相比之下,蛋白质组学研究主要利用集成技术,包括分离蛋白质的二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2 d-page)和识别的蛋白质matrix-assisted,激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)。质/女士的另一个主要优势传统2 d页面,信用证允许更快的高灵敏度探测和直接识别广泛的蛋白质,包括高分子量蛋白质和酸性或碱性蛋白质,都是等问题在使用方法2 d页面(58]。
在转录组、蛋白质组学通常被认为是生物系统的下一步研究。综合研究这两种方法通常被认为是作为因果关系的研究。尤其关注识别一些生物反应,启动转录水平和展览功能信息在蛋白质水平。转录组在蛋白质组学的优势,允许更大的规模和更高的吞吐量分析和大约10倍的报道发现斑马鱼基因目标在一个运行的示例,而蛋白质组学在转录组的优势可能观察功能性蛋白表达变化和转译后的水平。
传统免疫学的方法取决于抗体和的可用性先天的知识的目标,一般来说,并不适合全球监测。此外,现在知道的转录水平通常是不相关的蛋白表达水平,和蛋白质组学的方法定义了响应的蛋白质水平可能不是在转录水平调节,从而提供额外的信息(60]。因此,综合利用转录组和蛋白质组学可以提供更多的验证的证据所涉及的分子靶点识别斑马鱼生物反应的药物治疗。整合转录组和蛋白质组学的优势之一在于其中立性先天的知识和目标。observation-driven结果可能导致洞察以前未知的目标。最近发展的深度测序技术和二维质/ MS系统提供了一个前所未有的机会来制定一个系统生物学的方法来解开整体行动的产生效果的药物或天然产品包含多个组件通过与一个特定的交互或多个目标在整个有机体。
9。斑马鱼疾病模型
一个高度相关的疾病模型时应开发探索病理生理机制,任何药物的生物活性化合物。斑马鱼模型开发的几个研究人类疾病的治疗领域。疾病模型是由突变或基因的失活,化学治疗,甚至修改节食。
10。神经退行性疾病模型
10.1。帕金森病
帕金森病是第二个最常见的神经退行性疾病,其特征是进步DA神经元的损失在黑质致密部。PD的病因是不能完全理解,但越来越多的证据表明,氧化损伤引起的活性氧(ROS)和活性氮物种(RNS)神经炎症,会引起,细胞凋亡参与DA神经退化的进程61年]。
最近,斑马鱼已被证明是一个适当的PD模型(62年]。DA系统的后结节腹侧中脑比得上黑系统在人类[63年]。透析相关神经毒素导致DA神经元的损失,减少表达酪氨酸羟化酶(TH)(表2)和运动行为的障碍在斑马鱼比得上其他动物模型中观察到的病理生理特征(64年]。此外,临床和实验神经保护制剂(nomifensine DAT抑制剂;L-deprenyl,缺氧抑制剂)(表2)已被证明是活跃在保护斑马鱼从神经元的侮辱65年]。击倒或突变的重要基因,包括体内基因LRRK2帕金和有助于DA神经元数量明显降低(表2)。综上所述,早期的研究结果表明,斑马鱼是一个很好的替代物种PD模型并提供了很好的机会小说PD治疗药物的筛选和发现。
斑马鱼的大脑结构和功能非常类似于其他脊椎动物(70年]。斑马鱼的解剖大脑DA系统研究了最近,和地区结构上类似于前脑(纹状体被确认71年]。注射神经毒素,如MPTP药物,6-OHDA,和鱼藤酮诱导DA神经元损失在动物模型。注射在神经毒素,MPTP药物/ MPP+是最好的毒素产生的PD模型和特征已经被证明是有效的为研究纹状体通路参与PD病理生理学(72年]。注射的斑马鱼暴露MPTP药物引起深刻的亏损酪氨酸hydroxylase-positive (TH+)神经元和表达下调TH信使rna表达与vehicle-treated健康的斑马鱼(图5)导致赤字在运动行为(图6)。早期的研究表明,6-OHDA都是由质膜选择性多巴胺转运体和线粒体随后积累,导致活性氧的形成和RNS (73年]。此外,神经炎症6-OHDA-induced DA神经元损伤中发挥着关键作用在活的有机体内(74年]。我们测量了促炎介质在6-OHDA-treated斑马鱼的基因表达定量实时PCR和显示6-OHDA过度引起的il - 1β,肿瘤坏死因子-α,cox - 2鱼,多方面的高于未经处理的控制(75年]。这些促炎基因扮演了一个重要的角色在PD的病因76年]。已经表明cox - 2蛋白的水平调节在黑质DA神经元PD患者和动物模型(77年]。抑制cox - 2与肿瘤坏死因子-α提供了神经保护大鼠(76年]。我们当前iTRAQ-based猎枪蛋白质组学研究PD的斑马鱼模型提出的潜在参与TNF -α/ NF -κB和氧化磷酸化途径6-OHDA-induced在斑马鱼神经退化(未公开的数据)。然而,鉴于此,所有报告承诺研究这种化学物质诱导帕金森病实验斑马鱼模型,研究需要做更多的工作来区分系统性毒性和选择性神经元神经毒素的毒性。此外,一代的转基因斑马鱼表达荧光蛋白特别是在DA神经元,使得跟踪生活DA神经元的动力学变化在活的有机体内,是一个可行的策略来取代postimmunochemical TH-positive神经细胞的染色。
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10.2。癫痫
癫痫是一种常见的神经系统疾病的特点是反复出现的自发性癫痫发作由于神经过度活跃,和疾病折磨全球近5000万人(78年]。最近的研究表明,癫痫的发病机制涉及改变GABA受体的分布(表3),增强活动的兴奋性电路,神经元的损失,和突触重组79年- - - - - -82年]。许多基因编码转录因子,突触受体,离子通道,和葡萄糖转运蛋白显示改变mRNA表达癫痫(表的啮齿动物模型3)。这些发现表明潜在的基因标记以外c-fos。虽然某些抗癫痫药物(aed)销售,没有药物能够扭转脑部病变的原因(83年等)和一些疾病亚型,颞叶癫痫,甚至对当前的几种药物(84年]。这个问题要求大规模筛选AED的新候选人,但这是一种啮齿动物模型中难以实现。
PTZ-induced癫痫模型建立了斑马鱼Baraban于2005年(85年),upregulation报道的c-fos中枢神经系统地区的斑马鱼暴露于PTZ。接触PTZ后,斑马鱼显示发作的三个阶段:大幅增加在I期总行驶距离,快速旋涡状盘旋游泳行为在II期,和高潮clonus-like抽搐在第三阶段的姿势导致的损失。目前aed可以停止发作阶段I和II,因此,癫痫斑马鱼在两阶段适合药物筛选92年]。
10.3。心脏病和毒性
突变中心肌肌钙蛋白T 2型(TNNT2) [93年)和T-box-5 (Tbx5)涉及心肌病。严重的心脏缺陷在斑马鱼携带突变TNNT2。突变Tbx5导致心脏和上肢的畸形称为Holt-Oram综合症(94年]。斑马鱼携带相同的突变有可比畸形的心和胸鳍[95年]。事实上,肌钙蛋白T被认为是作为生物标志物在先天性从扩张型心肌病心力衰竭96年,97年]。其他生物标记,如肌凝蛋白光鍊(96年,97年],cardiotrophin [98年],endothelin-1 [99年),提出了在充血性心力衰竭和高血压诊断价值(表4)。
斑马鱼是一种很好的模型研究毒性。心脏功能可以通过评估研究斑马鱼胚胎心率、心脏形态学、心肌细胞数量,和心脏大小(101年]。最近,我们探讨了化疗药物的毒性,如苹果酸舒尼替(索坦;SU11248;辉瑞)。索坦是一个多目标的酪氨酸激酶抑制剂,抗血管新生的活动。它已经批准一线和辅助治疗肾细胞癌。然而,长期血管生成抑制包括不必要的副作用,包括心脏和肾毒性在癌症患者102年]。我们的研究显示,索坦通过感应心脏功能恶化的心包水肿,减少在斑马鱼胚胎心率(图7)。
11。脑出血模型
脑出血,也称为出血性中风,发生在大脑中的血管变得软弱而破裂,使血液流向大脑。阿托伐他汀,3-hydroxy-3-methylglutaryl辅酶a还原酶抑制剂(β),降低胆固醇,改善了,血管动脉粥样硬化,改善心血管发病率和死亡率(103年]。预处理与阿托伐他汀显著降低梗死体积大脑中动脉闭塞引起永久的在动物研究104年]。临床研究显示postischemic-stroke阿托伐他汀治疗的患者显示改善神经恢复(105年]。然而,这种有益的影响在一定程度上缓解了出血性中风的风险增加(106年]。此外,阿托伐他汀引起颅内出血在野生型鱼107年)和诱导脑出血在斑马鱼模型(图8),它提供了一个机会来筛选cerebrovascular-protective化合物。
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12。血脂异常和高脂血症
斑马鱼模型可用于对脂质代谢的研究。猝灭荧光磷脂基质N(((6)- 2,4-dinitrophenyl氨基)己酰)1-palmitoyl-2-bodipy-fl-pentanoyl -sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PED6)被斑马鱼幼体解理磷脂酶在肠道后能发出荧光。据报道,这个分析可以用来检测无脂(笔)突变,这可能导致干扰脂质处理通过受损的肠道磷脂酶活动(108年和减少蛋白酶活动109年]。Stoletov领导的研究小组开发了一种hypercholesterolemic (HCD)模型在斑马鱼利用荧光胆甾醇酯观察血管内皮细胞层中的脂质积累和荧光右旋糖酐瓦解后HCD饮食(110年]。模型的可靠性进一步支持的巨噬细胞的积累,增加磷脂酶2活动,高浓度的氧化磷脂酰胆碱在斑马鱼美联储HCD饮食相比美联储正常饮食(110年,111年]。金领导的另一个研究小组表明姜黄和月桂水提取物的antiatherosclerotic效果使用这种HCD模型(112年]。这些疾病模型已被证明是高度相关的人类疾病和显示的数量守恒的斑马鱼和人类之间的表型。此外,研究基金会的困难的事件已经克服由于其光学透明度。
13。寻找天然产物的活性化合物
许多天然产物表现出一系列的生物活性,可能是由于相互作用的复杂的化学成分与多个目标的身体,开幕的新途径治疗的疾病,与神经退化等多因素疾病发病机理。斑马鱼的生理的复杂性是类似于哺乳动物,为人类疾病的研究提供一个合适的模型,以及吞吐量药物筛选。使用整个有机体作为模型允许更全面和同步分析的各种生物活性和毒性化学相比,一个或多个化学物质在体外化验。斑马鱼的胚胎和幼虫早期光学透明,让屏幕和一个可测量的表型读出使用成像显微镜评估病变在帕金森病、癫痫、心脏病或心脏中毒,脑出血和高脂血症。这种方法允许对个人生活和连续观察中往往是不适用的在活的有机体内模型。更重要的是,侵入性方法常常应用在这些动物模型,因此重新评估个人的可能是不可能的。例如,脑出血在啮齿动物模型通常是由intraparenchymal注入自体血或细菌胶原酶。血肿的大小和位置与组织学评估分析(113年,114年];高脂血症在啮齿动物模型是通过与高脂肪饮食喂养的载脂蛋白e缺陷小鼠8周和动脉粥样硬化病变也组织学观察到(115年,116年]。同时,视觉与成像显微镜观察可能会需要更少的技术技能,也方便得多。例如,在斑马鱼毒性的评价是由心率、心脏形态、心脏肌细胞数量,和心脏大小。然而,在动物模型中,心脏功能往往是心电图和超声心动图评估需要密集的技术和劳动力投入。使用啮齿动物疾病模型的早期阶段自高通量药物筛选可能听起来不适用的研究通常是必需的。此外,斑马鱼模型支持任何药理效应的观察(s)在多个目标潜在疾病的途径或可以观察到一个正常的生理过程。斑马鱼模型,因此,非常适合于识别脱靶效应或多个目标由于天然产品的整体作用。
14。从天然产物识别血管生成化合物
血管生成成熟的血管网络的建立是通过扩张和血管重构原基。通过血管新生血管形成包括新芽的诱导、协调和指导内皮细胞迁移,增殖,发芽融合(吻合术)和管腔形成117年]。在正常情况下,小血管大小或数量不增加,除了伤口愈合,黄体的胚胎发育和发展。事实上,许多疾病与血管生成的调控失衡有关,要么过多或不足的血管形成的发生。
评价斑马鱼血管生成反应,转基因鱼表达绿色荧光蛋白(GFP)特别是在内皮细胞,例如,Tg (fli-1: EGFP)和Tg (fli-1: nEGFP),最近用于快速分析胚胎生活在改变血管的药物反应(118年]。事实上,斑马鱼是一个很好的动物模型研究血管生成,与许多抗血管新生药物诱发反应类似于在哺乳动物系统(119年]。在脉管系统开发,subintestinal静脉血管(siv)源自居维叶的管48高通滤波器和卵黄囊形成血管篮子在接下来的24小时。血管生成的反应评估视觉对以下标准:(1)峰值的出现或豆芽投射subintestinal船篮子或延长的峰值;(2)扩展的篮子到蛋黄地区超过七垂直篮内分支机构(120年];(3)统计增加直径比介质控制;(4)新成立的异位增长结构性投资工具和数量增加的siv的血管内皮细胞(121年]。发芽形成被视为proangiogenesis[的主要特点17,120年,121年]。最近,我们证明了药物筛选斑马鱼模型的可行性,发现白藜芦醇衍生物的抗血管效应(52],indirubin [122年),川陈皮素(54],sinensetin [51)以及proangiogenesis的影响当归提取(123年,124年),田七提取(125年),而黄芪提取(17]。
血管生成中起着重要的作用在人类发展的慢性炎性疾病,包括癌症、牛皮癣、类风湿性关节炎、黄斑变性、糖尿病性视网膜病变(126年,127年]。越来越多的证据表明,慢性炎症和血管生成是互相依赖的,涉及增加细胞浸润和扩散以及重叠的角色监管生长因子和细胞因子(126年]。持续的炎症与癌症的发展,促炎细胞因子在肿瘤组织中经常发现(128年]。在类风湿性关节炎,血管翳的形成129年),这是一种炎症性结缔组织大量富含血管,显然是因为血管生成因子,VEGF等刺激encephalitogenic T细胞,诱发更严重和长期脑脊髓炎(130年]。除了血管生成因子,转录因子如NF -κB的过程中扮演着重要的角色在细胞凋亡和炎症的信号(131年]。NF -κB表达与VEGF在肿瘤发生发展和进展(132年]。信号由cyclooxygenase-2 (cox - 2)的下游NF -κB可能发挥关键作用的肿瘤发生多种人类恶性肿瘤通过刺激细胞增殖和血管生成133年]。此外,最近的一项研究表明,慢性炎症在良性前列腺增生会导致一个cox - 2的过度表达,导致bcl - 2和VEGF表达的增加134年]。
许多抗炎药的药理学透露至少部分的功效是由于血管生成的影响(126年]。Tocotrienol,维生素E家族的一员,具有抗癌属性代理通过调节多种信号通路,包括抗炎和抗血管135年]。的提取酸浆属具棱角显示antimetastatic和抗血管新生活动在人类口腔鳞状细胞癌和人类脐静脉内皮细胞,可能由于其抗炎作用[136年]。Indirubin抑制炎症反应,抑制干扰素的生产γ和白细胞介素- 6,这是一个众所周知的炎性细胞因子(137年]。有趣的是,它还显示抗血管新生活动诱导HUVEC细胞凋亡和细胞循环逮捕在G0 / G1期(122年]。白藜芦醇及其衍生物在斑马鱼施加反血管增生和vascular-disrupting效果的差别通过对这些VEGFR2和细胞循环调制(52]。据报道,白藜芦醇的抗炎特性防止血清淀粉样蛋白的含量的增加,肿瘤坏死因子-α白介素(il - 6)、il - 1β和核转录因子-κB在colitis-associated疾病(138年]。
血管生成缺陷与众多人类心血管和脑血管疾病(例如,缺血性心脏和脑的问题)。我们之前发现的一个pro-angiogenic草当归伤口愈合的斑马鱼分析导致开发配方对糖尿病足溃疡患者(124年,139年]。我们最近的工作,第一次在斑马鱼chemical-induced血管的损失在活的有机体内可以模拟血管生成缺陷与人类疾病相关的条件和被用来识别pro-angiogenic代理。VEGFR酪氨酸激酶抑制剂二世(VRI) pyridinyl-anthranilamide化合物显示反血管增生属性,强烈抑制激酶活性的VEGF受体1和2。治疗的斑马鱼VRI诱发显著血管失去ISV(节间血管)和DLAV(背纵向吻合的血管)。例如,我们发现了一种多糖分数(50000 D < MW和DM < 0.1μ米)独立于踝骨基数部分恢复chemical-induced血管斑马鱼模型中的损失(140年]。这也是研究首次证明的概念,多糖的生物活性筛选斑马鱼生活,那些药物代谢系统显示最近有一个高度的功能与哺乳动物相似。由于多糖分离天然产物通常经过酶分解糖的一部分在胃肠道粘膜的细胞,或酶分泌的结肠菌群,成为口腔由人类消费后活性代谢物,多糖的生物活性的研究需要的发展在活的有机体内测定配备mammalian-equivalent药物代谢系统。我们的发现提供了洞察新血管生成缺陷筛选斑马鱼模型血管再生剂以及各种物质的重要作用中药治疗各种病理条件与缺乏血管生成有关,如老化、中风、溃疡,和心血管疾病(140年,141年]。
15。识别Anti-Parkinson病从天然产物化合物
PD病人通常遭受主要来自死亡的黑质多巴胺(DA)神经元。最近的研究在帕金森病的药物治疗已确定众多代理运动能力损伤的症状控制,但没有一个能够避免,缓慢,或阻止疾病的进展142年]。发展中神经保护治疗的主要障碍是我们有限的理解关键的分子事件,引发神经退化。早期的研究强调了病态的参与氧化应激,神经炎症,会引起,细胞凋亡在神经退行性疾病143年]。因为PD,以及其他神经退行性疾病,通常有多因素疾病发病机理、多药物治疗需要解决不同病理方面(144年]。多种药物策略的本质原理用于制定中药(中药)了数千年。中药含有化学成分的混合物从一个草本或一些草药,因此通用功能和拥有巨大的潜力在多目标方法改进治疗复杂的疾病,如帕金森病。
通过结合整个疣状山和行为上,我们已经确定了一些中药的神经活动,包括果实oxyphylla成分提取(效果范围)Eriocaulon buergerianum提取(电子束曝光)75年,145年]。最近,越来越多的证据表明果实效果范围各种神经退行性疾病的有利影响。水效果范围减毒治疗皮质星形胶质细胞的死亡引起的淀粉样蛋白-β(一个β)在体外、阻止ischemia-induced学习障碍和获救从致命缺血性损伤小鼠海马CA1神经元146年]。治疗ethanolic效果范围的谷氨酸显著提高生存能力和减少细胞凋亡在皮质神经元文化(147年]。我们发现乙醇效果范围预防和恢复6-OHDA-induced DA神经退化及其减赤字的斑马鱼的运动活动(75年]。此外,水生植物EB (Gujingcao)是一种中药消炎和抗菌性(148年]。在中国药典(2005),EB的头状花序是最常用的中药材之一,与类黄酮、挥发油、蒽醌、naphthopyranones,原儿茶酸和醋酸c-tocopheryl生物活性成分(149年]。黄酮类化合物如patuletin hispidulin,槲皮素、quercetagetin quercetagetin衍生品和棕榈酸等挥发油(Z, Z) 9日12-octacosane-dienoic酸的两个主要的类化学物质在EB (148年]。EB演示了显著疗效头痛、牙痛、鼻窦炎,夜盲症,青光眼,retinochoroiditis,结膜炎和其他眼疾150年]。我们的研究结果表明,电子束曝光已经深刻在斑马鱼神经活动,包括DA神经元的摄入量有关复苏6-OHDA所造成的损失在活的有机体内和抑制6-OHDA-induced总在斑马鱼运动距离的减少145年]。我们发现槲皮素是一个活跃的神经保护选民在电子束曝光28]。所有这些基础需要进一步研究的多个组件之间的相互作用在这些天然产物抒发神经保护。
16。结论
斑马鱼为同时提供了有趣的可能性的评估疗效和目标化合物的毒性,这与当前的啮齿动物模型不容易解决。与人类生理相似,但许多疾病模型识别非目标和目标建立目标化合物的影响。更重要的是,它允许转录组和蛋白质组学的综合研究确定药物代谢途径和已知或新颖的分子目标参与生物斑马鱼对药物治疗的反应。
确认
本研究由科技发展基金的赠款支持澳门特别行政区(引用号。045/2007,058/2009,014/2011,078/2011 / A3)和研究委员会,澳门大学(引用。UL017)。