文摘

东莨菪亭存在本质上作为一种抗氧化剂,王亚南,抗炎活动试剂。在这项研究中,我们调查了东莨菪亭使用模型的镇痛效果乙酸段时间响应和扭动的福尔马林试验、东莨菪亭使用模型的抗炎作用λ卡拉胶(卡尔)全身的爪子水肿。ICR小鼠的治疗与东莨菪亭和formalin-induced疼痛抑制扭动的数量反映后期阶段。本研究表明,东莨菪亭管理导致Carr-induced老鼠的减少水肿,这增加了活动的超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)卡尔注射后。我们还演示了东莨菪亭显著减毒丙二醛(MDA)水平后的水肿爪子卡尔注入。东莨菪亭的减少,肿瘤坏死因子(TNF -α)和前列腺素E2(铂族元素₂卡尔)水平对血清后注入。东莨菪亭减少Carr-induced诱导没有合酶(间接宾语)和cyclooxygenase-2水肿(cox - 2)表达的爪子。这些东莨菪亭的抗炎机制可能与降低MDA的水平有关通过增加SOD的活动、猫和GPx水肿的爪子。同时,东莨菪亭可能影响生产的,TNF -α和铂族元素₂,因此影响抗炎作用。

1。介绍

东莨菪亭(6-methoxy-7-hydroxycoumarin)分离出许多草本植物,包括齿栗叶crenata(<一个href="#B1">1),Crossostephium对(<一个href="#B2">2)等等,使用中药治疗各种风湿性疾病很长一段历史。它可以产生几个生物活动,如anticholinesterasic、抗甲状腺,抗氧化剂,抗高血糖药,hypouricemic, antitumoral [<一个href="#B3">3),和抗炎活动(<一个href="#B4">4]。然而,小的信息可以在东莨菪亭的镇痛和抗炎作用在活的有机体内。

疼痛通常与炎症有关,这是由于组织损伤、化学刺激、或自身免疫过程。这些刺激诱发炎症介质的释放(前列腺素、缓激肽、组胺、生长因子和神经源性因素)(<一个href="#B5">5]。炎反应哺乳动物组织涉及一系列复杂的事件和介质刺激外周传入纤维导致疼痛的感觉。参与炎症周边敏感事件的痛觉受器提供了抗炎药物治疗范围治疗与炎症反应相关的疾病(<一个href="#B6">6]。Subplantar注射卡尔在小鼠体内诱导的水肿是双向的。第一阶段的峰值在3小时,卡尔和延迟阶段的峰值在48小时后注射。在早期阶段,有弥漫性细胞浸润多形核白细胞(中性粒细胞)而延迟的渗透阶段是由巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞(<一个href="#B7">7]。因此,在本文中,我们研究了东莨菪亭的镇痛效应对醋酸引起的痛觉过敏和福尔马林。我们也评估东莨菪亭的抗炎效应在老鼠爪子水肿引起的卡尔。我们发现MDA的水平,不,TNF -α和铂族元素₂在爪子水肿或血清;此外,SOD的活动,猫,GPx在爪子水肿5小时后卡尔注入探讨东莨菪亭的抗炎机理和抗氧化酶的关系。

2。方法

2.1。化学物质

东莨菪亭(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ecam/2012/595603/fig1/" target="_blank">1(一)),λ卡拉胶(卡尔),吲哚美辛(印度),格里斯试剂和其他化学物质从Sigma-Aldrich化工有限公司购买福尔马林从日本购买Shiyaku工业有限公司TNF -α和铂族元素₂买来BioSource International Inc .(贝南、钙、美国)。Anti-iNOS、anti-COX-2和反β肌动蛋白抗体(圣克鲁斯、美国)和蛋白质分析工具包(Bio-Rad实验室有限公司,沃特福德,赫特福德郡,英国)得到显示。聚偏二氟乙烯膜(Immobilon-P)从微孔中获得公司(美国贝德福德,MA)。

2.2。植物材料

整个工厂的Crossostephium对(l)牧野(菊科)收集2007年7月在台中,台湾。凭证标本(CMU 2007080102 b1)沉积的中国医药科学和中药资源,药学院,台中,台湾,中国医科大学。

2.3。提取和分离

干的植物紫荆(10公斤)和甲醇提取的详尽。粗甲醇糖浆提取的5倍n己烷。的n己烷提取物(320克)在硅胶使用色谱仪n己烷和层增加极性洗脱液和进一步的高效液相色谱纯化洗脱n -己烷:层(1:1)。东莨菪亭被筛选了己烷和再结晶EtOH 10%的层。东莨菪亭得到22毫克。

2.3.1。东莨菪亭

无色针了n-hexane-EtOAc,议员是204 - 205°C。1核磁共振(acetone-d₆):δ7.85 (1 h, d,J= 9.4),7.20 (1 h, s), 6.80 (1 h, s) 6.15 (1 h, d,J= 9.4),3.90 (3 h, s);种(50 MHz, acetone-d₆):δ161.2,151.9,151.0,146.0,144.6,113.3,112.1,110.0,103.7,56.7,eim:米/z(相对强度):192 (M⁺,100),177 (70),164 (28)149 (59)。IR (CHCl₃)νmax 3536、1719、1576、1516、1296厘米⁻¹(<一个href="#B8">8]。

2.4。动物

印迹控制区域(ICR;6 - 8周男性)老鼠从BioLASCO获得台湾有限公司有机玻璃有限公司动物们被关在笼子里的恒温22±1°C,相对湿度55±5%和12 h暗光周期前至少2周的实验。他们提供食物和水随意。所有试验程序进行根据美国国立卫生研究院指导实验室动物保健和使用的。安慰剂组有0.1毫升/ 10 g生理盐水腹腔内使用弯曲钝化27-gauge针连接到1毫升注射器。所有测试的指导下进行国际疼痛研究协会(<一个href="#B9">9]。

2.5。醋酸段扭动响应

打滚是引起腹腔内(i.p。)注入0.1 mL / 10 g醋酸溶液(10毫升/公斤)。积极控制动物使用印度(10毫克/公斤,i.p。)醋酸前25分钟。每个东莨菪亭管理组是使用1毫克/公斤,5毫克/公斤,或10毫克/公斤i.p。25分钟前醋酸。五分钟后i.p。注射醋酸,扭动和伸展记录(<一个href="#B10">10,<一个href="#B11">11]。

2.6。福尔马林测试

药物的antinociceptive活动决心使用福尔马林测试被Dubuisson和丹尼斯<一个href="#B12">12]。20毫升的5%福尔马林被注入的背表面的后爪老鼠后30分钟i.p。政府的东莨菪亭(1、5、10毫克/公斤)或挪作他用。老鼠注射福尔马林观察30分钟后,和注射后时间舔爪子被记录。后的第一个5分钟注射福尔马林被称为早期阶段和时期15分钟和40分钟之间的后期阶段。所花费的总时间舔或咬受伤的爪子(疼痛行为)用秒表测量。活动被记录在5分钟的间隔。

2.7。λ-Carrageenan-Induced水肿

东莨菪亭的抗炎活动是由Carr-induced水肿测试后爪的老鼠。雄性ICR小鼠(每组8 g)年龄在18岁至25岁之间的被禁食24小时之前用免费水实验。50毫升1%暂停卡尔的盐水制备前30分钟每个实验和注入右足底的一面后老鼠的爪子。东莨菪亭和印度尼西亚都悬浮在二层80 + 0.9% (w / v生理盐水。80年的最终浓度渐变不超过5%,不造成任何可检测炎症。1.5小时后,东莨菪亭(1、5、10毫克/公斤)或印度(10毫克/公斤)腹腔内接种前卡尔治疗。爪子成交后立即测量卡尔注入和1,2,3,4,5 h间隔后edematogenic代理的管理使用plethysmometer(型号7159,尤格Basile,瓦雷泽,意大利)。肿胀的程度评估了诱导率一个/b,在那里一个的体积是正确的后爪卡尔治疗后,然后呢b是正确的体积后爪卡尔治疗前。印度作为一个积极的控制(<一个href="#B13">13]。5 h后,动物牺牲,Carr-induced水肿爪子切割和存储在−80°C。血液样本被撤回,保持在−80°C。

因此,正确的后爪组织拍摄5 h。正确的后爪组织在冰冷的生理盐水冲洗,立即放置在冷生理盐水四倍体积和均质在4°C。然后匀浆离心机在12000 g×5分钟。浮在表面的获得和存储在−20°C冰箱MDA和抗氧化酶(猫、SOD、GPx)活性测定。样品的蛋白浓度是由布拉德福德染色法测定(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。

2.8。MDA测定

评估了MDA硫代巴比土acid-reacting物质(流泪)方法(<一个href="#B14">14]。简而言之,MDA与硫代巴比土酸反应的酸性高温,并成立了一个red-complex TBARS。的吸光度TBARS决心在532海里。

2.9。测量一氧化氮/亚硝酸盐

生产没有评估间接通过测量等离子体的亚硝酸盐水平取决于量热方法基于格里斯反应(<一个href="#B15">15]。血浆样本稀释四倍通过添加1/20体积的蒸馏水和脱去蛋白质的硫酸锌(300 g / L)的最终浓度15 g / L。在10000×g离心5分钟后在室温下,100μL上层清液应用于微量滴定板好,其次是100μL格里斯试剂(1%磺胺和0.1%N多磷酸1-naphthylethylenediamine盐酸盐在2.5%)。经过10分钟的颜色开发在室温下,吸光度测量在540 nm胶片阅读器(美国佛罗里达州亥伯龙神,Inc .)。亚硝酸盐被以硝酸钠为量化标准曲线。

2.10。测量肿瘤坏死因子-α和铂族元素₂通过酶联免疫吸附试验(ELISA)

肿瘤坏死因子的水平α和铂族元素₂确定使用商用酶联免疫试剂盒(BioSource International Inc .,打击士气,CA)根据制造商的指示。肿瘤坏死因子-α和铂族元素₂从标准曲线测定<一个href="#B16">16]。

2.11。抗氧化酶活性的测量

以下生化参数分析检查东莨菪亭在爪子水肿组织的抗氧化活性下面的方法。总超氧化物歧化酶(SOD)活性的抑制细胞色素减少(<一个href="#B17">17]。减少细胞色素是由超氧化物阴离子生成的黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统和监控在550海里。一个单位的草皮被定义为所需的酶,抑制细胞色素减少了50%。过氧化氢酶(CAT)活性的评估是基于Aebi [<一个href="#B18">18]。总之,减少10毫米H₂O₂20毫米的磷酸盐缓冲剂(pH值7)监测通过测量吸光度在240海里。活动是由使用摩尔吸光系数,计算和过氧化氢酶活性被定义为nanomoles消散每分钟每毫克的蛋白质。总GPx活性细胞溶质被确定为之前报道(<一个href="#B19">19,<一个href="#B20">20.]。酶的解决方案是添加到混合物中含有过氧化氢和谷胱甘肽在0.1毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH值7.2);和340海里的吸光度测定。活动评估从校准曲线,酶活性被定义为nanomoles NADPH的每分钟每毫克蛋白氧化。

2.12。免疫印迹分析伊诺和cox - 2

总蛋白提取与里帕的解决方案(radioimmuno-precipitation分析缓冲区)−20°C过夜。我们用BSA(牛血清白蛋白)作为蛋白质相同细胞总蛋白量标准来计算。蛋白质样品(30μg)被变性解决钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)使用标准的方法,然后被转移到PVDF膜electroblotting和1% BSA阻塞。主要的探讨了膜抗体(进气阀打开,cox - 2,β肌动蛋白)在4°C一夜之间,洗了三次PBST和孵化1 h与辣根过氧化物酶在37°C共轭二次抗体。膜清洗三次,增强化学发光免疫反应性的蛋白质进行检测(ECL)使用hyperfilm和ECL试剂(Amersham国际公司。英国白金汉郡)。免疫印迹分析的结果量化测量的相对强度比控制使用柯达分子成像软件和相对强度来表示。

2.13。组织学检查

组织学检查、活检的爪子被5 h后intraplantar注入的卡尔。组织切片固定在Dietric解决方案(14.25%乙醇、1.85%甲醛、1%乙酸)在室温下1周,由梯度乙醇脱水,嵌入Paraplast(舍伍德医学)。部分(厚度5μm)与三色的范Gieson deparaffinized二甲苯和彩色。所有样本与BH2奥林巴斯显微镜观察和拍照。组织学检查的组织切片显示过度炎症反应与大量中性粒细胞浸润多形核白细胞(中性粒细胞))(显微镜。中性粒细胞的数量在每个计算范围(),之后获得的平均每个组织切片的从5数范围。

2.14。统计分析

数据表示为均值±S.E.M.统计学评价是由单向方差分析(方差分析其次是矫正的多个范围测试)。统计学意义是表示为*,* *和* * *。

3所示。结果

3.1。影响的东莨菪亭Acetic-Induced扭动的回应

腹部拉伸的累积量与醋酸的水平段疼痛(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ecam/2012/595603/fig1/" target="_blank">1 (b))。东莨菪亭治疗(1毫克/公斤)相比显著地抑制扭动的数量与正常对照组()。东莨菪亭(5或10毫克/公斤)进一步降低扭动的数量(或),但印度(10毫克/公斤)演示了抑制比东莨菪亭。

3.2。福尔马林测试

东莨菪亭(1毫克/公斤)显著()抑制formalin-induced疼痛后期阶段(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ecam/2012/595603/fig1/" target="_blank">1 (c))。然而,它没有任何抑制早期阶段。积极控制印度(10毫克/公斤)也显著()抑制formalin-induced痛苦晚期阶段。

3.3。影响的东莨菪亭λ-Carrageenan-Induced老鼠爪子水肿

如图<一个href="//www.newsama.com/journals/ecam/2012/595603/fig2/" target="_blank">2(一个),Carr-induced爪子水肿。东莨菪亭(10毫克/公斤)显著地抑制()发展的爪子水肿引起卡尔第3和4小时后的治疗。印度(10毫克/公斤)显著降低Carr-induced爪子水肿治疗第3和4小时后()。

3.4。东莨菪亭对MDA水平测量的影响

在图<一个href="//www.newsama.com/journals/ecam/2012/595603/fig2/" target="_blank">2 (b),我们表示东莨菪亭(1或5毫克/公斤)降低MDA水平在水肿爪子5小时后卡尔注入(或)。和东莨菪亭(10毫克/公斤)减少水肿爪子和血清MDA水平5小时后卡尔注入()。

3.5。东莨菪亭对没有水平的影响

在图<一个href="//www.newsama.com/journals/ecam/2012/595603/fig2/" target="_blank">2 (c)血清NO水平显著增加,水肿5 h卡尔注射后()。东莨菪亭(5或10毫克/公斤)显著降低血清没有水平(或)。挪作他用的抑制效力是类似于(10毫克/公斤)在5 h后归纳。

3.6。东莨菪亭对肿瘤坏死因子的影响α和铂族元素₂水平

肿瘤坏死因子-α和铂族元素₂在血清水平显著增加5 h后卡尔注入()。然而,东莨菪亭(10毫克/公斤)降低TNF -α水平和铂族元素₂卡尔在血清5 h后注入(),以及10毫克/公斤挪作他用(数字<一个href="//www.newsama.com/journals/ecam/2012/595603/fig2/" target="_blank">2 (d)和<一个href="//www.newsama.com/journals/ecam/2012/595603/fig2/" target="_blank">2 (e))。

3.7。抗氧化酶的东莨菪亭对活动的影响

在卡尔的intrapaw注射后5小时,爪子水肿组织也SOD等生化参数分析,猫,GPx活动(表<一个href="//www.newsama.com/journals/ecam/2012/595603/tab1/" target="_blank">1)。SOD, CAT, GPx活动爪水肿组织被卡尔政府大幅减少。SOD, CAT和GPx活动被治疗后显著增加10毫克/公斤东莨菪亭和10毫克/公斤挪作他用)(表<一个href="//www.newsama.com/journals/ecam/2012/595603/tab1/" target="_blank">1)。

3.8。影响的东莨菪亭Carr-Induced伊诺和cox - 2蛋白表达在老鼠爪子水肿

调查没有生产的抑制是否由于伊诺和cox - 2蛋白水平降低,东莨菪亭在伊诺和cox - 2蛋白表达的影响,研究了通过免疫印迹。结果表明,注射东莨菪亭(10毫克/公斤)对5 h Carr-induced抑制伊诺和cox - 2蛋白表达在老鼠的爪子水肿(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ecam/2012/595603/fig3/" target="_blank">3(一个))。蛋白带的强度进行了分析通过使用柯达软件在三个独立的实验中,数量的差别显示平均81.6%和72.4%对这些伊诺和cox - 2蛋白在治疗后分别与东莨菪亭而独自Carr-induced(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ecam/2012/595603/fig3/" target="_blank">3 (b))。此外,蛋白质表达显示平均的61.6%和57.1%下调伊诺和cox - 2蛋白在治疗后与印度在10.0毫克/公斤相比Carr-induced孤单。伊诺的下调和cox - 2的活性东莨菪亭(10毫克/公斤)比印度(10.0毫克/公斤)。

3.9。组织学检查

控制动物的爪子活检显示标记在结缔组织细胞浸润。胶原纤维之间的浸润积累,进入细胞间隙。爪子活检动物提取物,治疗剂量10毫克/公斤,显示Carr-induced减少炎症反应。实际上炎症细胞数量减少,局限于血管附近的地区。细胞间的空间没有任何细胞的渗透。胶原纤维是常规的形状,减少细胞间的空间。此外,皮下组织结缔组织并未损坏(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ecam/2012/595603/fig4/" target="_blank">4(一))。中性粒细胞与卡尔通知增加治疗()。印度和东莨菪亭(10毫克/公斤)可以显著降低中性粒细胞数量比Carr-treated集团()(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ecam/2012/595603/fig4/" target="_blank">4 (b))。

4所示。讨论

东莨菪亭显示疲弱抑制活动对脲酶和alpha-chymotrypsin酶(<一个href="#B21">21]。抗癌潜力的东莨菪亭素馨属它们之前展示的在体外和在活的有机体内研究[<一个href="#B22">22]。细胞毒性东莨菪亭来自活动青蒿对癌细胞的报道(<一个href="#B23">23]。据报道,东莨菪亭也通过抑制肿瘤坏死因子的释放,抗炎作用α,il - 1β,铂族元素₂,il - 6和抑制cox - 2的表达在原始264.7巨噬细胞(<一个href="#B4">4]。因此,在这项研究中,我们关注antinociceptive的影响和抗炎作用的东莨菪亭进行客观的阐明他们的信号机制发挥作用在活的有机体内。腹腔内(i.p。)注射醋酸生产腹膜炎症(急性腹膜炎),导致腹部肌肉的收缩反应特征伴随一个扩展的前肢和身体的延伸<一个href="#B24">24]。这项研究是基于两个基本假设:重复演示与福尔马林疼痛刺激的应答模式在一个特定的上下文背景会导致老鼠一个关联条件疼痛的反应,和关联调节疼痛的刺激会导致疼痛敏感性的变化(<一个href="#B25">25]。

醋酸翻滚测试是用于研究外周镇痛药物的影响。尽管这个测试是特异性的,它被广泛用于镇痛筛查(<一个href="#B26">26]。在我们的研究中,我们发现,东莨菪亭antinociceptive展出效果乙酸段扭动的回应。这种效应可能是由于抑制花生四烯酸代谢产物的合成。Formalin-induced爪子疼痛已被确立为一个有效的镇痛研究模型在活的有机体内。众所周知,福尔马林试验产生了截然不同的两相的疼痛反应(第一阶段:0 - 5分钟和第二阶段:15-45 min) (<一个href="#B27">27]。因此,测试可以用来澄清的可能机制antinociceptive提议镇痛的效果。集中作用药物如阿片类药物抑制同样两个阶段,但外围地药物如阿斯匹林和印度尼西亚只抑制后期阶段(<一个href="#B28">28]。东莨菪亭的抑制作用对疼痛的反应后期阶段的福尔马林试验表明,东莨菪亭的antinociceptive效应可能是由于其外围的行动。本研究的结果表明,东莨菪亭能够诱导主音的镇痛和抗炎作用在两个algesiometric模型(醋酸扭动或福尔马林测试)类型的疼痛。

在活的有机体内抗炎活性,Carr-induced水肿测试,对非甾体类抗炎药物高度敏感,一直被认为是一个有用的炎研究新的抗炎药物的工具(<一个href="#B29">29日]。Carr-induced水肿的测试是一个有用的模型来确定天然产物的抗炎作用[<一个href="#B30">30.]。根据图<一个href="//www.newsama.com/journals/ecam/2012/595603/fig2/" target="_blank">2(一个)肿胀的程度,Carr-injected爪子最大三小时后注入,当时体积和平均增加约100%的对照组。统计分析显示,东莨菪亭抑制Carr-induced爪子水肿的发展后,三小时的治疗,明显。

Carr-induced炎症反应与中性粒细胞浸润和neutrophils-derived自由基的生产以及其他neutrophils-derived介质的释放<一个href="#B31">31日]。一些研究表明,炎症效应引起的卡尔与自由基有关。自由基,时释放前列腺素,没有将管理与卡尔1 - 6 h (<一个href="#B32">32]。MDA生产是由于自由基攻击质膜。在许多病理生理条件与炎症有关,这些活性氧提出调解细胞损伤通过一系列独立的机制包括脂质过氧化反应的起始,失活的各种抗氧化酶(<一个href="#B32">32]。给氧化状态的重要性水肿的形成,抗炎效应表现出的药物在这个模型可能与其抗氧化作用有关。

我们目前的结果还证实Carr-induced爪子水肿模型结果生产没有和铂族元素₂。大量的没有过剩和铂族元素₂发挥重要作用在慢性炎性疾病的加重。科学论文被观察到,而没有和铂族元素的生产₂被老鼠巨噬细胞生264.7中的NOS抑制剂细胞,这些抑制性效应被coincubation逆转没有合成的前体,精氨酸(<一个href="#B7">7]。此外,伊诺活动由非选择性抑制NOS抑制剂减毒没有同时在LPS-activated巨噬细胞和前列腺素的释放,这表明内生发布时没有从巨噬细胞产生了刺激行动增强前列腺素的生产(<一个href="#B33">33]。众所周知,印度徒在几个方面在这个模型中炎症,抑制前列腺素的合成和渗透的血浆蛋白和中性粒细胞炎症网站(<一个href="#B34">34]。卡尔爪子水肿引起的抑制3小时正值高峰水肿,抑制cox - 2 (<一个href="#B30">30.]。在我们的研究中,没有和铂族元素的水平₂被治疗显著降低5和10毫克/公斤东莨菪亭。肿瘤坏死因子-α是一个中介Carr-induced炎症无能力,能够诱导细胞分裂素的进一步释放,白细胞三烯,建议有一个重要的角色在维护持久的疼痛的反应(<一个href="#B35">35]。在这项研究中,我们发现东莨菪亭降低TNF -α卡尔注射后血清中水平。

各种生物的存在可以评估这些产品的抗炎活性,证明了东莨菪亭具有抗炎活性在活的有机体内炎症模型。在这个模型的急性炎症,肿瘤坏死因子-α,不,和铂族元素₂释放与东莨菪亭小鼠血清预处理后显著下降(<一个href="#B29">29日]。有显著增加SOD,猫,GPx活动与东莨菪亭治疗。此外,有一个与东莨菪亭治疗显著降低MDA水平。我们假设MDA生产的抑制可能是由于增加SOD,猫,GPx活动。总之,这些结果表明,东莨菪亭具有镇痛和抗炎作用。东莨菪亭的抗炎机制可能与伊诺和cox - 2的活动(<一个href="#B36">36),它与抗氧化酶的活动的增加(SOD, CAT, GPx)。可以使用东莨菪亭作为药理剂预防或治疗疾病的自由基形成致病因素。

确认

作者要感谢国家科学委员会的财政支持(nsc101 - 2313 - b - 039 - 002 - my3和NSC 101 - 2320 - b - 039 - 027),中国医科大学(CMU) (CMU100-ASIA-15和CMU101-AWARD-08),和台湾卫生部临床试验和研究卓越中心(doh101 - td - b - 111 - 004)。