文摘
在当前的研究中,我们调查的影响精炼QKL ischemia-reperfusion-induced脑损伤的老鼠。方法。老鼠用来诱导脑缺血再灌注损伤的大脑中动脉阻塞(MCAO)。RQKL解决方案是采用不同剂量(0、1.5、3和6毫升/公斤体重)同时缺血的发作,和在不同的时间点剂量的1.5毫升/公斤(0、1.5、3、6和9 h MCAO后)。神经功能,检测细胞凋亡和脑梗死和ROS在前额叶皮层MCAO后24小时进行评估,和免疫印迹和细胞内钙也进行了研究,分别。结果。RQKL剂可以改善神经功能,减少脑梗死,表现显著影响0,1.5,3、6 h组。此外,RQKL能够减少凋亡过程减少caspase-3表达式,或克制eIF2a磷酸化和caspase-12激活。它也能够减少ROS和调节细胞内钙在大脑中。结论。RQKL可以防止ischemic-induced脑损伤的时间窗口6 h,和其机制可能与抑制ER stress-mediated凋亡信号。
1。介绍
缺血性中风是一种危及生命的疾病,发病率和死亡率高。研究新的药物是缺血性中风研究的热点和难点。中风治疗学术委员会工业圆桌会议提出,研究脑缺血的药物应注意其制药窗口(1,2]。在临床实践中,治疗中风患者总是推迟发病后,和治疗的时间管理与治疗效果高度相关。
Qingkailing (QKL)注入最初是由北京中医药大学在1970年代,通过修改传统的中药,Angongniuhuang药片,组成的板蓝根,金银花,外耳胎美国网球黄芩苷,栀子、胆酸、猪去氧胆酸角Bubali(3]。它已经被广泛用于治疗脑血管疾病的严重阶段,表现极好地改善神经功能4]。动物实验表明,QKL注射能促进内皮一氧化氮合酶的表达,减轻钙超载,调节矩阵metallopeptidase 9的表达,抑制炎症的小鼠模型脑缺血/再灌注(5- - - - - -8]。然而,QKL面对近年来从药品安全监管障碍,严重尴尬其临床应用(9]。QKL组成的复杂的组件是质量稳定和临床安全的核心问题。在此基础上,我们开发了精制Qingkailing (RQKL),针对急性缺血性中风。
精制Qingkailing (RQKL)注入由胆酸、猪去氧胆酸、黄芩苷、栀子苷(图1)。黄芩苷是来自的干燥根黄芩格奥尔基命名为黄秦在中国传统医学(中医),和栀子苷的干果中提取出来的栀子埃利斯命名为中医之子。药草提供卓越的抗氧化和抗炎作用[10- - - - - -13]。胆酸和猪去氧胆酸都是胆汁酸和有保护神经的影响14,15]。此外,四个组件的结合可以显著提高其有效性(16]。
(一)猪去氧胆酸
(b)黄芩苷
(c)栀子苷
胆酸(d)
内质网(ER)调节蛋白质合成,蛋白质折叠和贩卖,细胞应对压力,和细胞内钙含量(17]。的环境损害的功能,指定“ER应激”,可以导致ER展开蛋白质的积累腔(18]。然而,如果压力太严重,展开的蛋白质反应最终启动凋亡通路(19]。ER应激细胞死亡已被证明涉及caspase-12[的激活20.,21),而另一个组件的ER stress-mediated凋亡通路elf-2a [22]。多项研究表明,脑缺血病理ER应激源,它可以触发关闭的蛋白质翻译和细胞凋亡,表明ER在脑缺血中起着重要作用[23,24]。因此,降低ER应激可能提供一种治疗的方式阻止脑缺血引起的病理过程(18,24]。
本文旨在解释的剂量效应和治疗时间窗RQKL MCAO啮齿动物,以及精心设计的干预RQKL对神经元凋亡的影响由于脑缺血后ER应激。
2。材料和方法
2.1。动物
我们使用了154名健康,男,昆明小鼠体重25 - 28 g和90名健康男性,C57BL / 6小鼠体重25 - 30 g,从重要的河实验室,购买中国北京(没有。SCXK(北京),2006 - 0009年)和安置在中央实验室,北京中医药大学在12 h:光暗周期25±1°C, 40 - 60%的相对湿度和自动昼夜节律,小鼠自由访问标准实验室食物和自来水。程序涉及动物及其护理进行了符合机构的指导方针符合国家卫生研究院指导实验室动物保健和使用的,国家卫生研究院出版。85 - 23日,1985。
2.2。药物
QKL注入,由胆酸、外耳胎美国网球(粉)、猪去氧胆酸栀子,角Bubali(粉)板蓝根、黄芩苷和金银花(25),购买从北京中医药大学的制药厂(没有。813204 a)。RQKL注入,由胆酸、猪去氧胆酸、黄芩苷、栀子苷(图1)。4成分比例和浓度符合QKL注入。RQKL鸿运Du教授提供的注入是隶属于学院中药学,北京中医药大学。
2.3。MCAO模型建立
老鼠用4%水合氯醛麻醉(350毫克/公斤),继续加热灯下保持体温°C。解剖显微镜下(SXE-1、上海精密仪器、上海、中国),右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉暴露很仔细,颈外动脉是凝固末端分叉。一个直径0.16毫米的尼龙长丝(齿顶圆直径mm;北京Sunbio生物科技、北京、中国)通过颈外动脉插入树桩,轻轻的先进10毫米封闭大脑中动脉的起源(26,27]。动物的体温维持在37°C。灯丝后删除1.5 h。术后,老鼠分别被安置。神经功能评估,当老鼠清醒(28];那些分数小于2被排除在外。
2.4。实验动物分组和RQKL注入
在剂量的实验中,高,温和,低剂量RQKL注入和QKL注入和模型组注射6 3,1.5毫升/公斤RQKL和3毫升/公斤QKL或同等体积的生理盐水,分别通过尾静脉(7]。注射稀释与不同浓度的盐水和最后剂量注入到每个动物9毫升/公斤。第一次注射后立即进行模型建立,其次是政府4 h后,之后,每隔12 h。
时间窗口的实验中,模型组注射生理盐水,和每个RQKL组RQKL(3毫升/公斤)使用生理盐水稀释,通过尾静脉。在模型和0 h组小鼠,第一次注射与大脑中动脉,同时被阻塞。其他组收到RQKL注射为1.5,3、6、9 h MCAO后,紧随其后的是第二次注射后4 h,此后每12 h (29日),图3(一)。
2.5。局灶性脑缺血/再灌注后的神经功能评估使用克拉克分数
小鼠神经功能是使用盲法评估模型建立后24小时。克拉克分数(28包括焦和一般的神经功能,反映缺血foci-induced神经功能损伤和通用功能,分别。局部神经功能从0-28得分,和普通函数从0-32不等。正常小鼠得分为0。高分反映严重神经功能损伤。
2.6。梗死体积的评估
神经功能评价后,老鼠牺牲,和大脑收获了TTC染色(南京Greensynthesis生化有限公司,南京、江苏、中国)。梗死体积的百分比为代表的整个大脑脑梗死的程度。连续冠状部分(1毫米厚度)准备和浸泡在2% TTC磷酸盐缓冲剂在37°C在黑暗中10分钟。正常脑组织被染成红色,而梗塞组织没有彩色(白色)。浸泡在4%多聚甲醛的部分磷酸缓冲30分钟,安排在秩序和扫描(清华Unisplendour A688,西安,中国)。地区的红色和白色染色测定使用电脑颜色多媒体图像分析系统(Image-Pro Plus6.0,媒体控制论,怀俄明州,美国)。梗死的百分比由方程给出:%梗塞体积=梗塞体积/总额片×100 (30.,31日]。
2.7。TUNEL染色
经过24小时的复苏,动物使安乐死和大脑迅速移除,冻结,切成20μ片。末端转移酶的dUTP尼克结束标记(TUNEL)染色进行使用工具包程序性细胞死亡(原位细胞死亡检测装备,咯红、罗氏、美国)根据制造商的指示32]。前额叶皮层的部分被收集。五个方面考察了每个部分的荧光显微镜(德国蔡司,LSM510元)缺血性脑前额叶皮层和TUNEL-positive细胞被量化(18]。
2.8。测量ROS生成
大脑活性氧(ROS)生产决定使用dihydroethidium(她)microfluorography [33]。她是一个细胞渗透染料,可氧化成ethidium由超氧化物和其他产品(33,34]。动物被牺牲在MCAO后24小时,大脑被移除,冻结,切割(20μ低温恒温器厚度)。前额叶皮层的部分被收集。ROS荧光检测设备(美国怀俄明州Genmed)使用。她的解决方案是过冷对大脑部分60分钟,荧光强度是由荧光显微镜检测(德国蔡司,LSM510元)。五个不同的字段的荧光强度的大脑部分被平均,表示为相对荧光单位(RFU) [35]。
2.9。免疫印迹
老鼠牺牲后24 h(脑缺血,前额皮质是收集和匀浆在冰浴。蛋白质分离和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶electropheresis转移到硝化纤维膜。屁股被封锁与脱脂奶粉5%磷酸缓冲盐,pH值为7.6,0.1% Tween-20缓冲区,然后用antiphospho-eIF2孵化(Ser51)多克隆抗体(细胞信号技术公司,东京,日本),anti-caspase12多克隆抗体(细胞信号技术公司,东京,日本),或anti-caspase3 (8 g10)多克隆抗体(细胞信号技术公司,东京,日本),随后与二次孵化anti-rabbit抗体结合辣根过氧化物酶。最后,膜处理使用ECL检测系统。
2.10。细胞内钙的测定
细胞内钙离子浓度测量通过流式细胞术使用Fluo-3AM荧光像前面描述的那样36,37]。小鼠大脑中动脉闭塞后被牺牲了2 h或闭塞10 h后再灌注2 h。前额皮层和海马分离在冰浴和准备成细胞悬液。细胞密度与D-Hanks调整解决方案1×106。悬挂在37孵化为10分钟,然后2μL /毫升Fluo-3AM染料工作的解决方案是添加并混合均匀。混合解决方案是在37°C孵化40分钟在黑暗的地方。流式细胞术(流式细胞仪石中剑,正欲,美国)分析与激发波长488 nm和发射波长528 nm)。结果表示为平均荧光强度(MFI) [37,38]。
2.11。统计分析
数据分析使用SPSS 16.0(美国SPSS,芝加哥,IL)。单向方差分析是紧随其后的是事后分析的意义与Student-Newman-Keuls多重比较检验。所有的值表示为±SEM。的值被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。剂量反应RQKL的局灶性脑缺血/再灌注
3.1.1。剂量反应对梗死体积的影响
小鼠局灶性脑缺血/再灌注RQKL注射不同剂量。梗塞病灶明显在老鼠的大脑缺血/再灌注后24小时。与模型组相比,梗塞大小降低了49%,48%,55%和37% ()QKL和高、中等和低剂量RQKL注射组,分别为(图2(一个))。
(一)
(b)
(c)
3.1.2。剂量反应对神经系统功能的影响
MCAO之前,大量的局部神经功能和一般神经功能是0。老鼠发达的神经功能损伤MCAO后24小时;然而,QKL和所有剂量的RQKL改善损伤较模型组(或)。我们的初步实验的结果是一致的29日]。组接受温和QKL RQKL剂量(3毫升/公斤)表现出最大的改进()。中等和高剂量RQKL注入能够恢复局部神经功能();然而,低剂量组的效果相对较差(),数据2 (b)和2 (c)。
3.2。RQKL的治疗时间窗
3.2.1之上。脑梗塞治疗后体积与RQKL 0, 1.5,缺血后3、6、9 h
在初步实验中,我们发现QKL广泛的治疗时间窗29日]。在这项研究中,RQKL也显示广泛的时间窗口。注射3毫升/公斤RQKL最有效地减少梗死体积和改善神经功能,所以这个剂量是在时间窗口的实验中使用。RQKL注入在0、1.5、3、6 h后缺血显著降低脑梗塞体积(或)。最大的梗塞体积减少(68%)在0 h组与模型组相比)。减少梗死体积百分比逐渐下降,增加延迟之前QKL注入(梗塞大小:55%、50%、39%,1.5,3和6 h组,分别地)。然而,9 h组比模型组脑梗死体积减少18%,但是没有意义()(数据3 和3 )。
3.2.2。治疗后神经功能评分与RQKL 0, 1.5,缺血后3、6、9 h
与剂量实验一致,总体和局部神经功能显著提高0 h组()。在其他治疗组,RQKL注入为1.5,3,MCAO后6 h显著增强总体和局部神经功能(),但是政府在9 h并不是有效的。然而,随着第一个治疗时间延迟,影响逐渐降低。6和9的局部神经功能h组明显低于0 h组(,职责),而一般的神经功能9 h组明显低于0 h组()(数据3 和3 )。
3.2.3。RQKL对神经元凋亡的影响
细胞凋亡是一种重要的脑缺血/再灌注后的神经损伤机制(18]。TUNEL法调查是否凋亡效应被RQKL参与神经保护。凋亡细胞中观察到虚假的小鼠的大脑组织。大量TUNEL-positive在前额叶皮层神经元观察缺血后24小时。后QKL(3毫升/公斤)或RQKL(6 3和1.5毫升/公斤)注射,TUNEL-positive神经元显著减少的数量(数字4(一),4(b)4(c))。这表明RQKL减少凋亡细胞的数量在MCAO老鼠的大脑。与此同时,antiapoptosis RQKL dosedependence显示的效果。
3.2.4。Caspase-3 RQKL对蛋白质含量的影响,Pro-Caspase12, P-eIF2α
Caspase-3蛋白质在细胞凋亡是一个重要的关键。此外,众所周知,caspase-3后诱发缺血性侮辱(39]。在这项研究中,caspase-3皮层显著增加,而QKL和RQKL注射明显减少了蛋白质水平(数字5(一个)和5 (b))。Caspase-12在凋亡细胞死亡过程中发挥作用的ER应激(20.]。因此,我们研究的影响RQKL治疗缺血后caspase-12感应的。免疫印迹分析表明,caspase-12被激活后24 h分,就是明证procaspase-12的水平下降,主要由QKL恢复和RQKL(大约50%恢复与模型组相比)(数据5(一个)和5 (c))。ER应激引起的脑缺血的一个关键特性是阻塞的翻译起始步骤,所表示的增加eIF2的磷酸化(40,41]。因此,我们研究是否RQKL eIF2磷酸化的影响α。phospho-eIF2水平α在受伤的皮层明显增加缺血后24小时,而注入QKL或RQKL明显减少phospho-eIF2的水平α减少(约30 - 60%,与之相比,模型组)(数据5(一个)和5 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2.5。抗氧化RQKL注入的影响
活性氧的生产检测用她染色。如(图所示6 和6 ,没有荧光明显虚假的老鼠的大脑。大量的神经细胞荧光导致显著增强荧光在前额叶皮层MCAO后24小时。QKL和RQKL治疗后,荧光神经细胞的数量减少,,荧光强度减弱,这表明RQKL减少活性氧的生产。定量分析表明,荧光在大脑皮层明显减少RQKL剂量组与模型组相比,(,图6 )。这是符合我们以前的工作,QKL注射液有抗氧化效果(29日]。
3.2.6。细胞内钙
如图7、细胞内钙2 +显著增加缺血2 h后,明显比虚假的集团(),而注入RQKL明显减少了Ca2 +内容。然而,对于老鼠痛苦2 h缺血再灌注后10小时时,细胞内钙2 +海马细胞增加,RQKL没有显著减少。所以RQKL只进行调制的影响细胞内钙在缺血后早期。
4所示。讨论
QKL注入是一个著名的中药广泛用于中国三十多年了。然而,由于国家事故数据记录器监控中心发现第一例过敏性反应后QKL管理局2001年11月,医学期刊发表了一些案例报告药品不良反应和不良事件由于其使用,于是QKL注射的安全性成为了舆论的焦点(9]。更多的关注已附加到药品安全的中国传统医学(中医),以及效率。重建中国著名医学公式是一种新的方式来提高中医,这是重要的中药的现代化和全球化。针对急性缺血性中风的迹象之一QKL,我们精制QKL小说医学,即RQKL。QKL的只有四个组件组成的,具有质量稳定和药物安全的优势。在这项研究中,我们研究的效率和治疗时间窗RQKL使用MCAO老鼠,而QKL。RQKL的结果表明,注射剂量的1.5,3、6毫升/公斤保护大脑免受缺血性损伤,就是明证减少梗死体积和神经功能。最重要的是,政府提供的RQKL治疗窗宽6 h。
药物是有效的时间窗不同药物之间,通常介于2 - 4 h缺血性中风药物(42- - - - - -44),但偶尔也会扩展到12 h (45]。政府以外的治疗窗可以减少甚至取消药效。本研究定义了治疗窗口RQKL注射治疗脑缺血。不兼容QKL, RQKL还可以显著降低梗死体积和改进的焦点和一般神经功能管理在缺血后广泛的时间窗口。RQKL注射后6 h缺血明显减少梗塞体积和改善神经功能,所以治疗窗口为MCAO RQKL注入老鼠可以延长到6 h。这可能是获利的multimechanisms复合中药,它表现出非凡的促进内皮一氧化氮合酶表达的影响,减少钙超载,调节矩阵metallopeptidase 9表达和抑制炎症的小鼠模型脑缺血/再灌注(5- - - - - -8]。
在这项研究中,我们发现RQKL可以有效地抑制细胞凋亡在活的有机体内。RQKL治疗显著地抑制细胞凋亡在活的有机体内缺血性条件,指出通过TUNEL化验的结果。此外,目前的研究结果表明,RQKL在缺血性损伤的保护作用可能部分药用ER功能障碍的恢复。先前的研究表明,线粒体在缺血后神经元细胞凋亡中发挥核心作用。然而,最近的研究表明,ER损伤参与了脑缺血引起的神经细胞死亡(23,24,46]。在目前的研究中,我们调查了在病理条件下RQKL对ER功能障碍的影响。近年来报道的结果一致(18,47),在老鼠受到1.5 h缺血再灌注和22.5小时时,我们观察到一个eIF2的水平显著增加α磷酸化缺血皮层,这表明缺血/再灌注引起的严重的ER损伤。另一方面,治疗RQKL显著抑制p-eIF2α归纳。因此,RQKL缺血/再灌注损伤的保护作用可能是由于抑制ER应激和随后的凋亡信号通路。
ER应激细胞死亡已被证明涉及caspase-12的激活,而随后激活实施还存在诸如caspase-3 [20.,21,48,49]。Caspase-12特定的侮辱,引出ER应激和不是死proteolytically激活其他刺激20.]。以前的研究已经表明caspase-12激活永久和短暂性大脑中动脉闭塞后,和许多caspase-12阳性细胞表现出DNA碎片;另一方面,老鼠缺乏caspase-12更耐ER应激细胞凋亡(20.]。这表明caspase-12参与ischemia-induced凋亡的激活。我们发现caspase-12激活MCAO后24 h和RQKL显著抑制激活,这表明RQKL抑制caspase-12相关的凋亡途径。此外,RQKL还caspase-3水平显著下降。Caspase-3激活参与caspase-12介导凋亡级联,同时激活Caspase-3直接负责DNA碎片(20.,21,48]。可能caspase-3激活caspase-12被抑制。因此,RQKL可能抑制caspase-3激活通过抑制ER stress-mediated凋亡信号,因此减少细胞凋亡的程度。
研究表明,多种原因的ER应激发生在神经元脑I / R:细胞内钙稳态,聚合的蛋白质,蛋白质降解,减少活性氧的积累ER和高尔基体结构(50,51]。最近的研究表明,细胞内钙稳态的破坏可能引起压力和杀死细胞ER (52]。在这项研究中,我们发现缺血后细胞内钙明显提高2 h;另一方面,RQKL可以显著抑制细胞内钙2 +。像细胞内钙稳态,ROS也发挥了重要作用导致ER应激(51,53]。RQKL显示良好的抗氧化效果,特别是减少ROS证明了这一点。所以RQKL的ER应激抑制效应可能直接或由氧化以及细胞内钙调制。考虑到本研究的结果,我们推测,RQKL小说是一种很有前途的药物对急性缺血中风,它有多个神经保护作用,尽管其行动的机制需要进一步阐明。
缩写
| MCAO: | 大脑中动脉闭塞 |
| ROS: | 活性氧 |
| 呃: | 内质网 |
| RQKL: | 精制Qingkailing。 |
作者的贡献
问:小王负责资金和授权。构思、设计和f .程进行了实验研究和写论文的草稿。x中修订了纸和提供技术支持。陆y进行动物实验,本研究的构思和设计,参与论文写作。w .歌曲和d . Wang导致评估的研究。郭,x王、刘和w·赵参与动物实验和检测指数。f . Cheng和x中同等重要的作用。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
本研究支持的重大新药科技重大项目(Qingkailing注射治疗缺血性中风),没有。2009 zx09102 - 136。作者感谢鸿运Du,学院中药学,北京中医药大学,提供RQKL注入。