文摘

Bridelia ferruginea常用在非洲传统医学治疗各种炎症条件(TAM)。从植物提取物已被证明具有抗炎性质的在活的有机体内模型。在这项研究的影响b . ferruginea(BFE)描绘洪涝频发的铂族元素的生产2、亚硝酸盐和促炎细胞因子从LPS-stimulated BV-2小胶质细胞进行了研究。BFE cyclooxygenase-2上描绘洪涝频发的影响(cox - 2)和一氧化氮合酶(间接宾语)诱导蛋白表达进行评估在LPS-activated鼠初级小胶质细胞。NF -的角色κB和MAPK信号在BFE也描绘洪涝频发的行为进行调查。BFE(25 - 200描绘洪涝频发μg)抑制铂族元素的生产2亚硝酸盐,肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子α)和白细胞介素- 6 (il - 6)以及cox - 2和伊诺蛋白表达在LPS-activated小胶质细胞。进一步的研究来阐明BFE透露描绘洪涝频发的抗炎机制作用干扰核易位NF -κ通过机制包括抑制我Bp65κB降解。BFE阻止p38的磷酸化描绘洪涝频发,但不是p42/44或物MAPK。建议Bridelia ferruginea产生抗炎作用机制涉及p38 MAPK和NF -κB信号。

1。介绍

非洲传统医学(TAM)是一种速记引用非洲土著的愈合形式都是练习(1]。Bridelia ferrugineaBenth。(大戟科)是一种灌木受雇于TAM治疗关节炎和涂擦患处治疗瘀伤,疮,位错,烧伤(2,3]。茶制成的纸浆树皮用于发烧,头痛,刚度和风湿性疼痛和治疗水肿的本地应用程序(4]。早些时候,我们观察到的水提物b . ferruginea茎皮表现出抑制carrageenan-induced鼠爪子水肿和棉粒肉芽肿形成大鼠(5]。局部抗炎,抗关节炎药、解热、镇痛的植物也报道了我们(6]。我们还表明,干树皮中提取的b . ferruginea保护小鼠免受脂多糖(LPS)诱导脓毒性休克和抑制LPS-induced血管通透性7]。最近,Akuodor et al。8报道称,一个干树皮中提取的b . ferruginea表现出潜在的止痛和退热的属性在小鼠和大鼠。从植物中提取已报告演示在体外抗氧化活性的DPPH自由基清除实验(9]。尽管不同ethnopharmacological的应用b . ferruginea在炎症条件及其证明行动在活的有机体内据我们所知,但没有证据显示分子的目标(s)的抗炎行动。

环氧合酶(COX)是一种前列腺素的合成所需的酶。这种酶有两种亚型:cyclooxygenase-1 (COX-1)和cyclooxygenase-2 (cox - 2)。COX-1表达持续在大多数细胞类型,而cox - 2的表达是由各种因素包括炎性细胞因子和炎症过程的维护负责。

核factor-kappa (NF - BκB)是一个转录因子被认为是关键的中央监管机构的炎症过程。NF -κB控制基因的表达编码促炎细胞因子(il - 6、TNFαil - 1, - 2,等等),趋化因子(mcp-1引发,咆哮,等等),粘附分子(ICAM, VCAM E-selectin),诱导酶(cox - 2和间接宾语),生长因子,一些急性期蛋白,和免疫受体,这些都起到了至关重要的作用在控制主要炎症过程(10]。NF -κB因此成为药物开发的一个关键分子的目标,和几个天然和合成化合物抑制NF -追究他们的潜力κB (11]。

增殖作用(地图)激酶是细胞内酶使细胞响应刺激炎性细胞因子等从细胞外环境12]。MAPKs包括细胞外signal-regulated激酶(ERK 1/2), c-Jun n端激酶(物)和p38亚型。p38 MAPK通路已被证明发挥核心作用的表达和肿瘤坏死因子等促炎细胞因子的活性αil - 6, IL-7,引发许多细胞类型(13]。证据支持的重要性p38 MAPK在炎性疾病,如哮喘、类风湿性关节炎、系统性炎症,炎症性肠病,和大脑炎症,回顾了勇et al。13]。

在本研究中我们使用的中枢神经系统炎症细胞模型显示,茎皮中提取的b . ferruginea(BFE)描绘洪涝频发产生antineuroinflammatory行动通过抑制NF -信号的步骤κB和p38 MAPK。

2。材料和方法

2.1。植物材料

Bridelia ferruginea干树皮从树上收集生长在伊巴丹大学的校园,尼日利亚。植物标本中标识样本,植物学,伊巴丹大学以及植物标本,林业研究所的尼日利亚、尼日利亚伊巴丹。这些样本验证使用凭证标本在不同时期沉积。凭证标本收集的植物样本也存入FRIN植物标本,并给予F.H.I.标本数量106501。茎皮风干在室温下,粉和提取甲醇和水的混合物(1:1)24 h。结果提取进一步提取额外的24小时。提取过滤和集中在真空内在24°C。

2.2。细胞培养

主要建立了混合胶质细胞培养的脑皮质的为期一天的新生儿Sprague-Dawley老鼠如前所述[14,15]。前脑剁碎,轻轻重复移液分离的PBS和过滤70μM细胞过滤器(Falcon)。离心收集的细胞(1000 g, 10分钟),在杜尔贝科resuspended修改鹰的介质(DMEM)含10%胎牛血清(Biochrom AG),柏林,德国)和抗生素(40 U /毫升青霉素和链霉素40 lg /毫升PAA实验室,Coelbe,德国),和培养10厘米(5×10细胞培养盘子5细胞/板)在5%的股份有限公司2在37°C。漂浮的小胶质细胞被收获每周(2至7周)然后到75厘米2培养瓶给纯小胶质的文化。第二天,文化清洗去除不依从细胞,和新鲜的培养基是补充道。小胶质文化的纯度> 98%,此前由免疫荧光细胞化学的分析(14]。

BV-2鼠小胶质细胞细胞系ICLC ATL03001 (Interlab细胞系收集,螃蟹船Biologica e细胞工厂,意大利)是培养RPMI 1640 (Gibco)补充10%的边后卫(σ),2毫米谷氨酰胺(σ)。细胞分裂1:5当他们到达融合使用胰蛋白酶/ EDTA溶液在PBS。

人类神经母细胞瘤(SK-N-SH)细胞从HPA获得文化集合(英国索尔兹伯里),生长在MEM-Eagle的介质(生活技术,英国),不包含任何的抗炎物质。中补充5%胎牛血清(σ,英国),2毫米谷酰胺、丙酮酸钠1毫米,和40单位/毫升青霉素和链霉素(σ,英国)。汇合的单层膜被trypsinisation通道经常。文化是生长在37°C公司5%2直到80%汇合,媒介改变了治疗的前一天。

2.3。铂族元素2酶免疫测定(EIA)

量化的铂族元素2积累在BV-2细胞进行播种在96 -孔板(2×105/ 200μ信用证),培养2天,有或没有孵化有限合伙人(100 ng / mL)没有或BFE(25 - 200描绘洪涝频发的存在μg / mL) 24 h。铂族元素2在细胞上清液浓度评估商用设备(阿伯化验,安阿伯市,美国),其次是测量标在450海里。实验进行至少三次,一式三份。

2.4。亚硝酸盐的检测

进行了量化BV-2亚硝酸盐积累的细胞如前所述[16]。细胞被播种在96 -孔板(2×105/ 200μ信用证),培养2天,然后有或没有孵化有限合伙人(100 ng / mL)没有或BFE(25 - 200描绘洪涝频发的存在μg / mL) 24 h。作为参数的生产、亚硝酸盐浓度评估使用格里斯测定细胞上清液与商用设备(Promega,英国南安普顿),其次是测量在540 nm Tecan F50微型板块读者。在上层清液由亚硝酸盐浓度与亚硝酸钠标准曲线进行比较。实验进行至少三次,一式三份。

2.5。细胞因子ELISA

BV-2细胞被播种在96 -孔板(2×105/ 200μ信用证),培养2天,有或没有孵化有限合伙人(100 ng / mL)没有或BFE(25 - 200描绘洪涝频发的存在μg / mL) 24 h。肿瘤坏死因子α在上层清液和il - 6浓度测定商用小鼠肿瘤坏死因子α和il - 6的ELISA试剂盒(圣地亚哥BioLegend Inc .),其次是测量在一盘读者540海里。

2.6。免疫印迹

主小胶质细胞与有限合伙人不及时治疗或治疗(100 ng / mL)的存在与否BFE(25 - 200描绘洪涝频发μg / mL) 24 h。在每个实验,细胞被洗与磷酸盐(PBS)和细胞溶解在1.3 x十二烷基硫酸钠(SDS)包含样品缓冲没有1,4-dithio-dl-threitol包含100(德勤)或溴酚蓝μ米原钒酸盐。蛋白质含量测定采用bicinchoninic酸(BCA)方法(皮尔斯蛋白质生物学),根据制造商的指示。牛血清白蛋白(BSA、σ)是作为一个标准。之前电泳,溴酚蓝的混合物和德勤(最终浓度,10毫米)添加到样本。西方墨点法,40岁μ克从每个样本受到总蛋白sds - page(聚丙烯酰胺凝胶电泳)减少的条件下。蛋白质被转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国微孔,贝德福德,MA)半干的印迹。细胞膜被封锁在室温下2小时使用Rotiblock(罗斯,卡尔斯鲁厄,德国)或脱脂奶粉印迹年级拦截器(美国Biorad)和孵化隔夜主要抗体。主要的抗体是山羊anti-COX-2(圣克鲁斯;1:500)和兔anti-iNOS(细胞信号;1:1000)。主要抗体稀释在Tris-buffered盐水(TBS)含0.1% 20 (TBS-T)和1% BSA渐变。经过广泛洗(TBS-T各15分钟的三倍),cox - 2和伊诺蛋白质检测辣根peroxidase-coupled兔抗体免疫球蛋白(圣克鲁斯,1:100000稀释)使用化学发光(ECL)试剂(Amersham淀粉微球的生物技术,弗莱堡,德国)。平等的蛋白质加载和转移评估每个样本的隶属为肌动蛋白免疫印迹(兔子antiactin免疫球蛋白,稀释1:5000)。免疫印迹实验进行了至少三次。

2.7。ELISA NF -κBp65

SK-N-SH与il - 1细胞被刺激β(10单位/毫升)的存在与否BFE(25 - 200描绘洪涝频发μ1 h g / mL)。刺激期后,核提取准备使用开曼核提取工具(美国安阿伯开曼化学公司)根据制造商的指示。短暂,细胞被刮收集和清洗两次冷PBS。细胞离心5分钟在4°C,上层的丢弃,和细胞颗粒resuspended在5毫升的冰冷的PBS。细胞离心过程重复两次,小球放在冰,500年允许膨胀μL 1 x低渗的缓冲区,其次是增加10% NP-40与温和的混合。暂停离心机,上层清液含有胞质分数被储存在−细胞质NF - 80°C为后续分析κb的球在100年resuspendedμL冰冷的完整的核提取缓冲区,漩涡,轻轻摇晃,持续15分钟。样本然后离心机和上层清液(核分数)收集。细胞质和核分数测量水平的NF -κ使用人类的NF - BκBp65酶联免疫试剂盒(美国加州表达载体),根据制造商的指示。

2.8。ELISA对我κB降解

SK-N-SH细胞与il - 1不及时治疗或治疗β(10单位/毫升)的存在与否BFE(25 - 200描绘洪涝频发μg / mL) 30分钟。的刺激,细胞被洗与磷酸盐(PBS)和细胞溶解商用裂解缓冲(新英格兰生物学实验室,英国)。细胞溶解产物受到人类总我κ按照制造商的指示B ELISA(研发系统,阿宾顿,英国)。我总浓度κB细胞溶解产物被测量板阅读器450海里。

2.9。夹心ELISA对MAPK活性

BV-2小胶质细胞与有限合伙人不及时治疗或治疗(100 ng / mL)的存在与否BFE(25 - 200描绘洪涝频发μg / mL) 30分钟。的刺激,细胞用磷酸盐(PBS)和细胞溶解作为免疫印迹的描述。细胞溶解产物受到PathScan MAP激酶多夹心ELISA phospho-p38, phospho-42/44, phospho-JNK根据制造商的指示(细胞信号技术)。测量吸光度值与一盘读者在450海里。

2.10。MTT测定细胞生存能力

主要鼠小胶质细胞的异常和BV-2小胶质细胞治疗后与BFE比色测定的描绘洪涝频发3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl溴化四唑试验(MTT)。黄色的肝癌和化合物是减少线粒体脱氢酶不溶于水的蓝色化合物甲瓒,取决于细胞的可行性。主小胶质细胞和小胶质细胞产生BV2孵化有或没有有限合伙人(100 ng / mL)没有或BFE(25 - 200描绘洪涝频发的存在μg / mL) 24 h。20毫升的MTT的解决方案(σ)(5毫克/毫升)被添加到每个。板是为4 h在37°C孵化有限公司2孵化器。一百八十毫升的介质被从每个没有扰乱细胞集群。一个180μL甲醇/ DMSO溶液(50:50)被添加到每个好,和准备彻底混合在盘子里瓶细胞含有甲瓒晶体。所有的水晶都是溶解后,吸光度与微型板块阅读器阅读540海里。

2.11。统计分析

所有实验值表示为均值±SEM至少3的实验。值比较使用 以及(两组)或一维方差分析与事后学生Newman-Keuls测试(多重比较)。是水平的意义 。

3所示。结果与讨论

3.1。BFE减少描绘洪涝频发铂族元素2、亚硝酸盐和促炎细胞因子的生产从LPS-Stimulated小胶质细胞

从活化的小胶质细胞释放后,不,铂族元素2和促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子α牵扯重要介质在中枢神经系统(CNS)炎症的过程,这是与神经退行性疾病(17]。调查BFE干扰描绘洪涝频发是否这些介质,实验进行了确定其影响他们生产LPS-stimulated BV-2小胶质细胞。细胞预处理与BFE,描绘洪涝频发随后与LPS刺激(100 ng / mL) 24 h。结果表明,培养的细胞为有限合伙人仅24小时导致铂族元素的增加2在上层清液(图1)。然而,预处理BFE(25 - 200描绘洪涝频发μg / mL)之前LPS刺激导致显著( )减少铂族元素2。类似的趋势与上层的观察分析亚硝酸盐生产使用格里斯试验(图2肿瘤坏死因子)和ELISA测量α和il - 6(数据3(一个)和3 (b))。BFE用于描绘洪涝频发的最高浓度实验(200μg / mL)减少铂族元素2亚硝酸盐,肿瘤坏死因子α,il - 6生产LPS-stimulated BV-2小胶质细胞的51.6,45岁,32.2和44.7%,分别证明BFE强烈抑制这些因素在描绘洪涝频发LPS-induced神经炎症。虽然b . ferruginea被广泛报道表现出抗炎作用么在活的有机体内(5- - - - - -7),所涉及的确切机制(s)是未知的。我们目前的结果表明,铂族元素的抑制2、一氧化氮和促炎细胞因子在早期的观察中扮演重要的角色在活的有机体内的行为b . ferruginea。细胞生存能力进行分析同时表明BFE并不影响描绘洪涝频发的可行性BV-2小胶质细胞在铂族元素的浓度产生减少2、亚硝酸盐和细胞因子产生的细胞(数据未显示)。


图1
减少铂族元素2生产LPS-stimulated小胶质细胞。细胞被刺激的有限合伙人(100 ng / mL) BFE(25 - 200描绘洪涝频发的存在与否μg / mL) 24 h。潜伏期结束时,上层的铂族元素的收集2测量。所有值表示为均值±SEM 3独立实验。数据分析使用单向方差分析与事后多重比较学生Newman-Keuls测试。 相比,有限合伙人控制。

图2
减少亚硝酸盐生产LPS-stimulated小胶质细胞。细胞被刺激的有限合伙人(100 ng / mL) BFE(25 - 200描绘洪涝频发的存在与否μg / mL) 24 h。潜伏期结束时,上层清液收集格里斯测定亚硝酸盐测量。所有值表示为均值±SEM 3独立实验。数据分析使用单向方差分析与事后多重比较学生Newman-Keuls测试。 相比,有限合伙人控制。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图3
减少肿瘤坏死因子α((a)和(b))和il - 6 ((a)和(c))生产LPS-stimulated BV-2小胶质细胞。细胞被刺激的有限合伙人(100 ng / mL) BFE(25 - 200描绘洪涝频发的存在与否μg / mL) 24 h。潜伏期结束时,上层清液收集TNFα根据制造商的指示和il - 6测量。所有值表示为均值±SEM 3独立实验。数据分析使用单向方差分析与事后多重比较学生Newman-Keuls测试。 相比,有限合伙人控制。
3.2。BFE效应介导通过抑制cox - 2和描绘洪涝频发伊诺蛋白表达

根据我们的观察,BFE产生显著描绘洪涝频发对铂族元素的影响2不,我们提出,这可能是针对NF -κB,因此干扰NF的转录κcox - 2和伊诺B-regulated基因(18]。免疫印迹实验进行了调查BFE cox - 2和伊诺描绘洪涝频发蛋白质的影响。老鼠主要小神经胶质细胞与LPS刺激为24小时(100 ng / mL);其次是cox - 2蛋白显著增加。结果表明,BFE产生剂量依赖性和描绘洪涝频发显著( )降低cox - 2蛋白有限合伙人(图引起的免疫反应性4)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图4
(一)BFE抑制cox - 2蛋白表达描绘洪涝频发LPS-stimulated主要小胶质细胞。细胞被刺激的有限合伙人(100 ng / mL) BFE(25 - 200描绘洪涝频发的存在与否μg / mL) 24 h。年底的潜伏期,cox - 2蛋白水平测定使用每个蛋白质免疫印迹使用特定的抗体。(b)定量光密度分析cox - 2蛋白表达的规范化与肌动蛋白加载控制。所有值表示为均值±SEM 3独立实验。数据分析使用单向方差分析与事后多重比较学生Newman-Keuls测试。 相比,有限合伙人控制。

实验还表明,BFE产生剂量依赖性和描绘洪涝频发显著抑制伊诺LPS-stimulated初级小胶质细胞(图中蛋白表达5)。这些结果是一致的,确认减少铂族元素2也没有生产BFE通过抑制cox - 2介导的描绘洪涝频发和伊诺蛋白质表达,分别。

(一)
(一)
(b)
(b)
图5
(一)BFE抑制描绘洪涝频发伊诺LPS-stimulated初级小胶质细胞蛋白表达。细胞被刺激的有限合伙人(100 ng / mL) BFE(25 - 200描绘洪涝频发的存在与否μg / mL) 24 h。潜伏期结束时,进气阀打开蛋白质含量测定采用免疫印迹使用特定抗体为每个蛋白质。(b)定量光密度分析伊诺蛋白质表达的规范化与肌动蛋白加载控制。所有值表示为均值±SEM 3独立实验。数据分析使用单向方差分析与事后多重比较学生Newman-Keuls测试。 相比,有限合伙人控制。
3.3。核易位NF - BFE干扰描绘洪涝频发κBp65

在逃避我κB, NF -κB移核引发多种促炎基因的表达,包括cox - 2和进气阀打开。进一步调查是否BFE干扰描绘洪涝频发核易位NF -κB,我们采用ELISA测定细胞质和核NF - p65亚基的水平κB在SK-N-SH细胞,存在和缺乏提取。il - 1β治疗引起的胞质明显减少,并增加核p65水平相比,如果细胞(图6)。然而,预处理BFE(25 - 200描绘洪涝频发μg / mL)导致了统计学意义( )增加胞质和减少核NF -κBp65,从而有效地抑制核易位的单元从细胞质到细胞核。在这个实验中,parthenolide (20μ米)化合物被用作参考。Parthenolide是众所周知的NF -κB抑制剂徒通过瞄准我κB激酶复杂(19,20.),可以抑制炎症介质如il - 6、TNFα,il - 1β,il - 1221),铂族元素2(22,23),没有/伊诺[24在不同的细胞。Parthenolide表现出最强的抑制NF -κB激活对il - 1β全身的NF -κ这个实验B激活和核易位。


图6
BFE抑制il - 1描绘洪涝频发β全身核易位NF -κ与il - 1 b SK-N-SH细胞被刺激β的存在与否BFE(25 - 200描绘洪涝频发μg / mL) 1小时。细胞溶解产物(核和胞质提取物)进行总NF -κ使用人类的NF - BκBp65酶联免疫试剂盒。所有值表示为均值±SEM 3独立实验。光密度测量在450 nm标。数据分析使用单向方差分析与事后多重比较学生Newman-Keuls测试。 与il - 1相比β控制。
3.4。BFE干扰NF描绘洪涝频发κ我通过抑制κB降解

进一步了解BFE,描绘洪涝频发的分子作用机制,探讨我的角色κB在其行动,我们评估对我的行动κB降解SK-N-SH神经母细胞瘤细胞。il - 1β导致我完全退化κBα在这些细胞。BFE(50 - 200描绘洪涝频发μg / mL)显著( )阻断il - 1β我全身的退化κBα(图7),表明随后抑制NF -κB激活是由于BFE我描绘洪涝频发的影响κBα由BFE。描绘洪涝频发Parthenolide (20μ米)几乎完全逆转LPS-induced退化的我κB在SK-N-SH细胞。


图7
BFE我描绘洪涝频发的影响κ在il - 1 B的降解β刺激SK-N-SH细胞。与il - 1细胞被刺激β的存在与否BFE(25 - 200描绘洪涝频发μg / mL) 30分钟。细胞溶解产物被评价我κB降解通过测量总我的数量κB细胞溶解产物。数据分析使用单向方差分析与事后多重比较学生Newman-Keuls测试。 与il - 1相比β控制。
3.5。BFE抑制描绘洪涝频发LPS-Induced p38的磷酸化,但不是p42/44和物

p38 MAP激酶(MAPK)参与控制细胞的信号级联反应促炎细胞因子和各种细胞的压力。p38 MAPK信号也被广泛接受作为一个级联(导致神经炎症12]。ERK和p38 MAPK级联已报告为伊诺和TNF的监管α基因表达在LPS-activated胶质细胞(25]。因此,我们调查是否BFE可能描绘洪涝频发的抗炎作用与抑制MAPK BV-2细胞磷酸化与LPS激活。结果表明,有限合伙人治疗引起p38的磷酸化,p42/44,物MAP激酶(图8在BV-2细胞)。预处理与BFE没有产生显著影响描绘洪涝频发的磷酸化p42/44或物由于LPS刺激。然而,在50 - 200μg / mL, BFE产生描绘洪涝频发统计学意义( )和剂量相关p38磷酸化的抑制LPS。p38 MAPK信号通路已被广泛报道,激活NF -κB和随后的诱导促炎基因(26- - - - - -28]。我们假定BFE可能施加的抑制作用描绘洪涝频发NF -κB通过p38-dependent行动。


图8
BFE抑制p38描绘洪涝频发,但不是p42/44或物MAPK在LPS-stimulated BV-2小胶质细胞。从LPS-stimulated小胶质细胞溶解产物进行分析使用ELISA phospho-p38, phospho-42/44, phospho-JNK。数据分析使用单向方差分析与事后多重比较学生Newman-Keuls测试。 相比,有限合伙人控制。

4所示。结论

在这第一次尝试阐明抗炎的分子目标的行为b . ferruginea,我们已经建立了这种植物的提取物抑制炎性细胞因子的生产,铂族元素2后,也没有炎症刺激。这些行动可能是提取的相关行动p38-mediated NF - 促炎基因转录或我 B-mediated核易位激活和NF - b .这些结果进一步验证了使用b . ferruginea TAM治疗炎症条件。BFE表明,这种植物描绘洪涝频发的观察能够具有抗神经炎性反应的动作可能是一个潜在的治疗神经炎症的新物质来源/神经退行性条件,如阿尔茨海默氏症。实验正在进行中隔离这种植物的活性成分。

确认

作者感谢Ulrike Gotzinger-Berger培养大鼠初级小胶质细胞和林Gunter技术援助。这项研究的部分资金由亚历山大•冯•洪堡基金会的研究奖学金和哈德斯菲尔德大学的国际联网基金授予o . a . Olajide博士。