文摘
KM110329四个传统草药混合物与抗炎作用。特应性皮炎(AD)是一种炎症性皮肤病与增强T-helper2 (Th2)淋巴细胞对过敏原,导致血清嗜酸性粒细胞升高和免疫球蛋白E (IgE)水平和白细胞浸润在过敏性皮肤的网站。在这项研究中,我们调查的影响,局部应用KM110329乙醇提取物对卵白蛋白(OVA)或2,4-dinitrochlorobenzene——(DNCB)诱导小鼠模型。为此,我们观察到血液嗜酸性粒细胞KM110329的影响,皮肤肥大细胞、血清IgE的生产,和细胞因子mRNA的表达过敏性皮炎皮肤损伤的卵子过敏原或DNCB-treated BALB / c小鼠。KM110329显著降低血液嗜酸性粒细胞细胞数量在卵子或DNCB-treated BALB / c小鼠。组织学分析显示肥大细胞计数下降以及真皮炎症细胞的浸润。在皮肤损伤,mRNA的表达interleukine (IL) 4, IL-13, IL-17被KM110329抑制。KM110329也抑制血清的生产IgE水平在两个卵子,DNCB-induced过敏性皮肤炎模型。综上所述,我们的研究结果表明,局部症状KM110329提取施加有益的影响在广告中的应用,表明KM110329可能是一个有用的候选人AD的治疗。
1。介绍
特应性皮炎(AD)是一种慢性炎症性皮肤病影响世界上大约有1000万人,其发病率不断增加在西化的国家(1,2]。广告与特异性免疫和炎症机制。广告的一般特征包括过度浸润的炎症细胞如淋巴细胞,巨噬细胞,颗粒肥大细胞在皮肤损伤,外周血嗜伊红血球过多,高水平的血清免疫球蛋白E (IgE)。
IgE水平与严重程度相关的广告和提供的异常的皮肤屏障,广告的一个关键特性。IgE的功能在过敏炎症表明IgE和IgE肥大细胞和嗜酸性粒细胞激活导致广告。IgE可以使敏感皮肤肥大细胞炎症介质的产生,如细胞因子(il - 4, IL-5 IL-13,肿瘤坏死因子-α(TNF -),当cell-bound IgE由过敏原交联。由肥大细胞释放的细胞因子il - 4和IL-13促进Th2反应。肿瘤坏死因子-α由巨噬细胞也扮演着重要的角色在急性期的广告。Th1细胞因子(- 2和移行细胞(IFN -)发挥重要作用在细胞免疫和慢性炎症。尽管Th2细胞在急性期IFN -占主导地位γ由Th1细胞是高度表达和导致发病的慢性阶段。IL-17生产CD3 + T辅助细胞在宿主防御至关重要的功能,并提供Th17细胞反应导致多种自身免疫和炎性疾病(3]。IL-17关键角色的特应性皮炎最近报道(4]。
KM110329是四个东方草药的混合物(Houttuynia cordata研究,地黄Steud (Libosch),李属yedoensisMatsum,悬钩子属植物coreanus进行筛选。)。地黄一直被用作原料粉末在东亚止血药物的影响,活化血液循环,改善肾脏功能(5]。一些研究表明,地黄Libosch antiallergy影响(6和抗炎作用7- - - - - -9]。Houttuynia cordata一直在东方传统医学用于治疗炎症疾病。另外,一些研究表明,Houttuynia cordata被关联到一个广泛的药理作用,包括抗炎(10,11],抗病毒[12],和抗癌作用[13]。悬钩子属植物coreanus是一种红莓,主要生长在韩国、日本和中国。水果,被称为“Bokbunja“在韩国,一直在东方传统医学用于减少疾病,如哮喘和过敏的风险。它也知道悬钩子属植物coreanus有抗炎和抗氧化活动(14- - - - - -16]。这些集体观测表明KM110329可能适合控制广告和有益人类变应性疾病的治疗。
因此,在这项研究中,我们调查了30%乙醇提取的KM110329是否有用的活动广告使用的治疗雄性BALB / c小鼠暴露于2,4-dinitrochlorobenzene或雌性BALB / c小鼠暴露于卵白蛋白。在我们的研究中,我们测量血液中嗜酸性粒细胞水平,组织病理学变化包括肥大细胞数、细胞因子表达在皮肤组织,和等离子IgE水平在两个模型。
2。材料和方法
2.1。制备KM110329
药物是由Hanpoong制药(Jeon-ju、韩国)按照良好生产规范(GMP)过程。地面粉(Houttuynia cordata:悬钩子属植物coreanus:地黄:李属yedoensis= 25 g: 25 g: 25 g: 25克)100克的质量在30% (V / V)乙醇提取使用超声发生器(美国布兰森)在室温下30分钟。酒精提取蒸发然后冻干72 h(冻干机日本)。提取的粉末溶解在蒸馏水。
2.2。动物
岁的雌性BALB / c小鼠(6周)被用于卵子induced-AD模型和雄性BALB / c小鼠(年龄在6周)被用于DNCB induced-AD模型。老鼠从东方购买(Sung-nam、韩国)和随机分成三组(正常、卵子KM110329或正常,DNCB KM110329),每个组成的四只老鼠。所有的老鼠都保持无菌环境下,允许自由进入饮食和水。所有程序上执行批准的老鼠庆熙大学动物保健中心(批准号KHUASP (SE) 2012 - 004)。
2.3。敏化作用和治疗
图中所描述的实验过程示意图1。建立OVA-induced广告模型,女7周大BALB / c小鼠腹腔内致敏与20μ克卵子一周一次三个星期。三周后,小鼠的后面用电动剃须刀刮和真皮挑战11厘米的补丁包含卵巢(100μg) 2周。KM110329应用于皮肤在第二和第三周皮肤敏化与卵子。补丁被换了三次每周在敏化(图1(一))。DNCB-induced形成的广告模式,男7周大BALB / c小鼠被分为三组,每个组成的四只老鼠。剃须后,小鼠皮肤真皮上涂上200年μL 1%的DNCB使用11厘米的补丁。两周后敏感,皮肤与200年受到挑战μL 0.2%的DNCB每周两次的解决方案。这个过程被重复4周。KM110329应用于第3周一起在敏感的皮肤DNBC(图1 (b))。老鼠被有限公司2吸入,样本收集。
(一)
(b)
2.4。血液分析
最后的皮肤药物致敏后,全血样品收集的心脏穿刺。真空采血管的血液被TM管包含EDTA (BD科学,新泽西,美国)。实际上血液处理来确定血液参数(淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞)在950年HEMAVET血液学分析仪(科学,Inc .,牛津,CT)按照制造商的建议。
2.5。组织学分析
皮肤活检的一部分固定在4%多聚甲醛(PFA)和嵌入Tissue-Tek光学切削温度(O.C.T)化合物(Tissue-Tek、樱花、AA Zoeterwoude,荷兰)干冰。皮肤的部分10μ米被削减和苏木精和伊红染色(H & E)对炎症细胞或与甲苯胺蓝肥大细胞计数和光学显微镜下检查(奥林巴斯)。肥大细胞被数10个地区的大功率领域(高通滤波器)在400 x放大。
2.6。免疫组织化学
表达CD3 +淋巴细胞被immnohistochemical分析使用特定抗体检测。冻结部分的皮肤样本切成10μ部分和固定4%冷(PFA)。部分都在3%过氧化氢浸泡20分钟,消除内源性过氧化物酶活性,然后用5%牛血清白蛋白在PBS堵塞1 h。部分与鼠单克隆抗体CD3 +孵化一夜之间在4°C,随后孵化二级生物素化的anti-rabbit免疫球蛋白在室温下1 h。部分是处理avidin-biotin合复杂(Vectastatin ABC工具包,向量实验室、钙、美国)30分钟在4°C和沾Diaminobenzidine四氯化(DAB)作为衬底。幻灯片是安装一个水安装解决方案(DAKO、斯特鲁普、丹麦)和cover-slipped。所有的部分进行了分析使用一个奥林巴斯显微镜使用数码摄像机和图像捕获。
2.7。细胞因子通过实时PCR分析
小鼠皮肤立即在液态氮冷冻,保存在−70°C到使用。试验,皮肤是均质Ultra-Turrax T10 (IKA labortechnik,首尔,韩国)和RNA提取进行了使用试剂盒(美国纽约生活表达载体技术)。RNA含量测定用NanoDrop nd - 1000分光光度计(NanoDrop技术公司)。1μg细胞总RNA从每个样本反向转录使用互补脱氧核糖核酸合成装备(豆类、日本)。定量PCR进行使用SYBR绿色iMaster LightCycler 480(瑞士罗氏公司)。引物命il - 4, IL-13、IL-17 GAPDH如表所示1。
2.8。等离子体IgE测量
总IgE水平等离子夹心ELISA测定使用BD PharMingen鼠标IgE ELISA。简单地说,盘子被涂上一层捕获抗体ELISA涂层缓冲区(sigma-aldrich)和孵化一夜之间在4°C。盘子洗了PBS-Tween 20(0.05%)和随后封锁(10%的边后卫在PBS) 1 h 20°C。连续稀释的标准抗原或样品稀释缓冲(10%的边后卫在PBS)被添加到碟子和盘子被孵化2 h在20°C。洗后,biotin-conjugated anti-mouse IgE和SAv-HRP (streptavidin-horseradish过氧化物酶共轭)被添加到碟子和盘子被孵化1 h在20°C。最后,tetramethylbenzidine(三甲)衬底的解决方案是添加到盘子中,15分钟后在黑暗中孵化,2 n H2所以4的解决方案是添加到停止反应。光密度测量在450 nm自动化ELISA读者(Versa马克斯、分子器件、钙、美国)。
2.9。统计分析
所有的实验都表示为手段±标准差(SD)的至少三个独立的测试。学生的t以及用于单变量比较,P值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。KM110329降低血液中的炎症细胞
第一次尝试,我们测量体重的BALB / c小鼠卵子或KM110329来验证药物的毒性。见图2,我们发现KM110329没有任何毒性保持体重。众所周知,嗜酸性粒细胞,单核细胞、中性粒细胞和淋巴细胞激活在特应性皮炎患者的血(17,18]。尤其是嗜酸性粒细胞已被证明存在于大多数广告和相关疾病患者活动(19]。调查是否皮肤KM110329敏化可以减少炎症细胞,我们测量白细胞水平在950年心血管血液样本使用HEMAVET血液学分析仪。有趣的是,表2表明KM110329嗜酸性粒细胞的数量明显减少,单核细胞,neutorphils,淋巴细胞,细胞含有异染颗粒可能代表肥大细胞。
(一)
(b)
3.2。局部KM110329政府减少炎症细胞渗透到皮肤损伤
确定KM110329减少炎症细胞渗透到广告皮肤损伤,我们执行H & E染色后在皮肤局部管理药物。我们观察到炎症细胞渗透到表皮和真皮对照组(卵子,DNCB)。然而,KM110329减少这样的炎症细胞渗透到皮肤(图3)。接下来,我们也表现为肥大细胞甲苯胺蓝染色观察。反复皮肤应用卵子和DNCB真皮肥大细胞数量增加。然而,这个特性显著抑制KM110329而控制老鼠(图4)。此外,卵子和DNCB增加数量的CD3 + T细胞(总),而KM110329减少他们在表皮层(图5)。
3.3。KM110329管理会使mRNA表达的细胞因子
Th2型细胞因子在急性阶段很重要的广告而混合Th1 / Th2型炎症是一种慢性阶段特征的广告。最近,沿袭效应CD3 + T细胞,产生IL-17 IL-17-producing T辅助()细胞,已被确认。IL-17 mRNA和蛋白水平升高的患者的哮喘和广告。见图6,我们发现KM110329显著降低相对mRNA的表达il - 4, IL-13,干扰素-,IL-17诱导卵子和DNCB。
(一)
(b)
(c)
3.4。KM110329管理会使血清免疫球蛋白e浓度
Hyperproduction IgE是广告的一个重要特点和AD患者经常表现出较高水平的总和过敏原特定IgE抗体的血清(Abs)。总IgE水平显著升高OVA-treated组与正常组。然而,增加血清IgE水平引起的卵巢被KM110329治疗显著降低(图7(一))。同时,增加血清引起的IgE水平DNCB略下降了KM110329治疗(图7 (b))。
(一)
(b)
4所示。讨论
在这项研究中,我们调查了KM110329对卵巢的影响——或者DNCB-induced广告在BALB / c小鼠模型。KM110329显著抑制白细胞水平的血液样本。血液分析表明,局部管理KM110329明显减少白细胞的过度表达,如中性粒细胞,单核细胞,淋巴细胞和嗜酸性粒细胞诱导卵子或DNCB。组织学分析表明白细胞的浸润皮肤损伤是KM110329治疗后下降。局部管理KM110329阻止广告的加重皮肤损伤。这些KM110329对AD病变的影响表明,KM110329可能是一个潜在的替代治疗AD的治疗。
增加血液中嗜酸性粒细胞是广告的具体方面。入口处的皮肤与碳碳的嗜酸性粒细胞趋化因子,eotaxin,单核细胞趋化现象的4中增加广告(20.]。嗜酸性粒细胞的活化诱导gm - csf, IL-5 eotaxin和激活嗜酸性粒细胞释放多种化学物质引起炎症和组织损伤(21- - - - - -23]。在我们的血液分析,嗜酸性粒细胞计数的统计显著降低KM110329-treated组导致减少释放这种化学物质可能引发皮肤病。这就解释了为什么eosionphils的药理学药物治疗减少了数量低于生理药物水平。
肥大细胞调节炎症反应如过敏和过敏反应的过敏原交联表面IgE-dependent肥大细胞刺激的脱粒和释放组胺,激活白细胞三烯,蛋白酶,前列腺素和细胞因子。KM110329已知发挥多种生物学效应,如抗炎活性和抑制Th2免疫反应的活性。李et al .,报告说Houttuynia cordata和地黄复合48/80-induced提取物抑制肥大细胞释放组胺在体外(8,24]。它也报告说Houttuynia cordata抑制Th2介导炎症的差别通过对这些生产Th2-cytokines Jurkat T细胞和人类肥大细胞(25]。
皮肤损伤的定量rt - pcr还显示,局部KM110329政府明显减弱的mRNA水平Th2细胞因子il - 4和IL-13等广告的皮肤损伤。生产等促炎细胞因子il - 4的表皮细胞已被确认为的一个主要因素,协调广告的起始26]。广告的特点是主要th2型细胞因子的表达和增加细胞渗透皮肤损伤,提高循环的IgE水平和嗜酸性粒细胞(27]。最近的研究报道,IL-17真皮细胞渗透有过敏性湿疹更明显的急性损伤的慢性病变(4]。在我们的研究中,KM110329下调IL-17 mRNA的表达诱导卵子。免疫组织化学研究表明,KM110329减少数量的增加引起的CD3 +卵子和DNCB。
最近的数据表明,肥大细胞可以促进eosinophil-mediated炎症反应。肥大细胞或T-cells-derived细胞因子如IL-5和gm - csf中扮演重要角色嗜酸性粒细胞成熟和趋化性28- - - - - -30.]。IL-5,肿瘤坏死因子-,2也调节趋化作用、激活和嗜酸性粒细胞的函数。我们发现KM110329降低肥大细胞(图4)和肿瘤坏死因子等炎性细胞因子-、il - 6和引发ELISA和rt - pcr(数据没有显示)。似乎减少肥大细胞的渗透与减少脱颗粒的肥大细胞和嗜酸性粒细胞的成熟抑制各种炎性细胞因子的释放。
我们目前的研究清楚地表明,KM110329抑制广告诱导卵子或DNBC的进展。这表明KM110329可能是一个有用的候选人AD的治疗。
作者的贡献
s . r . Kim和H.-S。崔同样导致了这项工作。
确认
这项工作的支持下进行了“农业科技发展合作研究项目(项目没有。PJ008328)“农村发展管理,韩国,韩国科学与工程基金会(KOSEF)授予由韩国政府资助(最高明的)(没有。2009 - 0063466),和健康与福利事务部的格兰特,大韩民国(B110017)。