文摘
本研究的目的是描述植物提取物的抗炎作用方式玫瑰果(狗牙蔷薇),柳树皮(柳属阿尔巴)和荨麻叶(荨麻属dioica)在一个在体外模型主要犬关节软骨细胞。方法。植物提取物的生物效应在软骨细胞il - 1处理进行了研究β72 h。胶原蛋白II型,cartilage-specific蛋白聚糖(CSPG),β1-integrin SOX-9, cox - 2和MMP-9 MMP-13被免疫印迹检测。结果。植物提取物抑制il - 1β全身的NF -κ我激活的抑制κBα磷酸化,我κBα退化、p65磷酸化和p65核易位。这些事件的差别与对这些NF -κB目标包括cox - 2和基质金属蛋白酶。提取也逆转了il - 1β胶原蛋白II型差别全身对这些CSPG,β1-integrin, cartilage-specific转录因子SOX-9蛋白表达。在高密度培养植物提取物刺激新软骨的形成甚至在il - 1的存在β。结论。植物提取物发挥抗炎和合成代谢对软骨细胞的影响。观察到的减少il - 1β全身的NF -κB激活表明,进一步的研究是必要的证明的有效性植物提取物治疗OA和NF -的其他条件κB在病理生理作用。
1。介绍
骨关节炎(OA)是一种关节疾病,不仅涉及到关节软骨还滑膜、软骨下骨和软组织periarticular [1]。OA可能发生创伤性损伤后关节,随后的感染的联合或者只是由于老化。的症状和体征特点OA关节影响的最常热,肿胀、疼痛、僵硬和有限的流动性。其他的后遗症包括骨赘形成和关节排列不齐。这些表现是高度可变的,这取决于关节位置和疾病严重程度(2]。OA严重异常的特征是细胞外基质的合成,逐渐hypocellularity,最终分裂和软骨退化,新骨形成periarticular地区(骨赘病),降低,然后增加,软骨下骨质密度和可变滑膜炎症(3]。在办公自动化,机械应力发起软骨病变通过改变chondrocyte-matrix交互和软骨细胞的代谢反应4]。
软骨细胞和基质蛋白之间的相互作用是主要介导的β1-integrin受体(5]。这种交互中起着至关重要的作用在调节一些生物现象,包括细胞形态、基因表达、细胞生存。β1-integrins是跨膜信号转导受体介导cell-matrix交互在软骨6]。一个重要的信号转导通路激活β1-integrin受体MAPKinase通路(7,8]。此外,抑制细胞矩阵通信中断的MAPKinase通路已被证明导致caspase-3激活,保利(ADP)核糖聚合酶的乳沟,软骨细胞凋亡(8]。
有初始数量的增加水和蛋白聚糖与观察到的瞬态早期OA的软骨细胞增殖。增生的软骨细胞出现在集群,并伴随着细胞形态和表型的改变,表明一个肥厚性分化的过程。在分子水平上,OA软骨基质成分的损失,尤其是II型胶原蛋白和aggrecan由于细胞外基质之间的失衡破坏和修复(9]。尽管OA软骨细胞合成代谢和分解代谢的矩阵基因的表达增加(10),分解代谢的能力被认为是主导其合成代谢能力导致软骨损失。随着办公自动化的发展从轻微到严重,减少胶原蛋白的转录,未能维持蛋白聚糖矩阵,减少软骨细胞调节细胞凋亡的能力(11]。相反,胶原蛋白类型X,它通常是由终末分化肥厚性软骨细胞,周围已经证明了在OA软骨(软骨细胞集群12]。软骨细胞增殖(克隆)被认为是一个试图修复和抵消软骨退化。然而,疾病进展和继发性炎症表明,这通常是不成功的。短暂的增生(软骨细胞克隆)后跟hypocellularity和细胞凋亡13]。分解代谢的事件负责软骨基质降解包括(i) il - 1等分解代谢的细胞因子的释放β、il - 6和TNF -α(14];(2)基质降解酶的生产如基质金属蛋白酶(MMPs),主要stromelysin-1 (MMP-3)和collagenase-3 (MMP-13);(3)活性氧(ROS)生产在OA软骨细胞(4,14]。基质金属蛋白酶失衡和组织基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)发生,导致活性基质金属蛋白酶和顺向软骨基质降解。然而,il - 1β也可能导致软骨矩阵的损耗减少特定软骨蛋白聚糖的合成和胶原蛋白II型(4,15]。
il - 1的促炎效应β和肿瘤坏死因子-α在OA受核转录因子的转录因子”κ(NF - B”κB) (16]。NF -的子单元κB (p65和p50)位于细胞质中作为一个不活跃的复杂与抑制我协会κBα亚基。在磷酸化反应,我κBα复杂和NF -分离κB把细胞核和NF -与靶基因结合κB (17]。NF -κB的差别可能同时负责对这些转录因子SOX-9,参与调控的基因cartilage-specific细胞外基质(ECM)的蛋白质(18]。
非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药)是目前应用最广泛的抗炎药。然而,他们表现出许多不受欢迎的副作用,只是暂时有效。因此,天然植物提取物能够抑制NF -κB介导异化的活动可能是有前途的治疗药物治疗OA (19]。植物提取物抗炎活动也可以帮助减少消费的频率和剂量的关节炎患者的非甾体抗炎药。近年来已经有扩散研究植物提取物具有潜在的抗炎的特性(20.]。最重要的因素驱动的兴趣植物提取物是意识到炎症中起着重要的作用在人类和许多慢性疾病的发展同伴动物。草药的使用是提高人类关节炎患者在美国和西欧(21]。根据关节炎基金会,几乎45%的病人在北美按摩药膏或申请OA。各种外用和口服制剂目前可用。其中很多是传统的中国、印度、或韩国草药,用于医疗设备土著从业者。研究植物调查到目前为止包括玫瑰果(狗牙蔷薇)[22),雷公藤钩F提取(23],Triptolide [24),魔鬼的爪(Harpagophytum procumbens)[25)、姜(生姜Rosc。)[26),而Withania somnifera (ashwagandha)(27]。此外,传统的(28和几个系统评价29日)检查证据发表植物抗炎药物的有效性。其中一些特别关注治疗OA和慢性下腰痛(30.,31日]。
本研究旨在描述三个植物提取物的效果和作用机理;玫瑰果(狗牙蔷薇),柳树皮(柳属阿尔巴)和荨麻叶(荨麻属dioica)主要犬关节软骨细胞。先前的研究已经报道的抗炎活性荨麻属dioica(17,30.,31日]。在这项研究中,我们表明,这些植物提取物表现出强烈抑制NF -的能力κB和软骨细胞的调控基因产物在体外。
2。材料和方法
2.1。抗体
胶原蛋白II型(AB746)抗体,β1-integrin (MAB1977), cartilage-specific蛋白多糖抗体(MAB2015)购买的微孔(Schwalbach,德国)。二次抗体买来Dianova(德国汉堡)。抗体β肌动蛋白(A5316)从σ(德国慕尼黑)。抗体针对MMP-9 (MAB911)和MMP-13购买从研发系统(英国阿宾顿)。Cyclo-oxygenase-2 (cox - 2)(160 - 112)抗体从开曼群岛获得化学(美国安阿伯市MI)。单克隆抗体和多克隆抗体anti-Shc anti-ERK是从正欲购买(德国海德堡)。抗体p65 (img - 512), phospho-IκBα(img - 156 a)和pan-IκBα(img - 127),从Biocarta(德国汉堡)。NF -抗体κB p65 (Rel)和phospho-specific pS529(100-401-266)从大实验室(Biomol,汉堡,德国)。SOX-9抗体购自阿克利抗体GmbH (Hiddenhausen,德国)。肽醛和特定的蛋白酶体抑制剂N-Ac-Leu-Leu-norleucinal (ALLN)获得勃林格曼海姆(德国曼海姆)。MTT测定购买从σ(德国慕尼黑)。
2.2。培养基和化学品
培养基(火腿F-12 /杜尔贝科修改鹰的介质(50/50)含10%胎牛血清(FCS), 25岁μ50 g / mL抗坏血酸,国际单位/毫升链霉素,50个国际单位/毫升青霉素,2.5μg / mL两性霉素B、必需氨基酸、谷酰胺)是获得Seromed(德国慕尼黑)。胰蛋白酶/EDTA (EC 3.4.21.4)购买的σ(德国慕尼黑)。Epon是来自普莱诺(马尔堡,德国)。il - 1β从Strathman生物技术获得GmbH(汉诺威,德国)。
2.3。制备的植物提取物
玫瑰果的植物提取物(狗牙蔷薇),白柳树皮(柳属阿尔巴)和荨麻叶(荨麻属dioica)提供从Shamanshop粉末,卡姆登,纽约,美国;目录编号(202055 - 51 _c 202295 - 51 - _c和201865 - 51 - _c resp。)。植物提取物是准备使用氯仿,在实验室里常用的溶剂,因为它是相对稳定的,可溶于大多数有机液体,和方便地波动。此外,植物通常与氯仿提取药物处理。氯仿溶剂提取物是由Puleva生物技术,格拉纳达,西班牙。每个植物提取物(~ 10 g)是用滤纸,加载到主燃烧室的索氏提取单元。氯仿(200毫升)加热回流和孵化2 h。chloroform-evaporation后在真空下旋转蒸发器(放置在一个水浴60°C)可溶性植物提取是溶解在二甲亚砜(DMSO)股票10毫克/毫升的浓度和存储在整除−80°C。最后的DMSO溶液的浓度不,在任何情况下,超过0.1%。进一步稀释在细胞培养基实现最终的工作浓度。
2.4。软骨细胞隔离和文化
主要犬关节软骨细胞分离得到client-owned狗的关节矫形手术诊所的兽医手术,Ludwig-Maximilian-University慕尼黑,德国。充分了解业主同意了和沃尔瑟姆的伦理委员会,Ludwig-Maximilian-University,诺丁汉大学的批准该项目。软骨移植组织切片和消化主要以1%为2 h链霉蛋白酶37°C和随后0.2%胶原酶4 h在37°C。孤立的软骨细胞密度保持在培养基细胞/毫升培养皿在单层培养和玻璃板一段24小时在37°C公司为5%2。
2.5。实验设计
Serum-starved软骨细胞(通道2、培养3% FCS)与植物提取物治疗(10μg / mL)仅为24小时(预处理)然后cotreated植物提取物(10的组合μg / mL)和il - 1β(10 ng / mL)进一步在单层培养48 h。软骨细胞仅处理植物提取物在整个期间担任治疗和那些接受il - 1β被用作“炎症”控制。此外,未经处理的软骨细胞(即。,cells only exposed to serum-starved medium) served as untreated controls. For investigation of NF-κB易位和我κBα磷酸化,软骨细胞治疗与il - 1β(10 ng / mL)或cotreated植物提取物(10的组合μg / mL)和il - 1β(10 ng / mL)为0,15、30、60分钟和核/胞质提取准备。
2.6。MTT试验
软骨细胞被播种在96 -孔板与5000细胞/和隔夜培养基中含10% FCS孵化。积极控制细胞不及时治疗或治疗的化合物。消极的控制细胞il - 1处理β一个人。此外,软骨细胞只孵化具有相同数量的DMSO在饥饿血清培养基工作方案(没有植物提取)。对每一个控制和实验治疗,三个井。0后测量,24、48和72 h,媒介(有或没有植物提取物)serum-starved中型和MTT(10所取代μL)补充道。孵化后4 h在37°C MTT细胞溶解的解决方案是添加和孵化在37°C到麻省理工甲瓒晶体完全溶解。吸光度测量用分光光度计波长550纳米。
2.7。免疫荧光显微镜
细胞培养在玻璃板和孵化24 h。细胞被洗了三次,preincubated 1 h和serum-starved介质在刺激10 ng / mL il - 1β或10μg / mL植物提取单独或cotreated 10μg / mL植物提取物和10 ng / mL il - 1β30分钟的serum-starved (3% FCS)媒介。细胞在玻璃盘子洗了三次在汉克斯解决方案之前甲醇固定在环境温度为10分钟(在),并与磷酸盐(PBS)冲洗。细胞和软骨细胞的核膜permeabilized治疗0.1% Triton x - 100对冰1分钟。细胞被洗与牛血清白蛋白(BSA) 10分钟,冲洗与PBS和孵化主要抗体(PBS p65 phospho-p65 1: 30)。他们轻轻地洗几次与PBS孵化前二次抗体(goat-anti-rabbit免疫球蛋白和FITC共轭,稀释1:50在PBS)。玻璃板块与PBS终于洗了三次,覆盖着fluoromount mountant,和光学显微镜下检查(Axiophot 100、蔡司、德国)。
2.8。隔离的核和胞质软骨细胞提取物
软骨细胞是使胰蛋白酶化和洗两次冰冷的PBS(1毫升)。上层清液被除去,细胞颗粒在低渗的resuspended裂解缓冲(400μ含有蛋白酶抑制剂L)。孵化后冰15分钟,10% NP-40 (12.5μL)和细胞悬液是大力混合添加了15秒。提取是离心机为1.5分钟。上层清液(胞质提取物)被冻结在−70°C。冰冷的核提取缓冲(25μL)添加到小球,孵化与间歇搅拌30分钟。提取离心机,上层清液(核提取物)转移到pre-chilled管为存储−70°C。
2.9。高密度的文化
高密度大众文化进行一个钢网格桥如前所述[5]。短暂,纤维素过滤器放在桥上细胞悬液(8μL),包含约100万个细胞,。培养基是接触过滤介质的过滤和细胞保持接口通过扩散。在文化一天后,细胞形成一个三维颗粒过滤器。培养基是改变每三天。
2.10。透射电子显微镜(TEM)
细胞被固定为1 h和Karnovsky固定剂(paraformaldehyde-glutaraldehyde)其次是postfixation OsO在1%4解决方案(0.1磷酸盐缓冲剂),如前所述[32]。单层细胞颗粒在一个提升酒精冲洗和脱水系列之前嵌入在环氧树脂和削减Reichert-Jung Ultracut E(达姆施塔特,德国)。超薄部分与2%醋酸双氧铀/柠檬酸铅。透射电子显微镜(TEM 10、蔡司、耶拿,德国)被用来检查文化。
2.11。免疫印迹分析
软骨细胞层与汉克的洗了三次平衡盐溶液(哈佛商学院)和全细胞蛋白提取通过孵化裂解缓冲(50毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值7.2,150毫米氯化钠,l % (v / v)特里同x - 100, 1毫米原钒酸钠,50 mM焦磷酸钠,100毫米氟化钠,0.01% (v / v)抑肽酶,4μ10 g / mL抑肽素μg / mL亮抑酶肽,1毫米PMSF)冰为30分钟,和细胞碎片被离心分离去除。上层清液储存在−70°C。整个细胞的总蛋白浓度,确定核和胞质提取物根据bicinchoninic酸系统(Uptima, Interchim、Montlucon、法国)用BSA作为标准。调整后等量(50μg蛋白每车道)的总蛋白质,蛋白质是由sds - page分离减少条件下凝胶(5 7.5%)。分离蛋白转移到硝化纤维膜。膜在阻塞preincubated缓冲区(5% (w / v)脱脂奶粉在PBS / 0.1% Tween-20) 30分钟和孵化主要抗体(1 h)。膜清洗三次阻断缓冲区和孵化与碱性磷酸酶共轭二次抗体为30分钟。他们终于在0.1洗了三次三包含0.05 MgCl pH值9.52和0.1 M氯化钠。硝基蓝四唑和5-bromo-4-chloro-3-indoylphosphate (p-toluidine盐;美国皮尔斯,罗克福德,IL)被用作基质揭示碱性phosphatase-conjugated特定抗原抗体复合物。
2.12。统计分析
结果表示为代表的意味着±SD实验一式三份。使用学生的方法进行了比较t以及假设方差和相等被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
这在体外研究进行调查三个植物提取物的抗炎作用的信号通路导致激活转录因子NF -κB和选择目标基因的产品,也就是说,软骨细胞蛋白质的重要功能。软骨细胞与植物提取物治疗(10μg / mL)没有任何细胞毒性的迹象在光和电子显微镜(超微结构)的水平。il - 1β用于检测植物提取物的作用在NF -κB激活途径,因为通路激活细胞因子相对好理解。
3.1。植物提取物抑制il - 1β全身的软骨细胞细胞毒性
检测il - 1β抑制软骨细胞增殖的MTT测定进行了研究植物提取物的影响软骨细胞的生存能力和扩散处理或没有il - 1β。MTT检测是基于能力的活细胞减少MTT盐,而死细胞或那些受损的线粒体活动无法这样做。软骨细胞在96孔培养板与il - 1和治疗β、植物提取物、植物提取然后用il - 1进行处理β表示时间。软骨细胞的生存和增殖培养只有在il - 1的存在β相比大大降低了软骨细胞治疗的植物提取物、植物提取物和il - 1β,或者不及时治疗(图1)。结果表明积极影响的三种植物提取物对细胞生存和增殖抑制il - 1β全身的软骨细胞的细胞毒性。
3.2。植物提取物阻断il - 1β全身的细胞/超微结构的变化和软骨细胞的凋亡
控制单层后软骨细胞24(没有显示),48(图2(一个))和72 h(没有显示)显示一个典型的扁平的形状与细胞质小流程,很大,主要是常染色质的细胞核和核仁结构良好的细胞质。il - 1β治疗的软骨细胞单层培养24(数据没有显示)和48 h(图2 (b))导致退行性变化等多个液泡,肿胀的呃,线粒体肿胀,聚类和其他退化细胞的细胞器。后长潜伏期(72 h)(数据未显示)更严重的细胞变性的特点被认为对il - 1的回应β治疗。其中包括浓缩异染色质在细胞核和多个细胞质液泡。夷为平地的单层软骨细胞变得越来越圆和凋亡(图2 (b))。软骨细胞使用任何植物提取物(10μg / mL)(24小时),然后cotreated il - 1β和相同的植物提取物(10μg / mL) 48 h显示那么严重细胞变性在超微结构水平(数字2 (c)- - - - - -2 (e))。软骨细胞仍然是一个扁平的形状与众多microvilli-like胞质过程。软骨细胞处理植物提取物(每10点μg / mL)没有任何细胞毒性的迹象影响细胞的生存能力,光显微和超微结构水平(数字2 (f)- - - - - -2 (h))。总的来说,这些结果表明,三种植物提取物有抗凋亡作用和抵消il - 1β全身的软骨细胞的凋亡。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
3.3。植物提取物抑制il - 1β细胞外基质和差别全身对这些信号在软骨细胞蛋白质
Serum-starved软骨细胞治疗与il - 1β(10 ng / mL)单独或与三个不同的植物提取物(10 preincubatedμ每g / mL) 24 h,然后cotreated il - 1β(10 ng / mL) 24、48、72 h。如图3与il - 1,软骨细胞的刺激β的差别仅显示对这些合成胶原蛋白II型(图3(我)),cartilage-specific蛋白聚糖(CSPG)(图3(2)),β1-integrin(图3(3))。与il - 1与软骨细胞的刺激β孤独,预处理与所有植物提取物导致显著上调合成胶原蛋白II型(图3(我)),CSPG(图3(2))β1-integrin(图3(3))。在未经处理的和积极的控制文化,表达胶原蛋白II型,CSPG,β1-integrin同样强烈在软骨细胞(数字3(我)3(3))。蛋白质合成的管家β肌动蛋白仍影响软骨细胞暴露于植物(图3(四))。
3.4。植物提取物抑制il - 1β全身Upregulation NF -κB-Dependent促炎的酶在软骨细胞和基质降解基因产品
il - 1β刺激激活cox - 2和基质金属蛋白酶表达在软骨细胞(33]。调查是否三种植物提取物能够抑制il - 1β全身的这些蛋白质的表达,进行以下实验。Serum-starved软骨细胞暴露在il - 1β(10 ng / mL)单独或与三个不同的植物提取物(10 preincubatedμ每g / mL) 24小时然后co-treated il - 1β(10 ng / mL) 24、48和72 h。整个细胞提取物的准备和分析了西方墨点法对cox - 2的存在,MMP-9和MMP-13(数字4(我)4(3))。如图4软骨细胞显示,老年病的合成cox - 2(图4(我)),MMP-9(图4(2))和MMP-13(图4(3)对il - 1的回应β(10 ng / mL)。与il - 1与软骨细胞的刺激β孤独,与所有植物提取物和il - 1 co-treatment预处理β导致降低cox - 2, MMP-9 MMP-13表达式(数字4(我)4(3))。在未经处理的和积极的控制文化中,cox - 2的表达,MMP-9, MMP-13没有可检测软骨细胞(数字4(我)4(3))。蛋白质合成的管家β肌动蛋白(图尚未受到影响4(四))。
3.5。植物提取物抑制il - 1β适配器蛋白质自燃,差别全身对这些信号蛋白质P-ERK1/2和Cartilage-Specific转录因子SOX-9软骨细胞中表达
MAPKinase通路在软骨细胞分化中起着重要的作用,刺激chondrogenic因素SOX-9在软骨细胞(7,8]。SOX-9是一种转录因子,控制chondrocyte-specific ECM的表达蛋白基因在软骨细胞分化中起着举足轻重的作用,因此被选为本研究。此外,人体自燃现象MAPKinase信号通路,适配器蛋白质和细胞外调节激酶(Erk1/2)进行评估。来测试假设植物提取物能够刺激软骨细胞SOX-9生产单层文化与il - 1不及时治疗或治疗β或植物提取物单独或使用植物提取物(10μg / mL) 24 h,然后与il - 1刺激β24 h。细胞溶解产物被免疫印迹分析。在未经处理的和积极的控制文化,人体自燃现象的表达,ERK1/2, SOX-9同样的软骨细胞(数字5(我)5(3))。结果表明,治疗三个植物提取物抑制il - 1β全身的人体自燃现象减少,ERK1/2 SOX-9表达式(数字5(我)5(3))。数据显示是代表三个独立的实验。蛋白质合成的管家β肌动蛋白(图尚未受到影响5(四))。
3.6。植物提取物抑制il - 1β全身的NF -κB在软骨细胞激活
检查如果植物提取物阻断il - 1β全身的激活NF -κ探讨了B,核内蛋白提取物serum-starved软骨细胞磷酸化形式的p65 NF -κb亚单位与植物提取物预处理后(10μ每g / mL) 4小时后跟cotreatment 10 ng / mL il - 1β和植物提取物1 h。一些软骨细胞文化仍然未经处理或处理10μg / mL植物提取物(每个单独)或10 ng / mL il - 1β仅1 h(图6(我))。结果表明,植物提取物抑制il - 1β全身的NF -κB激活(图6(我))。PARP蛋白质的合成(图尚未受到影响6(2))。
3.7。植物提取物抑制il - 1β刺激Nuclear-Translocation NF -κB在软骨细胞
免疫荧光显微镜是用来揭示易位的磷酸化NF -κB从软骨细胞细胞质细胞核对il - 1的回应β。软骨细胞仍要么如果(图7(一))或服用10μg / mL植物提取物(每个单独)或10 ng / mL il - 1β仅10分钟(图7(b))或cotreated 10μg / mL植物提取物(每个单独)10分钟,然后10 ng / mL il - 1β1 h(数字7(c) -7(e))在间接immunolabeling anti-NF -κB抗体。单独控制软骨细胞和软骨细胞治疗与植物提取物(图中未显示)表明只有细胞质标签的NF -κB(图7(a))。il - 1β刺激细胞显示清晰和NF -密集的细胞质和核染色κB(图7(b))。Cotreatment软骨细胞的植物和il - 1β导致抑制核过渡激活phosphor-p65和降低这种蛋白质的胞质染色和NF -激活也呈现出一定的下降κB(数据7(c) -7(e))。这些immunomorphological与NF -发现是一致的κB抑制观察到免疫印迹。
3.8。植物提取物抑制il - 1β我全身的κBα在软骨细胞退化
在这项研究中,植物提取物抑制il - 1β全身的激活NF -κB和软骨细胞的细胞核的易位。激活NF -一个重要的先决条件κB我的磷酸化和退化κBα,自然NF -阻滞剂κB (34]。检查是否抑制il - 1β全身的NF -κ我通过抑制激活发生κBα退化,有些软骨细胞文化接受il - 1β(10 ng / mL)表示时间(数字8(我)8(III))和其他软骨细胞文化第一次处理三种植物提取物(10μ每g / mL)与il - 1 4 h co-treatment紧随其后β(10 ng / mL)表示时间。il - 1β不能引诱我κBα在软骨细胞退化co-treated植物提取物(数字8(我)8(3))。考虑,il - 1β我全身的κBα退化NF -在未经处理的文化中是一个指标κB激活,结果表明植物提取物阻断il - 1β我全身的κBα退化。
3.9。植物提取物抑制il - 1β端依赖我κBα在软骨细胞磷酸化
来确定植物提取物能够抑制il - 1β我的全身的磷酸化κBα,serum-starved软骨细胞治疗与il - 1β1 h和检查使用抗体免疫印迹分析,认识到我的磷酸化形式κBα。众所周知,我的磷酸化κBα导致降解[16),我的磷酸化和退化κBα是由一个特定的蛋白酶体抑制剂抑制N-Ac-Leu-Leu-norleucinal (ALLN) [35]。如数据所示9(我)9(3)、il - 1β我还能够使磷酸化一些κBα在细胞与抑制剂预处理和我κBα磷酸化是控制细胞相比显著提高。有趣的是,所有的植物提取物能够抑制我的磷酸化κBα诱导il - 1β抑制剂的存在与否。
3.10。植物提取物抑制il - 1β全身影响软骨细胞的三维(高密度)文化模型
测试是否从单层培养软骨细胞或没有il - 1β和/或植物能够产生cartilage-specific ECM和软骨,高密度文化准备从单层培养的软骨细胞。这些未经处理的控制由细胞和细胞治疗植物提取物(10μ克/毫升)或il - 1β(10 ng / mL)仅24 h与il - 1在接受治疗β(10 ng / mL)在相同的条件下,培养7天。如图10、控制文化形成的软骨细胞blastema-like结节,紧密联系。他们表现出圆的椭圆形状,大常染色质的细胞核,细胞质核糖体,线粒体和内质网(ER),以及空泡。细胞出现可行的软骨细胞表现出典型的形态学特征和形成了一个常规的纤维细胞外基质(图10 ())。相比之下,接受il - 1时,软骨细胞进行了细胞凋亡β(10 ng / mL)(图7天10 (b))。软骨细胞co-treated植物提取物和il - 1β(每10μg / mL)显示成熟的软骨结节(数字10 (c)- - - - - -10 (e))。预处理与植物提取物(每10μg / mL)单独导致成熟的软骨结节与可行的细胞和组织的细胞器;细胞形成一个密集的和常规的ECM(数据10 (f)- - - - - -10 (h))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
4所示。讨论
本研究的目的是描述的效果和作用方式三个植物植物提取物和NF -之前报道的抗炎活性κB表达主要犬类软骨细胞在体外。在实验条件下,(1)植物提取物抑制il - 1β的关键细胞外基质和信号蛋白介导的抑制软骨细胞;(2)植物提取素引起il - 1β端依赖upregulation MMP-9, MMP-13, cox - 2;(3)il - 1β引起的磷酸化和核易位p65 NF -κB亚基;(4)il - 1β磷酸化和随后的退化引起的抑制NF -亚基κB:我κBα;(5)il - 1β全身的NF -κ我激活和κBα抑制了降解植物;(6)最后,与il - 1β处理细胞,细胞处理后植物提取物redifferentiated成软骨细胞转移到高密度文化和产生一个cartilage-specific矩阵,即胶原蛋白II型,即使cotreated il - 1β。因此,获得的结果表明,植物提取物抑制il - 1β全身的老年病的MMP-9 MMP-13, cox - 2通过阻止,至少在某种程度上,我κBα退化和NF -κB激活。原理图11总结了可能的植物提取物的作用方式。
系统评价的临床研究显示小证据支持植物药物有效治疗OA (36]。然而,三种植物的提取物进行了分析在这项研究中一直在使用传统药物几个世纪以来,都声称相关治疗OA。同时病人继续寻求自然疗法帮助治疗他们自己或他们的伴侣动物,提供见解是否很重要,如果那么,这些植物可能工作。因此,在体外模型提供了一个客观的指标来表示潜在的行动如果翻译模式在活的有机体内。
三种植物提取物在这项研究源于植物的不同部分和以前的出版物已经宣称不同的活性成分。本研究提供的数据可以用来表明有三个植物的活性物可以抑制il - 1β我全身的炎症过程的上游κBα磷酸化的一步。同时行动的确切机制仍然未知,数据也可以用来表明il - 1β抑制活动是常见的植物物种和组织。与越来越多的刊物要求特定的活性物,它可能是一个适当的时间来考虑植物提取的共性,而不是关注大量的特定植物的“独特”的属性,这可能会导致混乱和怀疑植物疗法的面积。
这三种植物提取物对软骨细胞生存能力有积极影响,分化和功能以及在抑制对il - 1的影响β全身的抑制增殖和生存能力。此外,三种植物线粒体活动增强,软骨细胞,用MTT试验来衡量。报道观察植物,干扰试验通过抗氧化剂(如硫醇和类黄酮)减少MTT (37],我们也观察到显著的负面和无关紧要的反应与其他植物(数据没有显示)。同时增强线粒体活动的确切原因不是调查,它被认为是一种增强代谢的指标,因此,被认为是一个潜在的积极的属性。
Cell-matrix交互在软骨增殖至关重要,细胞分化和生存,这种互动是由特定的表面受体,例如,整合蛋白(6,7,38]。β1-integrins能够组织细胞表面机械感受器复合体(39)和函数作为信号转导分子(40)刺激MAPkinase通路(7,8]。几项研究已经表明,减少cell-matrix相互作用导致抑制Erk1/2信号和刺激软骨细胞凋亡通路8]。在这个在体外模型系统,il - 1β胶原蛋白II型差别引起对这些CSPG,软骨细胞整合素的表达。这些发现与之前的协议在体外研究[18]。治疗三个植物阻止il - 1β全身抑制胶原蛋白II型、CSPG和整合素表达il - 1β刺激软骨细胞。
在这项研究中,il - 1β诱导upregulation MMP-9, MMP-13, cox - 2。Cell-matrix交互需要永久重塑的细胞外基质蛋白质执行的基质金属蛋白酶,一群zinc-dependent肽链内切酶切割ECM分子(41)和高水平的基质金属蛋白酶(金属蛋白酶- 1,MMP-3、MMP-9 MMP-13)中发现的滑膜和血清OA和RA患者(42,43]。cox - 2是一个重要的调停人OA关节的疼痛和炎症(44)导致铂族元素2凝血恶烷生产(45]。铂族元素2引发许多其他病理分解代谢的影响等软骨软骨细胞增殖和抑制减少ECM合成(45]。我们建议的下调基质金属蛋白酶和cox - 2植物是监管,至少部分通过NF -κB抑制,因为这些酶的表达是受NF -κB (33,46- - - - - -48]。
细胞因子诱导MMP和cox - 2 upregulation受无处不在的转录激活因子NF -κB (49]。这种转录因子在OA的发病机制中起着重要的作用,通过调解分解和炎症相关的基因的表达。有趣的是,NF -抑制剂κB有抗炎和antidegradative OA的效果在动物模型50]。在目前的研究中,增加对il - 1 p65磷酸化的反应β是证明。这个磷酸化事件,反过来,导致其退化和NF -后续版本的激活κ结果还表明,我κBα完全废除在软骨细胞的胞质提取文化接受il - 1β独自一人,这表明这些细胞因子诱导降解。这表明NF -κB激活。治疗软骨细胞培养的植物提取物导致高浓度的我κBα在细胞质和核提取物的磷酸化p65水平下降。这些结果表明,植物提取物抑制il - 1β软骨差别全身对这些特定的ECM成分,MAPK-signaling蛋白质,cartilage-specific转录因子和促炎和降解酶通过upregulation NF -κB激活通过阻止,至少在某种程度上,我κBα磷酸化和退化。
cartilage-specific转录因子SOX-9扮演着一个重要的角色在cartilage-specific细胞外基质基因的表达(51]。在这项研究中,减少胶原蛋白II型和SOX-9表达与il - 1治疗后软骨细胞β与另一项研究观察,在协议(52]。其他调查人员表明,细胞因子通过NF -部分降低SOX-9蛋白质水平κB-dependent,转录后的机制在小鼠软骨细胞(18]。然而,通过与植物提取物治疗细胞,抑制il - 1β全身的NF -κ胶原蛋白II型和SOX-9差别B-dependent对这些基因的表达被观察到。这项研究的结果表明,植物提取物显著抑制细胞因子激活和upregulation基质金属蛋白酶等酶促炎和cox - 2,转录因子NF -κB cartilage-specific矩阵的差别,对这些组件和重要的软骨细胞信号蛋白。虽然植物提取物可以表现出多种模式的行动,基于我的κBα磷酸化的数据,可能抑制il - 1β信号通路的上游κBα磷酸化的主要原因可能是抗炎活动在这项研究中观察到。单层培养的软骨细胞似乎是一个有效的模型为研究植物提取物的作用方式与潜在的抗炎作用。然而,在活的有机体内软骨细胞存在于一个三维细胞外基质。因此,研究也使用高密度的执行文化,这表明,植物提取物抑制il - 1β全身的炎症和细胞凋亡,使细胞高密度培养redifferentiate回软骨细胞。
5。结论
在这项研究中使用的三种植物提取物来自植物的不同部分用于传统医学。以前的出版物已经宣称不同的活性成分和一些成分具有抗炎作用。在这项研究中类似的在体外这三种不同的植物提取物的影响是重要的观察和可以用来支持认为他们可能潜在chondroprotective代理。然而,需要进一步的调查来描述生物实体中提取,阐明其亚细胞的目标在体外并确定是否任何类似的活动或合作的能力在活的有机体内。
缩写
| ALLN: | 蛋白酶体抑制剂N-Ac-Leu-Leu-norleucinal |
| : | 环境温度 |
| CSPG: | Cartilage-specific蛋白聚糖 |
| cox - 2: | Cyclooxygenase-2 |
| DMSO溶液: | 二甲亚砜 |
| ERK 1/2: | 细胞外调节激酶1和2 |
| FCS: | 胎牛血清 |
| IKK: | lκB激酶 |
| il - 1β: | Interleukin-1β |
| MAPK: | 增殖蛋白激酶 |
| MMP的: | 基质金属蛋白酶 |
| NF -κB: | 核因子-κB |
| 麻省理工: | (3)- 4 5-dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴离子 |
| 非甾体抗炎药: | 非甾体类抗炎药 |
| 办公自动化: | 骨关节炎;PARP(保利(ADP-Ribose)聚合酶) |
| PBS: | 磷酸盐 |
| 人体自燃: | src同源性胶原蛋白 |
| TIMPS: | 组织基质金属蛋白酶抑制剂。 |
利益冲突
作者宣称他们没有利益冲突和商业支持或支持Shamanshop,植物提取物的来源用于这项研究。
作者的贡献
美国Nebrich进行实验和数据收集工作。m . Shakibael d Allaway, a Mobasheri构思研究设计,协调研究,数据解释和纸准备。所有作者阅读和批准最终的论文。
确认
本研究是m . Shakibaei和赠款支持a Mobasheri沃尔瑟姆的宠物营养中心(火星)。一个。Mobasheri希望承认金融支持生物技术和生物科学研究委员会(BBSRC;批准号BBS / S / M / 2006/13141),威康信托基金会(批准号CVRT VS 0901),来自诺丁汉大学的启动资金。作者要感谢克里斯蒂娜普法夫太太和优秀的技术援助的乌苏拉Schwikowski女士和康斯坦丝博士提供的额外的科学支持Buhrmann。我们愿意承认Puleva植物提取物的生物技术。作者感谢教授Ulrike魅力匙,诊所的兽医手术Ludwig-Maximilian-University慕尼黑,德国犬关节软骨的慷慨的供应样品。