文摘

两个鼠标模型被用来分析的抗过敏药影响鹿茸(VA)的台湾人的黑鹿(Cervus单色的swinhoei在这项研究中。结果使用卵白蛋白(OVA)致敏小鼠模型表明,总IgE水平和OVA-specific IgE减少VA粉后4周的管理。此外,体外结果表明,辅助T细胞的分泌1 (Th1)调节性T (Treg)和脾细胞显著增加(Th17细胞因子)当VA粉接种的老鼠。此外,OVA-allergic哮喘小鼠与VA粉口服管理表现出强烈的抑制支气管肺泡Th2细胞因子和促炎细胞因子的生产流体控制老鼠相比。人口增加监管t细胞过敏性哮喘小鼠的脾细胞VA口服后也观察到。所有哮喘表型的特点,包括气道炎症和气道高反应性的发展,减少了治疗。这些研究结果支持假设口腔喂食VA可能是一个有效的方法缓解哮喘症状。

1。介绍

鹿茸(VA),家族成员的unossified鹿角鹿科,被用于中药和保健食品2000多年1]。VA已经研究了各种影响,包括抗炎作用[2),抗氧化性能,antilipid过氧化属性(3),和抗感染效果1]。许多报道和临床观察令人信服地表明,VA及其提取物能缓解类风湿性关节炎的症状(4,5)、骨关节炎和骨质疏松症(6,7),能促进皮肤细胞增殖和血管生成8,9),可用于治疗心力衰竭(10]。尽管VA施加的健康益处的详细机制尚未阐明,VA引起的免疫调节作用,如抑制促炎细胞因子和辅助T 1 (Th1细胞)在血清和关节(1,5)、upregulation的单核细胞和吞噬活动的增强11,12),被认为扮演关键角色的健康益处。

弗吉尼亚州的可能的生物活性成分,对这些活动进行了调查。弗吉尼亚州的磷酸盐和神经节甘脂能够缓解衰老的症状(13,14]。各种多糖和lysophosphatidylcholines已被证明负责抗溃疡的抗高血压活性,分别为(15]。与饱和磷脂酰胆碱脂酰链似乎充当immunostimulating因素(16]。弗吉尼亚州的其他组件,如多肽(17)、甾醇类和无机物质(钙、锌、铅)18,19),可能参与其他健康益处。这些包括,最近,一位小说3.2 kDa多肽VA的红鹿(Cervus elaphus林奈)能够刺激大鼠表皮细胞的生长和兔肋软骨细胞剂量依赖性的方式(17]。

台湾的黑鹿(Cervus单色的swinhoei)是一个在台湾本土亚种鹿发现(20.]。使用其血管免疫助推器和作为antiallergy剂以来稳步提高鹿1963年在台湾农业;然而,很少有研究调查的有效性补充VA对过敏性疾病的预防和治疗。过敏性哮喘、1型超敏反应的特点是一个allergen-induced肺部慢性炎症与气道高反应性(AHR);它也涉及一个增强的嗜酸性粒细胞allergen-induced杯状细胞增生,增加有浓度过敏原特异性免疫球蛋白E (Ig)水平,增加辅助T细胞2 (Th2)主要细胞因子的生产,和淋巴细胞浸润到航空公司。在我们之前的研究中,我们展示了保护机制所诱导的弗吉尼亚州金黄色葡萄球菌被感染的动物模型(1]。弗吉尼亚州的防护机制包括诱导生产各种T调节细胞因子(1]。这个特性也可能与抗过敏药的影响。因此我们在这项研究的影响进一步研究VA台湾人的黑鹿(Cervus单色的swinhoei)预防过敏和哮喘。

2。材料和方法

2.1。我们的样品

弗吉尼亚州从台湾的黑鹿是动物传播收获在高雄车站,台湾家畜研究所(Pintong、台湾)后75天的VA生长期。新鲜的VA立即被切片和冻结在−20°C。弗吉尼亚州冷冻切片被冻干脱水(冷冻干燥机,Kingmech有限公司,台北,台湾),然后磨成细粉(VA粉)磨粉机使用少于100网(没有。RT-02A,荣Tsong有限公司,台中,台湾)。

为在体外化验,脱水VA提取物溶解在杜尔贝科的磷酸盐(DPBS;热费希尔科学Inc .,洛根、UT、美国),通过0.22消毒μm过滤器(微孔Corp .)、Carrigtwohill、爱尔兰)。这里,进行实验的提取样品溶解和稀释前立即进行化验。

2.2。实验动物

六个雌性BALB / cByJNarl小鼠(国家实验室动物中心;NLAC,台北,台湾)习惯于他们的新环境开始前至少1周的实验。老鼠被维护在一个自动光/暗周期(光周期14 h)。温度和湿度保持不变在22°C和50%,分别。动物护理和治疗进行按照美国国家科学委员会的指导方针。

2.3。OVA-Sensitized小鼠模型

一个实验性过敏性小鼠模型,描述了Pichavant et al。21和香港等。22),本研究中使用了一些细微的修改。老鼠intragastrically (IG)美联储为2.5 5或10毫克的VA粉末溶解在200年μL PBS日常整个实验周期。200年的老鼠μL蒸馏水有或没有卵子敏感被用作正面和负面的对照组,分别。后,天收集0,14日,21日和28颌下为了让总出血和OVA-specific IgE量化。28天,老鼠被牺牲了,他们的脾细胞收获体外细胞因子分析。

2.4。过敏性哮喘小鼠模型

卵白蛋白-(卵子)过敏性气道炎症致敏小鼠模型是用于研究和详细描述了李et al。23和香港等。24]。10毫克的老鼠VA粉/鼠标/天整个实验周期。最初,小鼠腹腔内注射致敏的20倍μg卵子(σ,V级)。该协议是类似于OVA-sensitized小鼠模型。在天28、29、30,老鼠的挑战与卵子在PBS(1%)或PBS超声波雾化(爱尔兰戈尔伟Aerogen爱尔兰有限公司)为20分钟/鼠标。32天,小鼠的气道反应性测定。血液被收集的老鼠牺牲前颌下出血。

2.5。气道反应性

最后一个卵子的挑战,在24小时后已肺功能测量是由全身体积描记法(Buxco WBP, Buxco。电子、数控、美国威尔明顿)所描述的卡里et al。25]。剂量反应的斜率之间的线性回归计算测量的气道阻力和log10-transformed醋甲胆碱剂量(12.5、25和50毫克/毫升;σ)。

2.6。脾细胞的制备

老鼠被颈椎脱位牺牲,和脾细胞收获了文化。的制备脾细胞文化跟随香港等描述的过程。24]。短暂,脾脏被切除,放置在10毫升的rpmi - 1640中(美国UT HyClone, Logan)补充1%的抗生素(50μ青霉素g / mL, 50μg / mL硫酸链霉素和100μg / mL硫酸新霉素;表达载体,卡尔斯巴德、钙、美国)。脾脏被切成块然后按70μm细胞过滤器(BD猎鹰,贝德福德,妈,美国)。这些细胞被冲洗10毫升rpmi - 1640中1%的抗生素然后离心机(800×g)在室温下为5分钟。5毫升的细胞颗粒收集和resuspended红细胞裂解缓冲2分钟。洗涤、离心后,细胞颗粒在5毫升resuspended heat-inactivated rpmi - 1640中抗生素1%和10%胎牛血清(美国的边后卫,表达载体,卡尔斯巴德,CA)和调整2×10⁵细胞/毫升24-well文化板块。

孤立的脾细胞不同治疗组治疗与卵清蛋白(100μg / mL) 48小时。治疗后,细胞梅达收集和利用离心力分离10000 g×3分钟丢弃电池。上层清液被存储在冰箱−80°C。

2.7。支气管肺泡灌洗(BAL)和肺组织学

牺牲小鼠体内后,肺部是冲洗1毫升PBS。通过气管支气管肺泡液体通过吸气三倍管子。的细胞球流体被离心去除在200 g×15分钟,然后在PBS样本resuspended(1毫升)。上层清液被储存在−80°C,直到他们的细胞因子含量可以度量(26]。删除后落下帷幕,小鼠的肺膨胀10%福尔马林(Wako,东京都中央区日本大阪),固定24小时,嵌在石蜡中。固定和嵌入组织被苏木精和伊红染色(σ)允许组织学评估使用光学显微镜(最适条件、极光、有限公司、美国)。周期性acid-Schiff (PAS)染色(圣马科斯IMEB Inc .)、钙、美国)也应用为了测量杯状细胞和粘液生产。

2.8。细胞因子和Ova-Specific IgE水平的测量

各种细胞因子的水平(il - 4、IL-5 IL-13, IL-12p40, il - 6、il - 1β肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)和干扰素-γ)被评估使用研发系统(明尼阿波利斯,美国)。结果表示为每个细胞因子的浓度(pg / mL)。血液样本收集的治疗小鼠颌下出血,凝固在室温下1 h,然后随后在17500×g离心5分钟。OVA-specific IgE决定使用一个OVA-specific IgE工具包(Serotec、牛津大学,英国)。

2.9。统计分析

所有结果都是使用一般线性模型分析过程可以从统计分析系统软件版本8.1。邓肯的多个范围测试是用来检测不同治疗手段。每个实验进行了一式三份。

3所示。结果

3.1。VA粉的台湾人的黑鹿减少的IgE和脾脏重量老鼠使用OVA-Sensitized模型

评估的影响VA粉预防过敏反应,血清总IgE抗体的水平是评估每星期在这项研究中(图1(一))。血清总IgE的效价是1日致敏后升高。VA粉治疗能够显著抑制这增加血清总IgE 14天,21日和28日。在28天OVA-specific IgE水平也显著抑制()OVA-sensitized小鼠的血清VA(图1 (b))。高剂量显然导致了更大的IgE抑制效果。卵巢致敏小鼠的脾脏重量后检查牺牲(数据未显示)。小鼠的脾脏重量显著增加(卵子敏化后)。然而,当致敏小鼠接受VA粉、脾脏重量有明显降低()。另一方面,体重变化没有显著差异在所有治疗组(数据没有显示)。

3.2。弗吉尼亚州从台湾的黑鹿影响细胞因子的生产Th1、Th2, Treg, Th17使用OVA-Sensitized模型小鼠的脾细胞

澄清的机制抑制IgE生产OVA-sensitized老鼠,我们检查Th1细胞因子的水平,Th2, Treg, Th17 OVA-sensitized小鼠的脾细胞体外。当Th1细胞因子检测(数字2(一个)- - - - - -2 (c))、干扰素-的水平γ肿瘤坏死因子-α和脾细胞从老鼠- 2 (VA粉显著高于)小鼠卵巢正控制相比,这种方式细胞和细胞龛之间增加发生在剂量反应关系。然而,il - 12水平没有显著差异之间的阳性对照组和VA粉组(图2 (d))。与上面的结果,Th2细胞因子的生产,在脾细胞il - 4,抑制OVA-sensitized老鼠与VA粉(图2 (e))。然而,另一个Th2细胞因子的生产,IL-5显示,两组之间没有差别(图2 (f))。

当Treg细胞因子检测(数字2 (g)和2 (h)),分泌的il - 10和TGF -β1由脾细胞显著减弱(与VA粉)治疗,这种方式细胞和细胞龛之间发生在一个剂量反应关系。类似的效果也观察到Th17细胞因子(数字2(我)和2 (j))含量要高得多()IL-17A和IL-17F VA-treated集团的脾细胞中观察到与卵子相比正控制小组。这些发现表明,口服VA粉结果的抗过敏药影响OVA-sensitized小鼠模型,而这影响发生方式细胞和细胞龛之间的剂量反应关系。进一步评估的可能性VA能够防止allergic-airway反应,我们选择了一个10毫克/天/鼠标模型探索的影响VA的IgE抗体水平血清,落下帷幕,IgE抗体水平在肺组织学和气道反应。

3.3。血清VA的台湾人的黑鹿减少IgE生产和减毒Th1、Th2, Th17水平在脾细胞使用过敏哮喘小鼠模型

老鼠口服美联储10毫克的VA粉显示显著减少OVA-specific IgE水平(在21日和28天)(图3)相比OVA-allergic哮喘小鼠。评估治疗VA粉是否能够防止气道过敏反应,Th2和Th1细胞因子水平也决定从OVA-allergic哮喘小鼠脾细胞体外。结果表明增加脾细胞生产各种Th2细胞因子(il - 4、IL-5 IL-13)和各种Th1细胞因子(il - 1β、il - 6和TNF -α),而Th17细胞因子被发现显著减毒在脾细胞()OVA-allergic哮喘小鼠使用10毫克/天/鼠标VA粉(图4)。

3.4。弗吉尼亚州的台湾人的黑鹿减毒气道反应和过敏性肺部症状使用过敏哮喘小鼠模型

气道的反应表明,OVA-allergic哮喘小鼠显著增加增强暂停(金边)反应剂量的雾化与正常相比乙酰甲胆碱-控制()。的发展增加气道反应明显减弱时,老鼠使用10毫克/天/鼠标的VA粉(图5)。

组织学结果显示卵巢气溶胶挑战诱导明显炎症细胞浸润到peribronchiolar和血管周围结缔组织(图6(一)(A))。大多数的渗透炎症细胞是单核细胞和嗜酸性粒细胞。嗜酸性粒细胞的提高OVA-allergic哮喘小鼠的肺实质被治疗显著降低10毫克/天/鼠标VA粉(图6(A) (b))。这些结果被证实的支气管肺泡灌洗细胞数量(图6(B))。嗜酸性粒细胞数明显减少OVA-allergic哮喘小鼠使用10毫克/天/鼠标的VA粉。

PAS染色被用来评估杯状细胞增生,并一起发现有生产过剩的粘液的支气管气道的杯状细胞增生OVA-allergic哮喘小鼠和正常小鼠中,这是没有影响(数据6(a)和(C)6(C) (b))。弗吉尼亚州的小鼠口服治疗粉显示出显著的抑制增长的粘液生产和杯状细胞增生(图6(C) (C))。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们使用两个小鼠模型试验的影响VA台湾人的黑鹿(Cervus单色的swinhoei)对预防过敏和哮喘的效果。OVA-sensitized模型清楚地表明,口服接种VA粉似乎有抗过敏药影响通过抑制OVA-specific IgE生产(图1)和脾脏重量增加的预防。血清IgE是最重要的一个临床过敏反应的标记。这样减少血清OVA-specific IgE可能缓解过敏综合征由肥大细胞(27]。脾脏重量的增加反映了脾的炎症状态(28]。通常,有浓度过敏原特异性的天真和记忆T细胞的各种淋巴结,包括脾脏,接触过敏原后刺激增殖。上述研究结果表明,T细胞的增殖是口服预防的。

T细胞的增殖也应引发炎症反应Th2型,主要涉及il - 4和IL-5 [29日),然后倾斜Th1 / Th2平衡向Th2反应。Th1 / Th2平衡是很重要的在变应性疾病(27]。目前的研究结果表明,口服5毫克以上的VA粉能够提高水平的Th1、Treg, Th17细胞因子在脾细胞,从而导致生产的抑制OVA-sensitized Th2细胞因子的老鼠(图2)。这些变化Th1 / Th2反应转向一个更为平衡的状态。在的Th1细胞因子增加,众所周知,干扰素-γ的发展是一个重要的细胞因子Th1-mediated细胞免疫力,这有助于消除细胞内病原体通过激活巨噬细胞的吞噬作用的增加以及更高的il - 12的生产,不,和过氧化物30.,31日]。除了上述之外,这些变化将进一步支持Th1细胞自身的发展和抑制Th2细胞的发展31日]。2,另一个Th1细胞因子的分泌也显著升高VA powder-treated老鼠(图2 (c))。2是一个T细胞自分泌生长因子,促进生存,发展,和T细胞的分化32]。

抗炎监管细胞因子il - 10和TGF -β,这是由调节性T细胞(33),已报告能够缓解过敏炎症(34]。il - 10是一个关键的过敏性疾病的监管机构,不仅因为它会使Th2细胞来源的细胞因子il - 4和IL-535),还因为它直接抑制IgE-induced脱颗粒的肥大细胞,从而导致减少炎性介质的分泌组胺(36]。此外,TGF -β细胞因子,一个强有力的监管,能够启动Treg和Th17细胞的分化,抑制B淋巴细胞祖细胞的增殖,抑制T细胞和巨噬细胞的激活37,38]。Th17细胞是一个相对较新定义的Th细胞子集。Th17细胞的作用,Th17细胞因子在变应性疾病仍不清楚39];然而,一些研究表明,Th17细胞可能参与抑制生产的Th2细胞因子,il - 4和IL-540,41]。

采取上述结果在一起,看起来,口服的VA粉28天能够调节Th1 / Th2平衡增加的Th1 Th17, Treg细胞因子在脾细胞剂量依赖性的方式当一个OVA-sensitized模型。因此,我们进一步评估10毫克的抗过敏哮喘影响VA粉使用行之有效的OVA-induced哮喘模型。过敏性哮喘气道高反应性的特点是各种各样的过敏原,慢性肺嗜酸性粒细胞,升高血清IgE,气道粘液过度生产(42]。口服VA粉被发现导致抑制哮喘表型的上述特征,包括特定的IgE生产、气道炎症和气道高反应性的发展(数字5和6)。

所有的哮喘症状的抑制本研究相关的各种Th1细胞因子(TNF -程度都有所降低α、il - 6和il - 1β),水平降低的各种Th2细胞因子(il - 4, IL-5和使用IL13)和水平降低的Th17细胞因子(IL-17F)在脾细胞(图4)。影响Th1和Th17细胞因子在OVA-induced哮喘模型不完全平行的结果OVA-sensitized小鼠模型由于不同机制的两种模型。自从OVA-sensitized小鼠模型在早期诱发全身过敏,增强Th1和Th17细胞因子在脾细胞可能倾斜Th1 / Th2平衡向Th1反应防止过敏症状。另一方面,Th1和Th17细胞因子水平的增加OVA-induced哮喘模型似乎作用于上皮细胞和减弱与过敏性哮喘相关的过度炎症反应(43]。先前的研究还观察TNF -释放增加α(44),il - 1β(45)和il - 6 (46)在哮喘病人落下帷幕。拉恩说道et al。47)报道,免费可溶性IL-17期间产生严重的炎症,特点是高嗜中性粒细胞数字在人类的航空公司。

监管VA粉对免疫力的影响在其他研究已报告。戴et al。1)发现,VA诱导的保护性机制金黄色葡萄球菌动物可能包括来华的双重角色作为一种免疫增强剂和促炎细胞因子抑制细菌感染的后期。金等。5)发现一个IP注入VA提取能够预防关节炎大鼠的发展通过淋巴结细胞并抑制促炎细胞因子的分泌。在另一项研究中,休息脾细胞的增殖是显著增加处理时VA提取(48]。此外,Suh et al。49)显示,弗吉尼亚州似乎作为一种免疫增强剂,提高吞噬作用。许多水不溶性物质在弗吉尼亚州,比如神经节甘脂,唾液acid-containing鞘糖脂(50)、硫酸软骨素和脂肪酸,已经提出调节免疫反应的作用。弗吉尼亚州也包含一系列其他水溶性生物活性物质,如碳水化合物、氨基己醣,hydronyprolines,粘多糖,唾液酸,糖羰酸,和,其中一些可能参与免疫系统的调制。然而,弗吉尼亚州具体相关的生物活性化合物的抗过敏作用仍需进一步研究。

5。结论

综上所述,这里给出的结果清楚地表明,口服VA粉能够预防和减少OVA-induced过敏症状和小鼠气道高反应性。预防由弗吉尼亚州粉通过海拔Treg allergen-induced敏化发生,Th1、和Th17活动,通过抑制Th2细胞因子在脾细胞和通过抑制特定的IgE生产血清。相比之下,减轻气道疾病被发现与抑制Th2,促炎,Th17细胞因子在脾细胞和血清抑制特定的IgE生产;这些变化导致减少乙酰甲胆碱和降低气道高反应性在OVA-allergic哮喘小鼠肺部炎症。因此,强烈支持假设的VA粉口服摄入台湾人的黑鹿可能是一个有效的方法来预防过敏和哮喘症状的减轻。我们所知,这是第一篇论文完全探索的抗过敏药哮喘影响VA粉。

确认

这项研究是由项目农业委员会和国家科学委员会,行政院(台北,台湾)。作者要感谢Bor-Luen蒋教授的研究所免疫学、医学大学,国立台湾大学,提供全身体积描记法。