文摘
针灸调节炎症过程和生长因子通过增加血液循环在受影响的地区。在这项研究中,我们研究了针灸是否会影响伤口愈合受伤的老鼠。老鼠被分配随机分为两组:对照组和针灸组。8地点进行了针灸治疗受伤的区域。我们分析了伤口面积,炎性细胞因子,居民细胞增殖、血管生成和诱导extracelluar矩阵重构。在针灸对心after-wounding伤口大小7天组比对照组下降更明显。此外,蛋白质水平的促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)和interleukin-1β(il - 1β)相比显著降低控制在2和7天post-wounding。同时,我们分析了PCNA新生成的细胞进行免疫染色使用几个CD-31等表型标记,αsma acupuncture-treated组和i型胶原,PCNA-positive细胞增加,PCNA标记CD-31-positive船只,αsma -和胶原蛋白类型我正成纤维细胞的细胞,增加与对照组相比在post-wounding 7天。这些结果表明,针灸可能通过减少炎性反应提高伤口愈合,增加细胞增殖和血管生成,诱导细胞外基质重塑。
1。介绍
在正常伤口修复,控制和协调的免疫防御和上皮细胞增殖和分化之间的平衡是至关重要的。伤口愈合是一个复杂的过程,包括炎症、增生、上皮形成,血管生成,胶原蛋白矩阵形成(1,2]。在皮肤的炎症阶段修复,中性粒细胞和巨噬细胞浸润受伤区域清除受损组织和产生细胞因子,如巨噬细胞炎性蛋白(MIP) 1α白介素(IL)家庭和肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)加速修复过程3]。上皮形成发生的从伤口边缘和角化细胞的迁移和增殖分化的干细胞从剩下的毛囊灯泡(4,5]。同时,胶原蛋白沉积发生的大量生长因子如转化生长因子-β纤维母细胞生长因子(FGF)和血管内皮生长因子(VEGF),由巨噬细胞分泌,血小板和纤维母细胞。此外,血管生成是一个多步骤的过程,包括内皮细胞从母船,迁移,增殖,对齐,管形成其他船只6,7]。血管生成在伤口的愈合过程中扮演重要的角色(7- - - - - -9]。这个过程与血管生成等因素VEGF的表达和血小板衍生生长因子(PDGF)。
针灸是一种亚洲医学有着悠久历史的过程,涉及外围感官刺激治疗各种疾病。最近,一些研究试图阐明针灸的生理学。我们之前的研究表明,针刺特定穴位诱发大脑葡萄糖代谢的变化(10]。此外,针灸变弱炎症增加血液循环在受影响的区域11]。一些研究报道的针灸疗效安一点。正如我们所知,Ashi-point发现身体上的疼痛网站从业者。由于安点可以在任何地方,有一个无限数量的。阳光集团证明了有相似的治疗效果的针灸穴位之间的网站和Ashi-point整形术后疼痛(12]。李等人,只是等人报道,针灸治疗伤口及周围骨折加速愈合过程通过减少proinflammation和刺激表皮再生(13,14]。因此,我们相信针灸可能提供一种无毒和自然选择伤口愈合。然而,针灸的效果背后的确切机制仍不清楚。
在这项研究中,我们调查是否针灸治疗伤口的边缘改善伤口愈合,促进了居民的增殖细胞受伤的老鼠。同时,我们研究了针灸对血管生成的影响和诱导extracelluar矩阵重构伤口区域与促炎细胞因子的变化。
2。方法
2.1。动物
在这项研究中使用的实验协议设计符合准则制度建立的动物保健和使用委员会天主教大学医学院。男性Spraque-Dawley老鼠(270 - 300 g)最初在70%和5%异氟烷麻醉一氧化二氮和30%氧气使用感应室,并由2%异氟烷的混合物温度可控条件下(37±0.1°C)使用直肠温度计和加热垫(美国马萨诸塞州哈佛装置Inc ., Holliston)。剃须和70%乙醇清洗后,背侧皮肤是在中线和穿孔通过两层皮肤(10毫米直径)。动物们被分成两组:(1)吸入麻醉组伤后(对照组)和(2)acupuncture-treated实验组(,针灸组)。每组分为三个时间点组(2和7天后伤口;每个时间点)。
2.2。针灸治疗过程
针灸治疗是每天20分钟9点网站在伤口区域,通过使用不锈钢揿针0.25毫米直径30毫米的长度(苏州华佗医疗器械有限公司苏州、中国)。老鼠吸入麻醉在热监管条件下维护(37±0.1°C)使用直肠温度计和加热垫(美国马萨诸塞州哈佛装置Inc ., Holliston)。针灸针放置和固定在伤口周围的皮肤(图1)。针准确插入到目标深度1.5毫米,持续5天,每天20分钟后伤口。
2.3。伤口闭合测量
立即创建伤口后,最初的伤口大小是使用卡尺测量的(0,1,3,5,7天之后伤口。伤口区域随时间变化的百分比表示为最初的伤口。同时,伤口面积数字使用数码相机拍摄在红盒子(3×3厘米)(佳能ES350 Ohta-ku,东京,日本)。
2.4。Immunohistofluorescence染色
在post-wound 7天,老鼠被牺牲和皮肤被组织学检查。皮肤组织样本在10%福尔马林固定24小时前在石蜡包埋。切成5块μ米节为了执行苏木精和伊红())和immunohistostaining。部分脱蜡在histoclear(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)并通过分级患者酒精系列。检索(Abcam、剑桥、马后,美国),被封锁的部分与正常山羊血清1 h在室温下。一夜之间,部分被在4°C的环境与以下抗体:小鼠抗细胞核抗原(PCNA);美国微孔,Billerica的),兔多克隆抗体CD-31 (CD-31;Abcam),胶原蛋白I型(Abcam),α光滑的肌肉(αsma Abcam)。洗后,部分在Alexa孵化546 -共轭山羊anti-mouse IgM(分子探针,尤金,俄勒冈州,美国)和Cy2-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白(杰克逊ImmunoResearch)在室温下1 h。洗后,部分和4′,复染色6-diamidino-2-phenylindole (DAPI;Sigma-Aldrich)。使用荧光显微镜荧光图像获得装备现货数码相机(尼康、Chiyoda-ku、东京、日本)和510年蔡司LSM共焦激光扫描显微镜(×200石油目标)(卡尔蔡司,耶拿,琦玉)。
增殖细胞核抗原和PCNA labeled-CD-31来确定,αsma,和我正型胶原细胞,每一个第五冠每节动物准备和计算进行三个随机选择的每部分重叠。测量是在一个预定义的字段(300μm×300μ米)和阳性细胞的数量的伤口面积被乘以三获得。使用Meta-Morph成像程序(美国分子设备公司、唐宁敦、PA),伤口面积确定增殖细胞核抗原,通过计算CD-31,αsma,我正细胞和胶原蛋白类型。
2.5。酶联免疫吸附分析
在2和7天伤口后,伤口样本均质在t-per组织蛋白质提取缓冲(美国皮尔斯,罗克福德,IL)和蛋白酶抑制剂。溶菌产物是通过离心(10000克)在4°C为30分钟,上层清液保持在−70°C。上层清液检查使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血管生成因子和炎性细胞因子的蛋白质含量。浮在表面的进一步分析了量化VEGF的浓度(研发系统,明尼阿波利斯,美国),TNF -α(研发系统)和il - 1β(研发系统)严格按照制造商的协议。
2.6。统计分析
行为测试,脑缺血体积,和细胞计数凋亡细胞对大鼠组织受到单向方差分析与事后分析,独立T以及,或者Mann-WhitneyU测试。提出了数据的平均值±标准差的意思。概率值小于0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。伤口面积
伤口尺寸测量(0,1,3,5,7天post-wounding。伤口关闭在acupuncture-treated指出更快进展组相对于对照组(图2)。post-wounding 7天,伤口大小acupuncture-treated组对照组相比显著降低(31±5和44±5%,)。这些结果表明,针灸可以加速伤口愈合的恢复。
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3.2。炎性细胞因子的表达
我们假设针灸可能保护受伤部位伤口后通过减少炎性细胞因子的生产。我们用ELISA检测蛋白水平的炎性细胞因子在伤口区域2和7天。在2和7天post-wounding,促炎细胞因子il - 1等β和肿瘤坏死因子-α对照组相比显著降低(图3)。这些结果表明,针灸可以促进伤口愈合调节炎性细胞因子。
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3.3。内源性细胞增殖
调查是否针灸治疗改善伤口愈合期间新生成的细胞,增殖细胞的数量取决于anti-PCNA抗体。在伤后7天内,新生成的细胞扩散大大增加针灸治疗组与对照组在伤口面积(图4)。这些结果表明,针灸可能有改善伤口愈合过程中细胞增殖。
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3.4。血管生成
探讨针灸治疗是否促进血管生成,血管生成因子,和新生成的细胞,如内皮细胞VEGF和CD-31分析使用ELISA和免疫染色。VEGF是由各种类型的细胞在伤口愈合过程中,是一种潜在的刺激增殖和迁移在内皮细胞(15- - - - - -17]。VEGF的表达显著增加与对照组相比在伤后7天(16.6±0.7和12.9±2.9 pg /毫克,)(图5 (h))。这表明,针灸可以提高新生成的细胞的血管生成。acupuncture-treated组,PCNA标记CD-31-positive细胞与对照组相比增加伤口面积(172±9.6和118±18.2,)(图5 (g))。这些结果表明,针灸可以有效促进血管生成增加伤口模型中VEGF的表达。
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3.5。表皮再生
我们检查针灸是否能促进细胞外基质重塑的感应PCNA等表型标记免疫染色α在伤口地区sma和胶原蛋白I型。在伤口边缘,血管平滑肌细胞进行了分析使用αsma抗体。的表达αsma是观察到血管平滑肌细胞的皮下组织(数字6(一)和6 (d))。在7天post-wounding acupuncture-treated集团,PCNA标记α-SMA-positive细胞相比显著增加控制(169±33和129±26,)(图6 (g))。同时,PCNA标记我正型胶原细胞相比显著增加控制(93±8和76±14,)(图7)。这些结果表明,针灸可能与刺激伤口愈合机制通过增加细胞外基质蛋白等αsma和胶原蛋白I型。
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4所示。讨论
伤口愈合的目的是促进伤口快速关闭和恢复功能性质。在这项研究中,我们调查了针灸治疗的效果等伤口模型愈合伤口的面积,炎性细胞因子的表达,细胞增殖,血管增生和肉芽组织的形成。
针灸有着悠久的历史作为一个亚洲医疗程序,用于治疗各种疾病,如炎症、复杂区域疼痛综合征和神经系统疾病(18]。以前的研究报道针灸的疗效Ashi-point痛苦,布朗和骨折疾病(12- - - - - -14]。也表明,针灸可能影响伤口愈合过程通过抑制炎性细胞因子,改善增殖细胞,刺激表皮再生。因此,我们表明,针灸治疗伤口的边缘可能改善愈合过程。在这项研究中,我们观察到伤口愈合在1、3、5、7天。acupuncture-treated组表现出更多的降低与对照组相比。
同时,我们分析了促炎细胞因子如TNF -α和il - 1β在伤口愈合的早期阶段使用ELISA。我们表明,TNF的表达α减少acupuncture-treated组相比,控制在2和7天。此外,il - 1的表达β降低与对照组相比。这些结果表明,针灸刺激伤口模型中可能有保护作用的抑制促炎细胞因子,由巨噬细胞分泌(19,20.]。
我们调查了针灸治疗是否能促进新生成的细胞的增殖,增强血管增生和肉芽形成新生成的细胞进行免疫染色的PCNA几个表型标记包括CD-31,αsma,和i型胶原PCNA-positive细胞数在伤口的边缘在7天后伤口模型。针灸治疗组PCNA-positive细胞比对照组显著增加。同时,我们评估血管生成的新生成的细胞增殖细胞核抗原、CD-31-positive通过计算细胞。PCNA-labeled CD-31细胞相比,针灸组增加控制在7天。进一步,我们观察VEGF的表达水平在2和7天后伤口模型。VEGF的表达也比对照组增加7天。血管生成因子的表达增加随着时间的推移,可能与伤口愈合的加速度。
肉芽组织形成和收缩基本步骤在伤口愈合过程中,可以通过观察新生成的分析αsma和i型胶原的表达α观察sma不仅在血管平滑肌细胞的皮下组织,而且在结缔组织myofibroblasts颗粒周围区域。同时,增加胶原蛋白的沉积类型,主要的皮肤中胶原蛋白类型,符合一个更有组织的和更强的修复皮肤21]。此外,胶原蛋白I型指导角质细胞和真皮成纤维细胞迁移起着重要的作用在受伤区域。在针灸治疗组PCNA标记αsma和我正型胶原细胞相比显著增加控制。这些结果表明,针灸可能与伤口愈合效果通过增加细胞外基质蛋白。
总之,我们的研究结果表明,针灸治疗伤口的边缘通过减少炎性细胞因子释放促进伤口愈合,增加新生成的细胞,刺激血管增生和肉芽组织的形成。还需要进一步的研究来确定精确的针灸背后的作用机制。
利益冲突
作者报告没有利益冲突。
作者的贡献
S.I.公园和y y。Sunwoo同样导致这项工作作为共同第一作者。
承认
的研究是2012年由格兰特k001409融合通过教育部研究中心项目,科学和技术。