文摘
我们的使用提供了科学依据Calotropis procera在传统医学治疗皮肤和伤口感染。茎的水提物c . procera表现出更明显的抗菌活性。Calo-protein五年期水提取物的纯化,确认了c . procera和显示广谱活动。Calo-protein抑制的增长金黄色葡萄球菌和大肠aerogenes有效地在25岁μ克/毫升浓度。小鼠局部处理Calo-protein揭示了重要的伤口愈合后14天与梭链孢酸(FA)积极控制。这种蛋白质是缺乏细胞溶解的效果甚至24小时后在皮肤细胞浓度更高。Calo-protein的进一步调查c . procera对细菌的抑制作用可能会提供一个更好的理解的科学依据和理由在传统医学使用。
1。介绍
金黄色葡萄球菌是全世界皮肤和软组织感染的主要原因(1]。金黄色葡萄球菌感染正越来越多地由耐甲氧西林引起的金黄色葡萄球菌(MRSA)具有耐药性β内酰胺抗生素。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是一个主要的问题在医疗设置(2),报道侵入性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的发生率为31.3每100000个人,和20%的感染导致死亡3]。全球范围内,耐甲氧西林手术(高35.9%4)、慢性(740万)(5),和创伤伤口(150万)。伤口愈合是一个复杂的过程,涉及各种炎症,增殖,和装修阶段6]。特别是,慢性伤口是病人的重大关切。因为他们影响大量的病人,可能会降低他们的寿命7]。慢性伤口如小腿溃疡,糖尿病足溃疡,溃疡是常见的急性和社区医疗保健设置(8]。慢性伤口可能被细菌等感染酿脓链球菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(9),铜绿假单胞菌、肠杆菌属aerogenes,和大肠杆菌,而真菌和病毒也可能引起皮肤和伤口感染10]。
许多细菌耐药性由于滥用抗生素的使用,而现有药物也造成了严重的负面影响在人类11]。各种预防和治疗方案的伤口是可用的(8]。然而,药物能够促进伤口的修复过程仍然是有限的。其他因素包括生产合成药物的高成本和使用相关的各种副作用(12]。为了克服这些问题,寻找替代代理从植物中使用传统医学是有道理的。全球范围内,研究识别新的有效的进行,从药用植物无毒愈合剂。植物是重要的潜在来源药物生物医学和制药行业。印度和中国等国资源丰富有价值的药用植物治疗伤口和燃烧13]。大约80%的世界人口仍然依赖传统医学治疗常见疾病(14,15]。药用植物为小说的发展提供巨大的潜力抗菌治疗和辅助治疗(16]。植物的药物作为原型开发更有效和更少的有毒药品。在以前的研究中,一些试图确认当地药用植物的抗菌活性(17,18]。各种药用植物提取物被证明具有抗菌活性金黄色葡萄球菌(18]。
Calotropis procera(Ait)。r . Br。是很出名的,有毒的药用价值。牛奶杂草已经找到有效治疗麻风病、发热、月经过多、疟疾、和蛇咬。之前的调查研究演示了各种生物的活动c . procera如抗炎潜力大鼠(19,20.),其osmotin蛋白质发挥抗真菌活性(21]。c . procera乳胶,老鼠发现有毒,伤口愈合和止痛的效果(22]。化合物在乳胶calotropagenin苷/衍生品(23),强心甾、类黄酮和皂苷(24]。然而,c . procera完全干树皮迄今尚未得到充分的研究。因此,在目前的研究c . procera是评估特征,进一步对抗菌活性和在小鼠模型愈合的潜力。
2。材料和方法
2.1。Ethnomedicinal调查
的干树皮Calotropis procera(Ait)。r . Br。(家庭萝摩科)植物收集在2004年5月,从Thiruthani Tiruvallur区(钦奈附近),印度泰米尔纳德邦,。植物是由分类学者马修的帮助(25]。凭证标本制备和储存在昆虫学研究所、印度。
2.2。准备的提取
茎皮收集,清洗消毒棉布,无菌刀片切成小块,存储在一个无菌的塑料袋。所有的部分都干下阴影在环境温度(31°C)和地面小型粉状颗粒由电动搅拌机(Preethi,钦奈,印度)。使用索氏仪器,shade-dried和植物原料粉(每200克)和1000毫升的己烷提取10 h,使用不同的有机溶剂进行连续提取,如乙酸乙酯、二氯甲烷和甲醇分别提取的最后两次的600毫升无菌蒸馏水(h2O)使用摇晃在65°C水浴3 h。所有收集到的提取使用1号绘画纸滤纸过滤和蒸发旋转蒸发器(Buchi、Labortechnik AG)、瑞士)和冷冻干燥机(冻干)获得原油提取。干粗提取物被储存在4°C抗菌检测(18]。
2.3。在体外抗菌活性
标准的革兰氏阴性细菌培养(大肠杆菌、肠杆菌属aerogenes,变形杆菌寻常的,和变形杆菌)和革兰氏阳性(铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌)菌株获得的微生物学、新加坡国立大学、新加坡。菌株被储存在−70°C,亚文化在20毫升穆勒辛顿(MH)琼脂板(pH值7.4),和孵化隔夜37°C之前使用。抗菌性能测试采用纸片扩散法(26]。五个年轻的殖民地的细菌菌株从各自文化发展在MH琼脂板(英国Oxoids)停牌5毫升无菌生理盐水(0.9%),和悬浮液的密度调整约集落形成单位(CFU)。拭子是用来接种MH琼脂板的表面干裸奔四次琼脂和旋转板的表面大约90°C,以确保接种体的均匀分布。中被允许干大约3分钟前添加一个6毫米直径无菌纸圆盘(美国Beckton Dickson)表面上。每盘了轻轻在琼脂提供一个统一的联系。100年μg / mL的植物提取物(冻干水残留)称重和溶解在1毫升的水,和20μL的提取物(含100μg(残留物)应用在每个盘(3)复制。无菌空白光盘作为一个正常的控制。提取物的抗菌活性的临床分离株决心相比,抗生素(氯霉素30的引用μg /盘),作为一个积极的控制。板块在37°C孵化24 h,抑制区域测量和计算。
2.4。植物化学的筛选提取
植物化学的筛选是使用化学方法提取之前报道的次生代谢物的检测27]。
2.5。提取和分离
最活跃的水提物的干树皮c . procera用于净化的抗菌药物27]。剩余0.5通用完全溶解在5毫升的50 mM Tris-HCl (pH值7.4),在12000转离心后15分钟,和明确的解决方案是由一个膜滤器过滤(0.22μ米)。样品1毫升稀释比例(1:5)4毫升Tris-HCl和注入Superdex g - 75列与高效液相色谱法(HPLC图谱AKTA、丹麦)解决五个分数(P1-P5)。分数在280海里(1毫升)监测和收集。所有的分数都是筛选对细菌,其中一部分(P2)施加较高的抗菌活性。最活跃的一部分(P2)进一步分离,使用C18反相高效液相色谱(RP)列,使四个分数(CF-1-CF-4)。合成分离活动分数(CF-1)显示最大产物对细菌的抑制作用由C8筛选了列,最后收益的一部分纯度测定matrix-assisted激光解吸电离时间飞行/质谱)tif /女士和指定为“Calo-protein。“浓缩蛋白测试(100μ对细菌g / mL)在体外。
2.6。动物
八周大的男性瑞士白化小鼠体重从25 - 30通用,从新加坡国立大学获得Sembawang动物育种中心,新加坡。个人所有动物都被关在笼子里(美国实验室Darzon)与标准的实验室条件下黑/光周期(24±2.0),食物颗粒和水随意用于伤口愈合的实验模型。
2.6.1。小鼠模型的伤口
老鼠被分为三组,每组由三个老鼠(n= 3),分别(IACUC协议号691/04)。背侧皮肤的老鼠被记号笔标记,然后用70%酒精清洁(默克公司、德国)前的表面灭菌无菌手术刀片剃的(28]。动物麻醉(75毫克/公斤medetomidine氯胺酮+ 0.1毫克/公斤)和完整的16毫米厚度(创建和50毫米)切除伤口μL的细菌(集落形成单位/毫升)。组小鼠伤口的感染我只收到了盐水作为控制,第二组小鼠感染伤口处理5毫克/公斤,体重Calo-protein与水混合奶油(ICM制药Pte Ltd .)团体的地方,新加坡)配方是局部应用于背侧的老鼠,第三组感染小鼠应用5毫克/公斤,b。w(梭链孢酸(FA)钠盐(美国圣路易斯σ有限公司)担任抗生素控制。留下的伤口打开没有任何衣服,单独保存在单独的笼子里。伤口面积监测和测量每一天到14天(两周时间)。
2.6.2。测量伤口面积
Calo-protein和标准治疗药物是由局部应用伤口表面上4天。伤口区域跟踪在毫米直径(毫米2)示踪纸(默克有限公司德国)伤口后立即创建和每一天,直到完成了治疗。伤口的百分比减少伤口的大小是按照下列公式计算: 在哪里伤口面积伤口后立即创建作为一个控制(c),是治疗伤口区域的一天t)。
2.6.3。组织学评价
实验结束后14天,伤口被手术进行组织病理学检查。组织被削减,削减下来处理酒精系列脱水中50 - 90%为30分钟,100%乙醇(I / II)和histoclear 100% (I) 60分钟,和100% histoclear一夜之间(II)。脱钙作用是用蜡在不毛之地55°C 1 h每个jar。准备用蜡块,5μ米厚的部分被苏木精和伊红染色())和由奥林巴斯光学显微镜成像(美国宾夕法尼亚州奥林巴斯美国Inc .)。
2.6.4。测量的胶原蛋白
伤口的愈合组织减少,体重(100毫克),和均质1毫升T-PER缓冲区(美国热科学,IL)。匀浆是在10000转离心10分钟在4°C。Calo-protein上层清液收集和胶原蛋白含量,FA-treated,伤口控制老鼠ELISA测定使用鼠标原型我胶原蛋白分析工具包(Chondrex, Inc .,雷蒙德,佤邦,美国)按照生产指令。
2.7。细胞毒性试验
细胞毒性潜在的不同原油中提取的c . procera评估对人类巨噬细胞(u - 937)细胞系XTT试验在2000年,1000年,500年,250年,100年,50岁,25岁和12.5吗μ克/毫升(29日]。在96孔细胞增殖化验microtitre盘子,汇合的细胞(细胞每)是孵化24小时不同的提取和抑制浓度记录。此外,细胞毒性和细胞溶解的纯化蛋白检测对人类皮肤成纤维细胞的影响(HEPK)评估通过测量乳酸脱氢酶(LDH)的释放酶使用细胞毒性检测工具(罗氏曼海姆,德国)在不同浓度(1000 - 0.001μg / mL)。24小时后,200年μL细胞整除的上层清液从每96孔板用于细胞死亡和细胞裂解的量化,基于测量(450海里)。LDH活性受损细胞的胞质释放到上清液。试验进行了一式三份(),细胞增殖和细胞溶解的效果计算百分比。
2.8。统计分析
数据作为平均值±标准偏差(SD),每个浓度测试三个复制(),抑制浓度毫米直径(毫米)。比例减少伤口数据相比,使用单向方差分析(方差分析)其次是Dunnett测试。值和P不到,与对照组相比,被认为是统计学意义。
3所示。结果
3.1。民族植物学的调查和在医疗中的应用
本研究试图提供科学依据这种草药的传统信仰。我们调查的传统医学知识c . procera从当地从业者准备回家治疗常规医疗(数字1(一),1 (b),1 (c),1 (d))。在泰米尔纳德邦,煎煮的干树皮传统上用于治疗皮肤病,而部分的天线c . procera用于治疗发热、疼痛、肌肉痉挛,等等。银河系乳胶湿用干净的布主要应用在受灾地区的伤口,刺伤害和发炎肿胀。植物/姓,提取物的产量,他们的活动。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。在体外抗菌活性
表1显示了在体外有机的抗菌、细胞毒性和植物化学的性质和水提取物的干树皮c . procera作为一种传统的药用植物。测试提取、乙酸乙酯、甲醇、水提取物显示高抗菌活性对细菌进行测试。甲醇和水提取显示相对广谱活动对细菌在100μ克/毫升浓度。水提取物表现出更明显的抗菌活性与最大的抑制区28毫米直径比标准氯霉素抗生素。总的来说,甲醇和水提取的c . procera产生了广泛的活动对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌。然而,正己烷和二氯甲烷提取物表现出较弱的活动对测试细菌,而正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷提取并没有表现出任何效果大肠杆菌和铜绿假单胞菌。
最活跃的水粗提物c . procera被净化superdex g - 75(图2(一个)),使用C18反相高效液相色谱列(图2 (b))。最后的分数被指定为Calo-protein(图2 (c)),其分子量的纯度的孤立Calo-protein由MALDI-TOF /女士(图2 (d))。Calo-protein测试对细菌在范围广泛的浓度(100 - 6.25μg / mL)。纯化Calo-protein显示广谱活性对测试细菌(图2 (c))。然而,Calo-protein抑制的增长金黄色葡萄球菌和大肠aerogenes有效地在25岁μ克/毫升浓度。它显示最大抑制区(30毫米)等于氯霉素(31毫米)。即使在Calo-protein的最低浓度,的发展金黄色葡萄球菌,大肠aerogenes, p .寻常的,p .健神露,和大肠杆菌有效地抑制。铜绿假单胞菌被Calo-protein弱抑制所有的测试浓度。最后的纯化蛋白c . procera干树皮产生最强的抗菌活性金黄色葡萄球菌比原油提取(图3)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.3。植物化学的筛选
植物化学的筛查的干树皮c . procera表示存在的各种次生代谢产物,如生物碱、黄酮类、单宁、香豆素类、蒽醌类、皂甙,心脏苷、甾醇类和teriterpenes。原油中提取的植物相对丰富的苷、生物碱、丹宁酸、甾醇类和萜烯可以抑制微生物的生长。
3.4。细胞毒性的原油提取
原油的正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷提取的c . procera显示人类巨噬细胞毒性(u - 937) 250年和500年μ然而g / mL,甲醇和水提取物毒性较低> 2000μ克/毫升,而低浓度(100 - 12.5μg / mL)是没有细胞毒性作用和形态变化(表1)。然而,不同的毒性观察c . procera原油提取相比,剂量依赖性的方式来控制细胞。
3.5。细胞毒性作用的蛋白质
正常的人类皮肤成纤维细胞(HEPK)细胞暴露于Calo-protein为不同浓度的细胞毒性试验。然而,这种蛋白质不施加任何毒性作用皮肤细胞即使在较高的浓度(1000μg / mL)(图4(a))。此外,Calo-protein没有显示任何细胞溶解的影响测试浓度控制相比,24小时后细胞(图4(b))。的纯化生物活性蛋白c . procera并没有显示出对皮肤细胞的毒性1000吗μ克/毫升。光显微图像的人体皮肤成纤维细胞在不同剂量暴露在Calo-protein (1000 - 0.001μg / mL)。没有变更控制细胞(图4(c))。而低剂量(100μg / mL)的蛋白质并不影响细胞形态(图4(d)),但蛋白质的高剂量(1000μg / mL)显示一些变化对HEPK细胞后24 h(数字4(e)和4(f))。
3.6。Calo-Protein伤口愈合的影响
重大伤口愈合活动记录在老鼠Calo-protein处理后14天相比,控制数据5(一)和5(b))。有一个相当大的减少伤口面积从第四天开始治疗的小鼠相比,老鼠接受梭链孢酸。Calo-protein治疗加速伤口闭合或修复的速度远远快于对照组老鼠。组织病理学检查,有明显的炎性细胞浸润明显下降,大大增加血管形成,由Calo-protein和增殖的细胞。有趣的是,有完整的厚度reepithelialization表皮,组织良好的颗粒层,而控制。动物的伤口处理Calo-protein显示全层的表皮再生完全覆盖了受伤的区域。表皮厚,紊乱特别是与邻近正常皮肤和完整的上皮形成,血管化,毛囊形成观察治疗小鼠(数字5(c),5(d),5(e)5(f))。这种蛋白质产生了积极影响伤口愈合,增强细胞增殖,形成和上皮形成粒状组织,早期真皮和表皮再生。此外,局部应用Calo-protein老鼠明显的胶原蛋白含量比FA-treated老鼠和老鼠(数字控制5(g),5(h)和5(我))。
4所示。讨论
我们的研究结果证实的抗菌特性c . procera用于传统医药治疗皮肤和wound-related紊乱。我们之前报道的抗菌活性30.的某些传统药用植物用于泰米尔纳德邦,印度。其中的水提取物c . procera表现出了最重要的抗菌效果金黄色葡萄球菌和大肠aerogenes。有趣的是,几个伤口引起细菌的生长是由有机和水提取物。5种不同的提取研究,3提取没有表现出任何对抗菌效果大肠杆菌和铜绿假单胞菌在测试浓度。这种负面影响可能是由于不同的气候和土壤次生代谢物的影响因素。另一项研究报道缺乏提取物的抗菌化合物浓度不足(31日]。
有机和水提取物显示对wound-causing细菌抗菌活性。值得注意的是,水提物的c . procera对比较强的效果金黄色葡萄球菌,大肠aerogenes,和p .奇异君子兰。此外,抑制活动c . procera提取与参考的抗生素。此前,据报道,顶端的树枝和乳胶c . procera产生最大的抑制区金黄色葡萄球菌(32]。此外,我们证明了高抗菌效力的c . procera提取对所有测试细菌可能是由于苷和各种蛋白质含量高的水提取物中(23,24]。不同提取物的抗菌活性的差异可能积累在直接相关化合物的多样性c . procera:蛋白质(21),calotropagenin苷(23),强心甾、类黄酮和皂苷(24因此确凿的结果。这些化合物可以绑定的革兰氏阴性细菌在细胞表面形成大量可溶性复杂,随后扰乱细菌和细胞受体之间的相互作用。
此前,Freitas et al。33]研究了酶的活动和蛋白质乳胶的概要文件c . procera。的c . procera蛋白质表现出广谱活性对测试细菌在100 - 6.25μ克/毫升浓度。我们表明,Calo-protein抑制增长金黄色葡萄球菌和e . aerogenes这是相当于氯霉素。即使在最低剂量的蛋白质,的发展金黄色葡萄球菌,大肠aerogenes, p .寻常的,p .健神露,和大肠杆菌被有效抑制。乙酸乙酯和二氯甲烷粗提取的c . procera显示人类巨噬细胞毒性(u - 937)细胞在250年和500年μ克/毫升剂量比甲醇和水提取物。然而,纯蛋白质未能显示出对人类皮肤(HEPK)细胞的毒性剂量高达1000μ克/毫升。Magalhaes et al。34]研究各种有机提取的干细胞c . procera,发现乙酸乙酯和丙酮提取物显示更高的细胞毒性潜在的肿瘤细胞(IC 0.8 - -4.4毫升),但methanolic提取弱细胞毒性。同样,乳汁管蛋白(LPs)获得的乳胶c . procera显示相当大的细胞毒性效应(IC 0.42 - -1.36μSF295和MDA-MB435细胞g / mL)。此外,LP显示抑制DNA合成和目标DNA拓扑异构酶我导致肿瘤细胞凋亡35]。
Calo-Protein伤口愈合的影响
乳胶的c . procera被用于传统医学治疗不同的炎性疾病。乳胶蛋白的抗炎活动已经有据可查的使用不同的炎症模型[36]。伤口愈合事件涉及不同阶段如防止失血,炎症,上皮修复如扩散(7),动员、迁移、分化、组织重构和胶原沉积。急性炎症阶段参与伤口愈合是伴随着细胞外基质的合成,改制的疤痕组织的形成,结缔组织,collagenization,收购伤口强度(37]。我们的鼠标模型显示增强伤口收缩的速度比控制。老鼠接受5毫克/公斤Calo-protein显示良好的结果与其他组相比。伤口的治疗伤口表现出明显干燥利润率与组织再生14天。的治疗潜力c . procera对豚鼠皮肤伤口已经记录(37]。在这项研究中,Calo-protein组成的局部应用加速伤口修复全层覆盖伤口面积的有组织的表皮。伤口愈合的潜力Calo-protein证实了记录的抗炎效果c . procera植物在老鼠19,20.]。Calo-protein导致的伤口收缩比得上FA治疗。此外,它有有利影响炎症和伤口愈合。
组织学检查显示,增加细胞渗透治疗情况下可能是由于增强提取吸引炎症细胞的趋化现象的影响对伤口的网站。增强细胞增殖可能是由于Calo-protein的促有丝分裂的活动可能在很大程度上造成了修复过程。真皮再生治疗的老鼠也暗示蛋白质对细胞增殖产生了积极的影响,颗粒状组织形成和上皮形成。愈合过程的最后阶段包括真皮内胶原沉积和重构(38]。因此,太染色明显支持伤口修复过程Calo-protein-treated老鼠显示更明显胶原蛋白积累比控制。几种类型的次生代谢产物和从植物中活性化合物分离已经记录在动物模型的主动原则影响伤口愈合。乳胶的巨柏之前显示在大鼠伤口愈合效果与呋喃西林,和苷的提取包含高含量、类黄酮、酚类、三萜化合物的抗菌和抗氧化性能28]。在我们的研究中,Calo-protein孤立的水提物c . procera具有愈合属性对细菌感染。之前报道,calactin mudarin, calotropain有效成分c . procera乳胶(39),抗菌和抗氧化性能。
5。结论
的治疗效果c . procera证明了这种蛋白质的愈合活动是有效的抑制细菌病原体。我们得出这样的结论:Calo-protein从c . procera茎皮有潜力发展成为新的治疗代理(s)对细菌感染伤口愈合。
缩写
| Calo-p: | 蛋白质 |
| XTT: | (2,3 -二- (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) 2 h-tetrazolium-5-carboxanilide) |
| 费尔南多-阿隆索: | 梭链孢酸(钠盐) |
| 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌: | 甲氧西林耐药 |
| MH: | 穆勒辛顿琼脂 |
| 菌落: | 集落形成单位 |
| 排名: | 氯霉素 |
| 高效液相色谱法: | 高效液相色谱法 |
| CF: | 分数 |
| : | 伤口控制 |
| : | 伤口治疗 |
| T-PER: | 组织蛋白提取试剂 |
| ELISA: | 酶联immunoabsorbance试验 |
| u - 937: | 人类巨噬细胞 |
| HEPK: | 人类皮肤成纤维细胞 |
| LDH: | 乳酸脱氢酶酶 |
| SBE: | 茎中提取 |
| LP: | 乳胶蛋白。 |
确认
作者感谢学术研究基金(ARF),新加坡国立大学的金融支持(批准号r - 181 000 078 122)。他们也感谢微生物学系,新加坡国立大学提供在本研究中使用的细菌培养。