文摘
本研究评估anti-hyperglycemic分馏的活动苦瓜苦瓜种子中提取。空腹血糖水平进行评估之前和之后政府不同分数的种子中提取。在三个测试分数,分数Mc-3(15毫克/公斤b.wt。)显示的最大anti-hyperglycemic活动和显著降低实验性糖尿病大鼠的血糖水平。活动的葡萄糖代谢的关键调控酶(己糖激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶和glucose-6-phosphate脱氢酶)Mc-3-treated糖尿病动物的测定。每天换一次管理分数Mc-3长期的18天的实验性糖尿病动物没有导致任何肾毒性、肝毒性从微不足道的生化参数的变化明显的肝脏和肾脏功能的说明。进一步分离的分数Mc-3尺寸排阻色谱法导致一小部分,指定的mc - 3.2,拥有anti-hyperglycemic活动。分数mc - 3.2显示的主要蛋白质群~ 11 kDa sds - page。损失anti-hyperglycemic活动的mc - 3.2在蛋白酶治疗表明anti-hyperglycemic原则的蛋白质的性质。总的来说,结果表明苦瓜种子包含一个有效的anti-hyperglycemic蛋白(s)可能会发现应用程序在糖尿病的治疗没有明显的毒性作用。
1。介绍
糖尿病、代谢紊乱,是全球主要的健康问题与预计患病率从1.71亿年的2000上升到3.66亿年的2030 (1]。这种疾病是由于胰岛素分泌不足,引起胰岛素的行动或两者兼而有之。在1型糖尿病可以通过调节胰岛素管理、重复管理每一餐前胰岛素是不可取的。胰岛素治疗,如果不妥善处理,偶尔会导致严重的低血糖,危及生命的情况。持续管理疗法如磺脲类、双胍类,thiazolidinediones,α-葡糖苷酶抑制剂用于治疗2型糖尿病也是导致不良影响(2]。由于这个原因,有一个增加糖尿病患者补充和替代医学的兴趣涉及传统中药材及其产品的使用,和其他膳食补充剂(3]。
苦瓜(Mc),俗称苦瓜,是最常用的植物之一,治疗糖尿病和相关条件的传统医学体系的世界(4- - - - - -6]。从果肉提取物、树叶和植物的Mc已报告对实验性糖尿病动物模型(anti-hyperglycemic活动7- - - - - -10),或引致老鼠11,12]。此外,植物也被报道具有抗肿瘤等治疗活动(13],反人类免疫缺陷病毒(HIV) [14],anti-ulcerogenic [15)和hypotriglyceridemic活动(16]。
虽然许多报道已经提出证明Mc的anti-hyperglycemic活动,系统的研究,以评估长期治疗的效果与分离种子提取物在血糖水平与急性毒性研究尚未进行。
因此,目前的研究主要集中在获得分馏acid-ethanolic提取的Mc种子包含主动原则来确定分数(s)负责治疗。此外,长期治疗的效果与活跃的分数对血糖控制和糖尿病大鼠的肝脏和肾脏功能也进行调查,因为这些研究将帮助评估其肾毒性和肝毒素的影响,如果有的话,长期的治疗和证明是无毒将促进积极的使用比例为糖尿病管理(s)。
2。材料和方法
2.1。植物和动物
苦瓜种子(“天Vishesh”品种)采购从印度农业研究所(IARI),天,新德里17在大量的股票保持一致性提取制备。色谱矩阵Sephacryl s - 100高分辨率(人力资源)是来自法玛西亚,瑞典。所有的化学试剂均为分析纯,从Sigma-Aldrich化工有限公司采购,美国、或Boehringer-Mannhiem,德国,除非另有说明。
随机产生雄性Wistar鼠(12 - 14周)被安置在贾瓦哈拉尔·尼赫鲁大学的小动物设施。提供的动物是老鼠饲料(Hindustan Lever,印度)和水随意。使用动物是动物伦理委员会正式批准的机构JNU,规定的指导方针和制度动物伦理委员会,JNU,新德里,随后在处理动物。
2.2。种子提取制备和分离
提取种子基本上做了如上所述的18)与小修改。提取方法进行了净化都在4°C。去皮质种子提取10体积75% (w / v)的冰冷的酸盐酸乙醇含有0.2 N和1毫米PMSF和孵化过夜(O / N)−20°C到产生粗提取液(Mc-C)。这是然后离心机在20000×g 1 h产生颗粒分数(Mc-0)和上层的分数(Mc-1)。取消speed-vac浓度的乙醇后,集中一部分Mc-1被微分盐沉淀分级使用0.1 - 1 M碳酸铵梯度(pH值7.0)随后在20000×g离心1 h。不溶性和可溶性分数被指定为Mc-2 Mc-3,分别。生物活性的分数是衡量每一步纯化。
2.3。诱导糖尿病大鼠
雄性Wistar鼠是利用四氧嘧啶糖尿病。简单地说,四氧嘧啶在饥饿的动物管理ip 36小时的剂量150毫克/公斤体重(b.wt)。动物被胰岛素政府稳定了三天,每天1 - 2单元为2天。只有那些动物有血糖水平超过300毫克/ 100毫升血液被选作进一步分析。
2.4。生物活性的评价苦瓜种子分数
糖尿病动物被分为实验组每个包含至少5老鼠。剂量的不同分数表达的蛋白质含量。不同的团体治疗与不同的Mc种子分数(15毫克/公斤b.wt)。糖尿病动物生理盐水处理(车辆)被包括在研究消极的控制。一群鱼精蛋白锌胰岛素治疗糖尿病动物(10 b.wt IU /公斤。,南卡罗来纳州。,Boots Pharmaceuticals Ltd., India) served as standard reference control. A group of normal untreated non-diabetic animals was also included in the study. Fasting serum glucose (6 h fasting) was measured in blood drawn from the tail vein during the study period using glucose oxidase-peroxidase method [19)或一个Accu-chek)。
2.5。的剂量和时间Anti-Hyperglycemic动力学效应活跃的一部分
为了确定活动的时间分数能够带来anti-hyperglycemic效应,短期(0 - 4.5 h)研究通过测量血糖水平后指定时间内管理。
短期时间动力学活动分数在糖尿病大鼠决心剂量b.wt 15毫克/公斤。腹腔内接种(i.p)或胰岛素(10 b.wt IU /公斤)。的血糖水平在不同的时间间隔测量。最佳剂量的活跃部分由管理决定动物不同浓度(做毫克/公斤b.wt。)活跃的一部分。血糖水平是政府在3小时后测定。
2.6。的Anti-Hyperglycemic分数的影响m . charantia种子在糖尿病大鼠生化参数
老鼠被分成不同的组(每组五个老鼠):组I-PBS-treated正常非糖尿病控制,集团II-PBS-treated糖尿病老鼠,老鼠III-diabetic对待b.wt 15毫克/公斤。活跃的分数,和组第四糖尿病大鼠鱼精蛋白锌胰岛素治疗(10 IU /公斤b.wt。)。前两组的老鼠每天摄入盐(车辆)。提取和胰岛素在第三和第四选择剂量组,分别每天18天。身体重量的治疗和治疗动物被监控在整个研究期间。老鼠流血牺牲的最后一天之前颈椎脱位的治疗。血清收集并进行生化分析肝从AutoZyme函数标记使用分析工具,印度,Penttila等的方法。20.),肾功能标记、血糖、自动化化学分析仪(250年强生体外化学分析仪)。总胆固醇是根据估计的方法Zlatkis et al。21]。肝切除后立即牺牲被冷冻PBS和均质蔗糖在0.025米和0.02米三乙醇胺缓冲区(TRA-HCl, pH值7.4)。离心后00000×g,上层清液用于不同酶的测定是葡糖激酶(22),丙酮酸激酶(23),乳酸脱氢酶(24),glucose-6-phosphate脱氢酶(25)和苹果酸脱氢酶(26]。肝脏和骨骼肌的糖原含量估计是被Seifter et al。27]。
2.7。凝胶过滤色谱法
丰富分数显示最大生物活性进一步分离通过凝胶过滤色谱使用Sephacryl s - 100在0.2 NH人力资源4HCO3pH值(7.2 - -7.4)。分析了收集到的分数通过sds - page和银染色。分数峰值为mc - 3.1, mc - 3.2,并分析了mc - 3.3 anti-hyperglycemic像之前描述的那样使用实验性糖尿病大鼠的活动。
2.8。葡萄糖耐量试验
最活跃的一部分获得凝胶过滤色谱法评估后为其诱导葡萄糖耐量正常Wistar鼠的能力。2 g / kg的老鼠注射葡萄糖(i.p)。30分钟后测试分数的剂量b.wt 15毫克/公斤。(i.p)。血清葡萄糖水平测定血样收集从尾静脉葡萄糖之前政府(视为0 h)和在不同的时间间隔后血糖管理。
2.9。统计分析
所有的结果统计分析使用单向方差分析或学生的搭配成对的数据以及不同层次的意义。所有的结果都表示为±s.d值小于0.05被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。Anti-Hyperglycemic种子分数的潜力苦瓜
原油酸ethanolic提取离心后引发了分数Mc-0(不溶性分数)和Mc-1。因为分数Mc-0含有不溶性物质,它不是管理的动物。分数Mc-1和分数Mc-2 Mc-3源自Mc-1检测他们anti-hyperglycemic潜在的糖尿病大鼠在实验。明显,在测试分数Mc-1剂量(15毫克/公斤b.wt)能够降低血糖水平(表1)。后确定分数Mc-1拥有anti-hyperglycemic活动,进行进一步的分离,导致了不溶性分数(Mc-2)和上层的分数(Mc-3)。分析这些分数的anti-hyperglycemic活动展示了丰富的分数Mc-3活动。分数Mc-3 15毫克/公斤b.wt的剂量。血清葡萄糖水平减少了大约40%的车辆接受pbs糖尿病控制动物的减少第三天只有25%被等量的分数Mc-1带来。分数Mc-2似乎没有影响糖尿病动物的血糖水平和5个中的7 Mc-2治疗组动物死于第三天(表1)。不同,接受pbs糖尿病动物血清葡萄糖水平保持在动物胰岛素治疗,没有任何进一步的上升。
3.2。剂量和时间分数Mc-3 Anti-Hyperglycemic动力学效应
因为分数Mc-3被发现拥有丰富anti-hyperglycemic活动,这是可取的研究很快分数Mc-3如何发挥anti-hyperglycemic效应后管理。因此,血糖水平Mc-3对待动物以不同的时间后政府在短期内4.5 h。如图1,这些碎片Mc-3能够显著降低血糖水平,三个小时和维护相同的甚至在4.5 h后管理。血糖水平显著降低(~ 45%)治疗糖尿病动物胰岛素在1.5 h,实验期间继续保持较低。
为了评估Mc-3的最佳浓度,能够带来显著减少糖尿病动物的血清葡萄糖水平,动物被注射不同浓度的分数Mc-3(做毫克/公斤b.wt。)和血糖水平确定后3人力资源管理局(前面确定的时间点为可视化效果)。是观察Mc-3显示增加血糖水平降低到15毫克/公斤b.wt。没有进一步降低血糖水平时观察到的动物是接受更高浓度(20毫克/公斤b.wt。)的分数Mc-3(表2)。
3.3。长期分数Mc-3治疗糖尿病动物的影响
为了评估分数Mc-3的长期影响,糖尿病动物保持在分数Mc-3一段18天为了评估如果持续管理活动分数Mc-3有毒性或不良影响肝脏和肾脏功能。正如预期的那样,每天治疗动物的血糖水平与Mc-3治疗前相比初始水平较低(表3)。每日注射一鱼精蛋白锌胰岛素能够保持空腹血糖水平在糖尿病动物,导致一个星期的治疗后血清葡萄糖水平降低。不同,Mc-3来集团接受pbs糖尿病动物显示,血糖水平持续增长。
治疗后,血清肝活动功能指标:血清谷氨酸丙酮转氨酶(血清),血清谷氨酸草酰乙酸的转氨酶(血糖),gamma-glutamyl转肽酶(GGT)和肾功能水平标记(尿素和肌酐)测量。每天注射胰岛素的18天导致血清水平显著降低,血糖和GGT相比接受pbs糖尿病控制。同样,Mc-3-treatment糖尿病动物的一段18天也导致显著降低血清谷氨酸丙酮转氨酶(血清),血清谷氨酸草酰乙酸的转氨酶(血糖),和gamma-glutamyl转肽酶(GGT)相比,接受pbs控制糖尿病动物(表4)。同样,治疗糖尿病动物Mc-3也导致(~ 20%),减少血清胆固醇水平。来控制糖尿病还显示降低总胆固醇水平。尿素和肌酐水平无显著变化,表明肾脏功能,在胰岛素以及Mc-3-treated糖尿病动物(表4)接受pbs相比,糖尿病控制的动物。糖尿病动物的死亡率也显著降低了政府不同的分数m . charantia种子提取物。Mc-3治疗动物的生存在研究期间100%三个星期正常行为,而未经处理的控制糖尿病动物是昏昏欲睡,星期,显示只有60%存活年底前三周时间。
3.4。分数Mc-3对组织的影响糖原和葡萄糖代谢的酶
为了确定如果Mc-3治疗血清葡萄糖水平的降低是由于葡萄糖利用率增加,肝脏和肌肉糖原水平测定。显著减少观察肝脏和肌肉糖原水平与正常对照组相比,糖尿病的动物。Mc-3治疗导致增加~ 63% ~ 80%在肝脏和肌肉糖原含量相比,接受pbs糖尿病动物(图2(一个))。肝脏和肌肉糖原水平也发现几乎正常水平升高与胰岛素治疗糖尿病的动物。
(一)
(b)
Mc-3治疗效果的关键酶的葡萄糖利用率在对待动物的肝脏也被评估。理解可能的作用机理,糖尿病动物管理与分数Mc-3或同样体积的生理盐水和维护各自的治疗3天。在第四天,动物被注射了3小时后测试样品和牺牲注入。活动的各种调控酶在肝脏的估计控制(生理盐水治疗)和Mc-3-treated糖尿病动物(图2 (b))。
控制糖尿病动物表现出减少水平的酶与正常对照组相比。是观察到的分数Mc-3导致显著增加(~ 2折)在丙酮酸激酶(PK)和glucose-6-phosphate脱氢酶(G6PDH)活动,而只有~ 1.3 ~ 1.6折的特定活动增加己糖激酶(香港)和苹果酸脱氢酶(我)指出。然而,没有明显的乳酸脱氢酶(LDH)活性的变化。胰岛素治疗也导致增加活动的所有酶和恢复水平观察正常非糖尿病的动物。
3.5。凝胶过滤色谱Mc-3的零头
早些时候有报道表明,Mc水果/种子含有多肽,能够降低血糖水平(28,29日]。活动在热处理和蛋白酶K治疗分数Mc-3证实原则(s)的蛋白质的性质(数据没有显示)。自从anti-hyperglycemic活动出现在Mc-3被发现的蛋白质的性质,进行了sds - page分析分数Mc-3一起与其他父母分数。分数Mc-3似乎相当纯粹,主要是蛋白质组成的乐队从8到14 kDa commassie彩色sds - page(图3(一个)),和银染色显示相同的分数Mc-3包含许多其他蛋白质乐队(图3 (b))。同时,乐队出现作为一个厚带(8 - 14 kDa)显示存在多个蛋白质乐队当在Tris-Tricine肽凝胶缓冲区分析。因此,凝胶过滤色谱法进行进一步分离蛋白质和确定哪些拥有anti-hyperglycemic活动。色谱图显示不同蛋白的洗脱图如图4(一)。肽凝胶不同分数峰值sds - page分析使用Tris-Tricine缓冲系统显示大量纯化的蛋白质相互凝胶过滤色谱法(图后实现4 (b))。
(一)
(b)
(一)
(b)
3.6。分数mc - 3.2的分数Mc-3具有降糖活性
为了确定哪些主要的分数由峰值anti-hyperglycemic活动,这些分数是透析和测试anti-hyperglycemic糖尿病动物的潜力。分数对应不同的山峰被指定为分数mc - 3.1(31 - 32)分数,mc - 3.2(分数35 - 40),mc - 3.3(分数43-46),mc - 3.4(分数47-49)和mc - 3.5(分数50-53)。无法评估分数mc - 3.1 anti-hyperglycemic活动由于少量。剩余的分数,只有一部分mc - 3.2导致血糖水平显著降低(~ 40%)(图5(一个))。其他峰值分数没有带来任何显著减少血糖水平(数据没有显示)。蛋白酶处理的分数mc - 3.2导致的损失anti-hyperglycemic活动,与分数Mc-3确认前面的结果,这是anti-hyperglycemic原则(s)中m . charantia种子蛋白质的性质。sds - page分析活动最高分数的mc - 3.2表明这种由占主导地位的蛋白(s) ~ 10 - 12 kDa的非还sds - page(图5 (b))。
(一)
(b)
检查的能力分数mc - 3.2保持normoglycemia在正常动物,葡萄糖耐量试验。mc - 3.2管理导致更快的间隙正常大鼠的血糖水平相比,接受pbs控制,不会引起低血糖(图6)。在这个剂量,所有动物都有意识的与正常行为和身体活动。因此,结果表明,在15毫克/公斤b.wt mc - 3.2。不是有毒的动物,导致更快和稠度清除葡萄糖负荷后血糖不会引起低血糖。
4所示。讨论
可以控制高血糖与糖尿病饮食管理、运动、口服降糖药物和胰岛素治疗。胰岛素治疗和口服降糖药物有自己的副作用和适应问题。出现的继发性糖尿病并发症与时光的流逝实际上是发病率和死亡率的主要原因。因此,开发治疗糖尿病的新方法,可以降低血糖水平以更好的适应是可取的。
植物的评价,尤其是他们的积极原则是一个逻辑的方式寻找新的药物来治疗这种疾病。然而,不良的存在高血糖的物质随着血糖过低的组件薯蓣属dumetorum提取报道(30.]。因此,酒店寻找新的治疗来源于植物治疗糖尿病将取决于适当的处理植物提取物为了获得预期的效果。详细的毒理学研究无论是在原油植物提取物以及纯化物质也是必要的。
苦瓜已经使用很长一段时间以来医学在本地系统。一些报告已经提出建议的不同部分植物具有降糖活性。这些已经发现有效的化学(四氧嘧啶和STZ)诱发实验性糖尿病大鼠(7- - - - - -10]。
许多小分子量蛋白质、多肽与低血糖和/或anti-hyperglycemic活动被隔绝苦瓜(31日- - - - - -33]。其他肽和蛋白质分子分离m . charantia已报告称为Charantin和p-insulin降低空腹血糖(~ 25 - 40%)在实验性糖尿病动物(28,34]。在目前的研究中,从acid-ethanol获得分数Mc-3提取的m . charantia导致种子~ 3 h内血糖水平减少40%的治疗可以降低出现在1 h的治疗。anti-hyperglycemic效应带来的Mc-3分数m . charantia种子相媲美,观察胰岛素治疗的糖尿病动物。我们的观察来的动物是在协议与先前的报告,在大幅降低空腹血清葡萄糖水平观察在两小时内鱼精蛋白锌胰岛素35]。像早期的研究,长期治疗糖尿病动物与鱼精蛋白锌胰岛素能够维持血糖水平(36,37]。
Mc-3 anti-hyperglycemic活动的分数更低剂量(15毫克/公斤b.wt)明显高于观察acid-ethanol提取(分数Mc-1)或其他分数Mc-2来自Mc-1。看来,分数Mc-2由一些有毒物质,造成皮肤损伤和坏死在注射部位出现的。在一段时间内每天18天治疗,分数Mc-3-treated糖尿病大鼠的血糖水平显著降低,一个理想的标准治疗任何潜在的代理。同样,没有观察到在治疗动物血糖过低的情况。分数Mc-3是有效的浓度要低得多(15毫克/公斤b.wt)相比,原油ethanolic提取的其他植物被发现是有效的范围100 - 500毫克/公斤b.wt。在糖尿病大鼠(38- - - - - -40]。因此,分数Mc-3可以作为一种有效的抗糖尿病代理规范化血糖维护功能,不会引起低血糖。
高血糖的情况将部分或全部缺乏胰岛素的产生由于葡萄糖代谢的干扰引起的减少在几个糖酵解的关键酶,即葡糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶,从而,导致受损的外围葡萄糖利用率,增强肝葡萄糖生产(41]。另外,慢性糖尿病导致肝脏重量减少由于增强分解肝糖分解等过程,脂解作用,蛋白水解作用[42]。组织糖原水平,增加葡萄糖的主要细胞内储存形式在治疗部分Mc-3可以直接与其anti-hyperglycemic活动相关联。这可能是由于刺激糖原合成和抑制糖原磷酸化酶(43,44]。类似的结果,增加肝糖原也被报道美国cordatum提取,能够降低血糖水平(45]。同时,增加葡萄糖的利用酶提高外围葡萄糖利用率和可能导致分数Mc-3 anti-hyperglycemic效应。
感兴趣的注意,治疗糖尿病动物Mc-3导致减少血清肝功能的标志酶,即血清血糖、GGT。增加肝脏功能的血清标记酶通常发生由于坏死肝条件引起的慢性糖尿病(46,47]。进一步,两个转氨酶、血清和血糖,属于糖质新生途径及其在糖尿病增加血清中浓度条件进一步增加血清葡萄糖水平将noncarbohydrate来源血液中的葡萄糖。从而减少这些标记酶的水平Mc-3治疗表明,分数Mc-3能够缓解alloxan-induced糖尿病造成的肝损伤。也没有明显的尿素和肌酐的变化表明,持续Mc-3治疗不影响肾脏功能。
早些时候报道的抗糖尿病潜力m . charantia采用提取整个水果,果肉,和树叶的实验性糖尿病动物血糖,老鼠(7- - - - - -12]。目前的研究报道大量纯化的蛋白质的anti-hyperglycemic分离ethanolic提取物(s)的原则m . charantia种子。anti-hyperglycemic原则(s)是高度有效的降低血糖水平normoglycemia附近,以低得多的浓度不会造成任何不利影响对肝脏和肾脏功能的对待动物。研究正在进行中,进一步净化,描述活性蛋白质的原理在mc - 3.2的一部分m . charantia,这将有助于理解anti-hyperglycemic效应带来的分子机制。
缩写
| 主持人: | |
| b.wt。 | 体重 |
| G-6-PDH: | Glucose-6-phosphate脱氢酶 |
| 香港: | 己糖激酶 |
| PK: | 丙酮酸激酶 |
| LDH: | 乳酸脱氢酶 |
| GTT: | 葡萄糖耐量试验。 |
确认
美国生物技术、科学技术部,新德里,是承认提供财政支持。印度医学研究理事会和大学拨款委员会承认提供研究奖学金g . Chhabra和a . Vashishta分别。科学与工业研究理事会被公认为研究提供奖学金d·夏尔马和美国Ohri。Samaresh辛格先生和Amaresh Kumar辛格承认技术援助。