有益的紫草素对实验性结肠炎引起的葡聚糖硫酸酯钠在Balb / C小鼠

文摘

萘醌的紫草素,一个主要组成部分的根源紫草erythrorhizon,现在是研究作为抗炎剂治疗溃疡性结肠炎(UC)。加州大学在Balb / C小鼠诱导急性口服5%的葡聚糖硫酸钠(DSS)。疾病活动指数评估,进行了组织学研究。口头管理紫草素减轻UC诱导剂量依赖性的方式,防止colorectum的缩短和减少体重5%,改善粪便的外观和预防血便。疾病活动指数分数低得多比colitic shikonin-treated小鼠组,以及髓过氧物酶的活动。的表达cyclooxygenase-2降低了75%,激活NF -κpSTAT-3的B降低了44%,47%,以及肿瘤坏死因子-α,il - 1β,il - 6生产。类似的结果在初级巨噬细胞文化。这是第一次报告的紫草素的能力减弱所致急性UC DSS。紫草素行为通过阻断激活的两个主要目标:NF -κB和STAT-3,从而构成了一个有前途的潜在治疗炎症性肠病的管理代理。

1。介绍

溃疡性结肠炎是一种慢性肠道疾病的反复发作缓解和复发1]。通常直肠粘膜的炎症扩散和可变长度的结肠疾病的特点。欧洲克罗恩氏和结肠炎组织(ECCO)区分三种类型根据疾病的加州大学为一个地理分布:直肠炎(只影响直肠),左或远端结肠炎,和广泛的结肠炎结肠脾曲旁边的(部分也涉及)(2]。UC患者通常报告症状如腹泻、直肠出血,和疲劳,严重影响日常运作(3]。UC各国不同的发病率(每100000人0.5到24.5),增加与先前报道在一些国家发病率较低,如在东欧和亚洲4]。尽管这种疾病的确切发病机制了解甚少,感染、环境因素,复杂的遗传疾病,免疫反应的放松管制已经被提议作为疾病的主要原因(5- - - - - -7]。加州大学的存在似乎增加extraintestinal疾病的风险(例如,虹膜炎、葡萄膜炎、原发性硬化性胆管炎,或强直性脊柱炎)(8),其他慢性炎性疾病(如关节炎、哮喘、或多发性硬化症)(9),或结直肠癌10]。

细胞因子是肠道免疫系统的关键信号和已知参与所谓的正常状态的中断控制炎症(生理的肠道炎症)。在炎症性肠病,先天免疫反应起着至关重要的作用。激活树突状细胞和巨噬细胞分泌一些细胞因子,积极调节炎症反应在加州大学(11]。不同的研究报道,促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子(TNF)α白介素(IL) 1β,il - 6 UC患者结肠黏膜的增加(12]。肿瘤坏死因子-α表达在人类巨噬细胞被描述在结肠组织和克罗恩氏病和溃疡性结肠炎患者巨噬细胞。此外,血清TNF水平α与肠道疾病的临床和实验室指标的活动。il - 1β是一个主要由刺激巨噬细胞和单核细胞产生促炎细胞因子及其增强生产已经检测到mRNA和蛋白水平在病人和DSS-induced结肠炎模型。此外,增加作品的诱导一氧化氮合酶和cyclooxygenase-2也被发现在炎症性肠病,以及在肠道炎症模型13]。转录因子NF -κB是一个主要的管理组件在炎症性肠病的复杂的场景。很明显的表达和激活NF -κB是强烈诱导的发炎的肠道炎症性肠病病人。NF -κB不仅表达了但也处于激活状态在粘膜巨噬细胞和上皮细胞在炎症性肠病病人。激活NF -的数量κB与肠道炎症的严重程度有关。增加了NF -κB在巨噬细胞表达伴随着产能的增加这些细胞产生和分泌TNF -α,il - 1β,il - 6,但主要NF -κB-induced细胞因子负责进一步的刺激,激活和分化固有层免疫细胞,导致粘膜炎症的延续14]。事实上,许多免疫抑制药物目前用于炎症性肠病的治疗,如糖皮质激素、柳氮磺胺吡啶,甲氨蝶呤,anti-TNF -α已知抗体,调解他们的抗炎作用,至少部分是通过抑制转录因子。

治疗炎症性肠病的目的是消除炎症,为了缓解症状和粘膜愈合。Aminosalicylates保持患者积极治疗的基石,轻度到中度溃疡性结肠炎。然而,它的作用在克罗恩病更有争议。糖皮质激素仍受欢迎的药物诱导缓解溃疡性结肠炎和克罗恩病。然而,他们不能有效维持缓解期,他们的重大不利影响限制他们长期使用。当炎症性肠病病人不响应一线治疗,免疫抑制疗法与硫唑嘌呤和6 -巯基嘌呤经常使用。然而,只有40%的患者用药后停留在缓解期一年。因此,需要额外的安全有效的治疗方法对这些病人(15]。

尽管取得了进步,anti-TNF患者治疗和其他药物,大量的病人仍然需要手术。

由于缺乏安全性和有效性的标准疗法,补充疗法的使用天然产品和饮食等组件正迅速成为一个有吸引力的方法治疗炎症性肠病。一些植物成分已报告是有用的在炎症性肠病的管理和其他慢性炎症过程16]。在这些多酚类物质,如芦丁(15],thearubigin [17),或姜黄素18,19和其他多酚表现出肠道抗炎活动20.]。这些天然的活性分子可以与广泛的炎性相关参数,包括形态学参数、髓过氧物酶活动,谷胱甘肽水平,细胞因子(TNF -生产α,il - 1β和il - 6)、p38-MAPK和NF -κB激活。

中药继续为全球数以百万计的人提供了一线药物治疗。的根源就是一个例子紫草erythrorhizon摘要。调查。(紫草科)应用于治疗黄斑喷发,麻疹、咽喉肿痛、痈、烧伤(21]。这种植物是紫草素的主要组件(图1),一个自然的萘醌衍生物。这种化合物被报道具有不同的药用价值,如抗菌、伤口愈合,抗炎,抗血栓和抗肿瘤效果22]。在之前的工作中,我们组的二氯甲烷提取证明l . erythrorhizon抑制急性的耳朵和爪子水肿通过局部应用TPA诱导的小鼠和足底皮下注射角叉菜胶,分别为(23]。我们还证明了主要化合物存在于提取、紫草素,减少12 -O-tetradecanoylphorbol 13-acetate-induced急性耳炎症在活的有机体内通过抑制NF -κB易位细胞核以及通过干扰我κBα退化。这两种效应也被观察到在体外在小鼠腹腔巨噬细胞原始264.7线24]。在目前的研究中,我们调查了紫草素对临床症状变化的影响和表达各种DSS-induced结肠炎小鼠促炎介质。这个实验模型被广泛用于研究潜在的炎症性肠病的致病机制以及评估新的肠道抗炎药。因为这就像人类UC小鼠模型,它允许我们评估是否紫草素可以作为一种新的治疗病人患有这种疾病的治疗工具。

2。材料和方法

2.1。化学物质

紫草素从TCI购买欧洲(Zwijndrecht,安特卫普,比利时)。所有化学和生化试剂购自丙烯酰胺Chemika-Biochemika(书、瑞士),贝克(代芬特尔、荷兰),Panreac(西班牙巴塞罗那),和Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。

2.2。动物

雌性Balb / C小鼠称重18 - 20 g(哈伦Interfauna Iberica,巴塞罗那,西班牙)被用于在活的有机体内实验。所有动物都吃普通食物的同类随意和住在12 h光/暗周期22°C,湿度60%。住房条件和所有在活的有机体内试验机构伦理委员会批准的大学的瓦伦西亚,西班牙,据2005年10月的规范性(RD1201/2005)。

2.3。用紫草素诱导的急性溃疡性结肠炎和治疗

急性结肠炎被口服5% DSS诱导(分子量36-50 kD;美国议员生物医学LLC,梭伦,哦)(w / v)新鲜的自来水随意七天(6 - 10老鼠每组)。其他三组动物饮用水中也获得了5% DSS与紫草素口服治疗期间两次实验(1天5天)不同剂量(6.25、12.5和25毫克公斤⁻¹)。紫草素溶解在水:乙醇:二层80(10:1:1)和口服药物的援助填喂法。组只有新鲜的自来水(图五分之一10)。用水量控制所有组,未发现重大差异。疾病活动指数决定根据参数表中列出1(25]。实验终止的八天,老鼠被颈椎脱位,和结肠组织解剖进行进一步分析。这个协议进行了三次独立实验。

2.4。组织学

小(约1厘米)的部分切除结肠组织固定在10%多聚甲醛在磷酸盐(PBS, pH值7.4)和嵌入石蜡。部分(4μ米)是削减和苏木精和伊红染色。组织学评估结肠粘膜进行盲评的病理学家如前面描述的那样(表2)[26]。

2.5。免疫荧光染色

的冻结部分远端结肠在刚做好的4%多聚甲醛固定在PBS缓冲(pH值7.2)和免疫荧光染色检测淋巴细胞和巨噬细胞浸润用异硫氰酸荧光素(FITC)——共轭鼠anti-mouse CD4 +单克隆抗体(Miltenyi研究,格拉德巴赫,德国)或allophycocyanin——(APC)共轭鼠anti-mouse CD11b +单克隆抗体(Miltenyi研究),分别。部分的安装与Fluoroshield安装介质4′,6′-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Sigma-Aldrich)。CD4 +和CD11b +阳性区域的数字测量五个随机选择的视觉领域200×放大。

2.6。髓过氧化物酶活性测定

结肠癌样本中,远端结肠清洗了寒冷的PBS,涂抹干燥,并立即与液态氮冷冻。样本储存在−80°C到使用。髓过氧化物酶活动的决心,样本在臼磨成粉末。髓过氧化物酶活性被确定为被铃木等。27]。短暂,约40毫克的组织在80毫米重量为每个样本和均质磷酸二氢钾、磷酸氢二钠缓冲(pH值5.4)含0.5% hexadecyltrimethylammonium溴离子。离心后,100μL (PBS, 85年μL(磷酸二氢钾、磷酸氢二钠缓冲22毫米,和15μL 0.017%过氧化氢被添加到30μ上层清液的L。酶促反应开始当添加20μL tetramethylbenzidine盐酸盐。3分钟后37°C反应停止。吸光度是阅读在630海里。髓过氧化物酶活动表示为所需的酶将1μ过氧化氢的摩尔水1分钟,表示每克组织湿重。

2.7。从结肠制备胞质及核分数

从肠道中提取的蛋白质进行如前所述的杉本et al。18]。总之,组织是均质与Polytron pt - 2000 1分钟(Kinematica AG)、苜蓿、瑞士)组织均质器在1.5毫升的冰冷的缓冲区(4 - 10毫米(2-hydroxyethyl) 1-piperazineethane磺酸(玫瑰)pH值7.9,10毫米氯化钾,1.5毫米MgCl₂0.1毫米、0.5毫米二硫苏糖醇、乙二胺四乙酸(EDTA), 0.5毫米phenylmethyl磺酰氟,1μ克毫升⁻¹抑肽酶,1μ克毫升⁻¹亮抑酶肽,μ克毫升⁻¹抑肽素A)。Igepal ca - 630添加到最终的浓度为0.5%。匀浆被冷冻在冰温柔颤抖了45分钟。通过离心膜分数是沉淀在106 g×10分钟4°C。包含胞质分数的上层清液储存在−80°C到使用。500年的颗粒是resuspended涡μL缓冲B(20毫米消息灵通的pH值7.8,400毫米氯化钠,1.5毫米MgCl₂0.5毫米、0.2毫米EDTA、25%甘油,phenylmethylsulphonyl氟化物,0.5毫米二硫苏糖醇,1μ克毫升⁻¹抑肽酶,1μ克毫升⁻¹亮抑酶肽,1μ克毫升⁻¹抑肽素)和冷却30分钟在冰与温和的颤抖。在20800×g离心后15分钟在4°C,包含核分数的上层清液被储存在−80°C,直到使用。细胞溶解产物(30μ克的蛋白质)在硫酸钠docecyl样品缓冲煮5分钟前进行电泳。

2.8。免疫印迹分析Cyclooxygenase-2, NF -κB p65,磷酸化信号传感器和激活转录(pSTAT) 3

提取后,上层清液中蛋白质的存在是由布拉德福德的方法以牛血清白蛋白为标准。等量的蛋白质(30μg)然后加载到10%钠十二烷基硫酸聚丙烯酰胺凝胶电泳和转移到聚乙二烯二氟化物膜90分钟的125毫安。包含3%的膜被封锁在PBS-Tween 20 w / v脱脂牛奶。cyclooxygenase-2,膜与anticyclooxygenase-2孵化多克隆抗体(1:1000),从开曼群岛(美国安阿伯市MI)。对于p65,膜与anti-p65孵化多克隆抗体(1:500稀释,sc - 7151);对于pSTAT-3,膜与anti-pSTAT-3孵化(sc - 8019, 1: 500稀释);和聚(ADP-ribose)聚合酶(PARP),膜被孵化与anti-PARP多克隆抗体(sc - 1562, 1: 400稀释),他们购买的圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国)。最后,对于β肌动蛋白,膜与反孵化β肌动蛋白多克隆抗体(1:10000稀释),从Sigma-Aldrich获得。屁股都洗和孵化peroxidase-conjugate anti-rabbit, anti-mouse或抗体免疫球蛋白G(1: 12000稀释;开曼群岛)。免疫反应性的乐队是可视化的帮助下一个增强chemilumeniscence系统(美国密理博公司,Billerica的)。

2.9。结肠器官细胞的文化

后在活的有机体内协议、三小鼠的结肠被纵向剖开,洗在PBS,正如前面所描述的Siegmund et al。28]。结肠然后进一步切成1厘米的段,培养完整的罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI) -1640中补充10%胎牛血清,青霉素(100 U mL⁻¹),链霉素(100 U mL⁻¹24-well板)。24小时后,上层的收集和储存在−80°C,直到使用和各肠段重。

2.10。小鼠腹腔巨噬细胞隔离

Balb / C小鼠从一个单独的组实验给出了1.5毫升腹腔内注射3%的巯乙酸在水里。四天后,老鼠收集腹膜巨噬细胞通过与PBS腹膜灌洗,颗粒状,洗在PBS。细胞被镀的密度1×10⁶细胞毫升⁻¹与杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM)补充10%胎牛血清,青霉素(100 U mL⁻¹),链霉素(100 U mL⁻¹)。细胞有2 h坚持,媒介是改变,贴壁细胞用于细胞因子和亚硝酸盐化验。

2.11。RNA提取和逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),

小鼠腹腔巨噬细胞(10⁶细胞每口井)使用紫草素1 h,然后用脂多糖刺激(1μ克毫升⁻¹对3 h)。收集细胞,和总RNA提取的帮助下RNeasy迷你旋转(50)列(试剂盒、希尔登,德国),按照制造商的指示。提取RNA的浓度计算通过测量光密度在260海里。光密度的比值在260海里,在280 nm总是高于1.8。整除的μ克RNA被转换为第一链互补脱氧核糖核酸(互补)AffinityScript多个温度逆转录酶(美国安捷伦科技,圣克拉拉,CA)。然后,1μL的cDNA混合0.75μM引物il - 6的表达载体,兰利(意义:5′-ATGCTGGTGACAACCACGGCC-3′;反义:5′-GGCATAACGCACTAGGTTTGCCGA-3′), il - 1β(意义:5′-GCTGGAGAGTGTGGATCCCAAGCA-3′;反义:5′-AGCGACCTGTCTTGGCCGAGG-3′), TNF -α(意义:5′-AGCCCACGTCGTAGCAAACCAC-3′;反义:5′-TAGACCTGCCCGGACTCCGC-3′)。β肌动蛋白引物从研发购买系统(明尼阿波利斯,美国)。thermocycler条件94°C, 1分钟的退火温度55°C 1分钟和72°C的伸长温度为1分钟前30周期,紧随其后的是72°C的伸长温度10分钟。反应完成后,放大产品被撤管和1%琼脂糖凝胶上运行。

2.12。细胞因子的测定

各种细胞因子的浓度在文化上层的冒号和小鼠腹腔巨噬细胞测定使用酶联免疫吸附试验设备(美国eBioscience,圣地亚哥,CA)根据制造商的指示。

2.13。由格里斯测定亚硝酸盐的决心

一氧化氮水平评估亚硝酸盐量化描述的其他地方(29日]。简单地说,100年μL的小鼠腹腔巨噬细胞培养基是孵化15分钟与格里斯试剂(Sigma-Aldrich)。吸光度是阅读在540海里。

2.14。软件

图片为所有免疫印迹和PCR实验获得的图像分析系统las - 3000迷你(富士胶片、东京、日本)。数字图像处理和乐队密度测量是用多的援助计V3.0软件包(富士)。

2.15。统计分析

统计分析是由单向方差分析的手段和Dunnett(方差分析)t以及。结果提出了均值±SEM GraphPad Prism 4.0软件(GraphPad软件公司,圣地亚哥、钙、美国)是用于所有计算。

3所示。结果与讨论

3.1。紫草素治疗对临床症状的影响

我们评估了紫草素的系统性影响使用急性DSS-induced UC模型。七天老鼠收到新鲜的自来水或5% DSS溶解在新鲜的自来水。其他三组接受5% DSS和管理紫草素(6.25,12.5,或25毫克公斤⁻¹)口头在实验的开始和五天(每组6 - 10)。

DSS-induced小鼠UC模型在这项研究中的应用是一个完善的通用原型的肠道组织损伤的准确与组织损伤的组织学方面观察到病人患有炎症性肠病(30.]。在这个实验协议急性结肠炎、紫草素被发现后发挥抗炎效果只有两届政府(图2以剂量依赖性的方式)。在colorectum长度的情况下,colitic老鼠遭受noncolitic老鼠相比,缩短了43%。紫草素显著预防这种缩短只有30%的剂量12.5毫克公斤⁻¹(cm和厘米noncolitic老鼠,)和11%的剂量25毫克公斤⁻¹(毫米和厘米noncolitic老鼠,)。此外,shikonin-treated老鼠体重的改善,减轻粪便和血腥的凳子上。疾病活动指数得分,肠道炎症的严重程度的指标colitic组。紫草素治疗导致疾病活动指数明显降低,紫草素治疗组12.5毫克公斤⁻¹和紫草素治疗组25毫克公斤⁻¹(图3)。紫草素从而改善所有DSS-induced炎症小鼠的症状()。

因为最好的宏观结果25毫克公斤的剂量⁻¹紫草素,我们继续其余的从这组获得的实验样品。

组织学分析显示,紫草素25毫克公斤⁻¹治疗改善结肠架构与colitic老鼠相比;治疗组分配的组织损伤评分与colitic集团()。Colitic小鼠表现出显著的畸变、水土流失的固有层粘膜炎症细胞浸润,粘膜细胞的消失(图4 (b))。其实用紫草素治疗恢复受损的结肠,显示一个温和的炎性浸润(箭头所指)。恢复地下室建筑与杯状细胞粘蛋白的补充也观察到(星)(图4 (c))。

通过免疫荧光,我们观察到大量的淋巴细胞和巨噬细胞在结肠样本colitic老鼠,主要位于粘膜。紫草素治疗阻止这个渗透(图5)。

与这些组织学和免疫荧光结果一致,我们可以观察到在图4 (e)增加colitic结肠髓过氧物酶活动的动物。口服25毫克公斤⁻¹紫草素能够显著减少的38% ()的增加。

综上所述,我们的研究结果表明,紫草素可以显著减少炎性细胞浸润colitic小鼠的结肠。

3.2。紫草素限制结肠炎性细胞因子的表达

循环白细胞招募到结肠导致炎性介质的释放,包括促炎细胞因子il - 1等β、白介素、干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α(31日)和促炎合成酶等诱导一氧化氮合酶和cyclooxygenase-232,33]。紫草素是否限制了促炎细胞因子的生产,因此保护结肠粘膜,我们测量了水平的il - 6、TNF -α干扰素-γ,il - 1β5%的上层清液中培养冒号DSS-exposed老鼠控制饮食或25毫克公斤⁻¹紫草素。如图6所示,用紫草素治疗可以显著减少这些促炎细胞因子在约50%的水平决定在整个结肠。自从DSS-induced UC小鼠远端结肠似乎更严重,我们测量结肠细胞因子在每个区域的生产和分析单位面积紫草素的影响。如这个图所示,DSS显著增加了生产的促炎细胞因子在中期和远端结肠。紫草素会减少细胞因子的生产在这两方面进行了分析。中期结肠癌、紫草素治疗结果减少了61%的il - 6、TNF -减少29%α干扰素-减少75%γ,51%减少il - 1β这些禁忌,虽然只有干扰素-统计学意义γ和il - 1β。远端结肠,结肠中期的情况下,所有测量细胞因子的生产减少,被抑制的il - 6(52%)和干扰素-γ(74%)具有统计学意义。

这些数据表明,紫草素可能减少DSS的破坏性影响通过抑制促炎细胞因子的表达。这些结果同意戴et al。(2009) (32),利用胶原诱导关节炎模型表明,紫草素的抗关节炎的活动通过抑制Th1细胞因子发生。

3.3。紫草素对一氧化氮的影响生产、细胞因子的生产,并在小鼠腹腔巨噬细胞基因表达

来帮助解释疾病的改善在诅咒中观察到colitic老鼠用紫草素治疗,我们的研究在体外萘醌的影响在生产的一氧化氮和促炎细胞因子lipopolysaccharide-stimulated从雌性Balb / C小鼠腹腔巨噬细胞。如图7(一)紫草素0.5μM大幅抵消一氧化氮(85%)的生产。

此外,释放il - 6(62%)和il - 1β0.5(84%)也显著降低μM, 1μM紫草素显著抑制肿瘤坏死因子的释放α(46%)(数据7 (b)- - - - - -7 (d))。

提供进一步洞察潜在的抗炎机制活动证明了紫草素,信使rna表达水平在腹膜巨噬细胞的促炎细胞因子通过rt - pcr检测。如图8mRNA水平il - 6、TNF -α,il - 1β在lipopolysaccharide-stimulated巨噬细胞显著增加。这些增加显著减毒紫草素预处理浓度的0.5和1中巨噬细胞μm . 0.5μM紫草素显著抑制il - 6的表达(37%),)和il - 1β(32%,);在1μM紫草素显著抑制il - 6的表达(85%),)、肿瘤坏死因子-α(20%,),il - 1β(87%,)。

3.4。紫草素减少Cyclooxygenase-2蛋白表达和NF -核易位κB p65 pSTAT-3

cox - 2中扮演一个重要的促炎在炎症性肠病的发病机制中的作用。我们因此紫草素在结肠的影响评估cyclooxygenase-2 DSS-induced UC的表达式。正如所料,DSS政府为7天生产增加小鼠结肠cyclooxygenase-2表达式(图9(一个))检测到免疫印迹分析。紫草素的抗炎效应对肠相关显著(90%;(图)抑制结肠cyclooxygenase-2表达式9(一个))相比,colitic动物。

我们还研究了紫草素的影响在NF -的激活κB和pSTAT-3结肠匀浆。的转录因子NF -κB家族基因的调控中起着关键作用参与免疫和炎症反应。基因的启动子和增强区域编码炎症介质对NF -结合位点κB (34]。在炎症性肠病,NF -κB激活是观察在肠道粘膜发炎,它诱发cox - 2的表达。事实上,这个活动已经证明是高核提取物固有层活检的患者的样本与克罗恩氏病和加州大学(35]在巨噬细胞和上皮细胞的UC患者(36),这表明针对NF -κB活动在这些细胞治疗干预(可能是一个有吸引力的目标14]。我们证实核p65水平显著高于老鼠收到DSS比那些只接受正常饮用水(图9 (b))。紫草素部分预防的易位p65细胞核57% ()(图9 (b))相比,colitic组。挡住了NF -κB通路可以构成一个有趣的方法来打破这个恶性循环。具体来说,NF -κB p65亚基似乎是一个重要的监管机构在肠道炎症炎症性肠病;事实上,反义治疗或诱饵寡核苷酸抑制p65已经证明可以改善宏观结肠炎的迹象以及核积累和DNA结合活性p65蛋白在肠道炎症的几个模型37- - - - - -39]。直肠管理这些反义寡核苷酸DSS-induced UC模型是有效管理0或2天(40,41];然而,没有影响被认为在使用7天。这些结果表明,治疗NF -κB反义寡核苷酸对DSS-induced结肠炎有抑制作用,当管理的早期阶段的炎症。在此前的一项研究中使用的模型急性耳水肿引起的局部12 -O-tetradecanoylphorbol 13-acetate应用和lipopolysaccharide-stimulated生264.7巨噬细胞,我们证明了紫草素的抗炎活动通过其抑制作用发生在NF -κB激活,可以反过来归因于它能够阻止我κBα退化(24]。此外,最近的药物基因组学研究表明,紫草素抑制的一组基因与炎症反应的早期阶段有关,包括细胞因子、趋化性、细胞迁移基因(42]。陆et al。43)最近提出了作为一个可能的生化机制的抑制蛋白酶体,因此抑制我的退化κBα,因为他们展示在初选lipopolysaccharide-stimulated鼠巨噬细胞处理紫草素1μm .在目前的研究中,我们已经表明,紫草素能够抑制cox - 2的表达在治疗小鼠结肠匀浆,可能通过防止核易位p65亚基,与12 -一样O-tetradecanoylphorbol 13-acetate-induced耳部水肿(24]。

最近的数据表明,STAT-3是其中一个至关重要的目标治疗炎症性肠病是结肠炎症的发展与感应STAT-3活动密切相关。激活后,这个转录因子把原子核(44]。Mudter et al。45)和Atreya纽赖特(46)发现STAT-3和pSTAT-3水平显著高于在溃疡性结肠炎患者相比,控制。overactivation单核细胞和上皮细胞导致先天防御系统允许细菌滋生,最终启动疾病(47]。此外,STAT-3 pSTAT-3水平也与实验炎症组织的组织学资料(48,49];因此STAT-3似乎是一个潜在的治疗溃疡性结肠炎的目标。在以往的研究中,白等。50]研究反义寡核苷酸的封锁STAT-3 trinitrobenzenesulphonic酸- (TNBS)诱导小鼠结肠炎。在我们的研究结果,可以看出在noncolitic动物,只有弱免疫反应性检测pSTAT-3核(图所示9 (c))。也观察到类似的结果群colitic老鼠紫草素处理(减少55%与colitic老鼠相比,)。这一发现表明,一个重要的有益影响的紫草素在炎症性肠病的治疗是能够减少STAT-3的激活。然而,需要更多的研究来进一步深入地了解这个机制。

尚未评估在这一个方面工作,这可能是参与保护机制的实验性溃疡性结肠炎的紫草素化合物可能会影响到胃肠道微生物群,特别是因为它是口服药物。肠道内腔有大量微生物的完美与宿主共生。这些交互可以是有益的或有害的。肠道免疫系统必须,一方面,保卫病原体的攻击,从而防止细菌通过上皮和过度进入,另一方面,认识到居民肠道微生物区系。这种平衡的破坏会导致炎症性肠病。因此,一个重要的挑战是识别和理解这些交互,因为许多因素(饮食、药物、治疗用抗生素,等等)可以修改它们。例如,肠黏膜的渗透性的缺陷可能导致失去宽容正常肠道菌群。

肠上皮屏障的缺陷在溃疡性结肠炎导致厌氧细菌的浓度的增加。这就解释了抗生素,益生菌制剂比免疫抑制剂更有效更耐受。DSS等化学药剂引起的炎症产生一个深远的结肠微生物群落的变化(亚伯拉罕和Medzhitov, 2011)51),拟杆菌的浓度减少和增加的相对变形菌门的数量,包括肠杆菌科,如果主机是遗传易感,应对这些致病的菌群。肠杆菌科等肺炎克雷伯菌或大肠杆菌有N乙酰转移酶活性,激活某些致癌物质。紫草素并不是对这些细菌抗菌,它能够抑制酶(52),因此发挥保护作用。

4所示。结论

紫草素引起的治疗是有效的加州大学DSS的剂量25毫克公斤⁻¹(两次订单。)。生产紫草素减少促炎细胞因子和抑制cyclooxygenase-2诱导一氧化氮合酶表达小鼠结肠炎。紫草素的影响在这个实验模型可以解释不仅Th1反应的抑制作用,但也封锁的激活的两个主要目标:NF -κB和STAT-3。这是第一次报告的紫草素的能力减弱DSS的口服引起的急性炎症。结合已知的反N乙酰转移酶活性和伤口愈合性能的紫草素及其抗炎特性使它成为一个有前途的治疗管理代理炎症性肠病。

利益冲突

作者没有利益冲突。

确认

这项工作是由西班牙政府支持(saf2009 - 13059 c03 - 01)。即安杜哈尔是感激的奖学金Generalitat Valenciana,格兰特BFPI / 2008/040。

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