文摘

蛹虫草(CM)是一种虫媒真菌,被用于中药因其广泛的药理活性。在本文中,我们研究了CM种植在发芽大豆(GSC)和调查可能的机制GSC HT-29人类结肠癌细胞的抗增殖作用。CM提取物与发芽大豆(GS) BuOH提取物,BuOH提取GSC表现出非凡的抑制性和抗增殖效果的HT-29结肠癌细胞。GSC治疗后,HT-29细胞变得越来越不规则形状。高G2 / M期细胞群GSC-treated组中观察到。细胞周期蛋白的水平B1和Cdc25 GSC-treated组比对照组低。这些发现表明,GSC BuOH提取物可以作为一个有效的anti-proliferative剂诱导结肠癌细胞G2 / M细胞周期阻滞。

1。介绍

结肠癌是一个严重的公共卫生问题在西方世界(1]。据美国癌症协会,结肠癌是第二个癌症相关死亡的主要原因在美国(美国)。肿瘤病人生存相关的阶段。例如,I期结直肠癌,癌仍局部黏膜下层的结肠上皮细胞,有一个总体5年生存率超过90%,而四期癌的5年生存率小于10%。细胞周期的调节异常中发现某些癌症。大量的细胞显示调制的表达分子负责细胞凋亡和细胞周期阻滞2),包括细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDKs)。

目前治疗癌症在很大程度上是基于癌症特异性手术,激素治疗,放疗、化疗,与抗癌药物和治疗。而进步继续在治疗大肠癌的有效策略的发展,化疗通常是有限的严重不良反应和dose-limiting毒性药物。因此,它是非常重要的识别和屏幕从天然产物化合物能有效治疗癌症没有不利影响。

大量的药用蘑菇已被证明具有抗癌活性(3- - - - - -6]。这样一个蘑菇,蛹虫草(CM)被用于传统中药。CM提取已报告施加一个广泛的药理作用,包括免疫调节、抗炎和抗肿瘤活动(7- - - - - -10]。金等。11和公园等。7)报道,厘米有强有力的对癌细胞的细胞毒性作用和对免疫刺激性影响。金等人报道,水厘米提取物诱导细胞凋亡在人类乳腺癌MDA-MB231细胞还存在通过激活和钝化Akt [12]。

尽管临床和药理CM的重要性,大量天然厘米不容易因其生产成本高。因此,我们开发了新的方法来培养厘米。我们成功地对发芽大豆栽培厘米(GS),含有大量的营养物质和活性生物化合物如异黄酮(13,14]。在我们之前的研究中,我们证明了CM种植在GS (GSC)显示药理作用优于天然厘米(10,15]。然而,GSC的活动对结肠癌致癌作用尚未明确。在这项研究中,我们调查的影响GSC HT-29结肠癌细胞和分子机制这一效应决定。

2。材料和方法

2.1。试剂和化学物质

GSC、CM和GS (Kucari 0903)从细胞激活获得研究所,首尔,韩国。RPMI 1640中,胎牛血清的边后卫,penicillin-streptomycin, trypsin-EDTA获得Gibco BRL(美国纽约大岛)。Propidium碘(PI)、NP-40和核糖核酸酶得到从西格玛化工有限公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。Anti-Cdc25c(细胞信号技术Inc .,丹弗斯,MA), anticyclin B1(细胞信号技术Inc .,丹弗斯,MA), anti-Bcl2(细胞信号技术Inc .,丹弗斯,MA), anticaspase-9(细胞信号技术Inc .,丹弗斯,MA),反β肌动蛋白,辣根过氧化物酶,(合)共轭anti-rabbit和anti-mouse免疫球蛋白抗体(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)是获得相应的供应商。化学发光检测包买来Biosesang(首尔,韩国)和从Daelillab EZ-CyTox分析工具服务有限公司(韩国)。

2.2。GSC的准备

GSC生长如前所述[10]。经过身份验证凭证标本的CM (Kucari 0903)存入在生物科学和生物技术学院植物标本,建国大学(首尔,韩国)。简而言之,CM菌丝体(Kucari 0906)是接种对发芽大豆(大豆(l)稳定),培养4周的20 - 25°C。粉末材料(1公斤)是根据与80%甲醇回流提取(GSC(绿色)的甲醇提取物)48 h。总提取物(178 g,收益率(w / w), 17.8%)和水溶解。删除后的不溶性固体颗粒过滤、提取液相顺序与增加极性溶剂(正己烷、层、BuOH和水;1:10 (w / v)为所有溶剂),收益率4分数。液-液萃取阶段是厄伦美厄烧瓶内的颤抖,和提取旋转蒸发器浓缩,干燥。因此,我们获得以下分数:己烷分数(16 g,收益率(w / w) 1.6%),层分数(4.5 g、产量(w / w) 0.45%), BuOH分数(8.25 g、产量(w / w) 0.825%),和水比例(10.86 g,收益率1.086% (w / w))。

2.3。细胞培养

HT-29细胞(人类结肠癌细胞)从美国购买类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)。在RPMI 1640培养基培养细胞(美国纽约Gibco,大岛)补充10% heat-inactivated的边后卫(美国纽约Gibco,大岛),100 U /毫升的青霉素,100μg / mL链霉素在37°C湿润孵化器有限公司为5%₂。

2.4。细胞增殖实验

GSC的影响,GS, CM BuOH提取HT-29细胞增殖测定使用EZ-CyTox工具包(Daelillab服务有限公司、韩国)。分析是根据制造商的协议执行。HT-29结肠癌细胞(1×10⁴细胞/)被放置在一个96孔板和孵化与不同浓度(0、25、50、75、100和250μGSC BuOH g / mL), GS BuOH,和CM BuOH提取48 h和72 h,分别。一个固定的金额(10μL) EZ-CyTox试剂添加到每个好和孵化为一个额外的1 - 2 h 37°C。细胞增殖水平检测到450纳米的光密度(OD)通过使用ELISA Multidetection读者(Tecan、Mannedorf、瑞士)。

2.5。形态分析

HT-29细胞被置于6-well盘子1×10的密度⁶细胞/毫升。24小时孵化后,细胞治疗与不同浓度的GSC BuOH提取。48小时后,细胞与3%甲醛固定,然后phase-light显微镜下观察(奥林巴斯、东京、日本)和拍摄的放大100倍来检测任何形态的改变。

2.6。细胞周期分析

HT-29细胞(1×10⁶细胞/毫升)中孵化6-well板块存在与否的GSC BuOH提取48 h,之后他们被胰蛋白酶化收获,洗两次与磷酸缓冲盐(PBS)和固定冰冷的70%乙醇。离心后,固定细胞被染色的解决方案包含0.2% NP-40孵化,核糖核酸酶(30μg / mL),和π(50μg / mL)(美国圣路易斯σ)phosphate-citrate缓冲区(pH值7.2)。细胞DNA流式细胞术分析的内容正欲使用激光流式细胞分析仪(美国新泽西州,正欲)。至少10000个细胞被用于每个分析,结果显示为直方图。的平均百分比细胞细胞周期的每个阶段确定/ 3独立实验。

2.7。免疫印迹分析

HT-29细胞治疗与GSC BuOH提取物浓度为0,25岁,50岁,75年,100年和250年μg / mL 48 h。细胞裂解缓冲细胞溶解和蛋白质浓度测定使用分析工具(美国罗克福德Thermoscientific)与牛血清白蛋白标准。样品与等量的蛋白质sds - page分析了12%。蛋白质被转移到一个聚偏二氟乙烯(PVDF)膜使用传输缓冲区。一夜之间,细胞膜被孵化在4°C阻断缓冲区(1×PBS-T和5%脱脂牛奶),然后孵化Cdc25c抗体,细胞周期蛋白B1、Bcl2, caspase-9(1: 2000),和β肌动蛋白(1:3000)在室温下2 - 3 h与不断的颤抖。膜清洗三次1×PBS-T缓冲和孵化HRP-conjugated二级抗体(1:5000)1 - 2 h。膜的清洗和检测的免疫反应性的乐队都使用了增强化学发光免疫印迹检测系统(Biosesang、首尔、韩国)。

2.8。统计分析

值表示为±SD比例控制。学生的t以及或单向方差分析/ Dunnett的t以及用于分析CM-treated之间的统计学意义,对照组。使用SPSS统计分析进行,12版(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。

3所示。结果

3.1。GSC治疗抑制HT-29结肠癌细胞增殖和诱导HT-29细胞形态学的变化

与GS和CM BuOH提取相比,GSC BuOH提取有显著抑制作用HT-29细胞的生长(图1(一))。与100年48 h后治疗μ克/毫升的GSC BuOH、GS BuOH和CM BuOH提取物,HT-29的增殖细胞减少,,,分别。因此,使用GSC BuOH提取进行了进一步的实验。如图1 (b)GSC BuOH提取物显著抑制HT-29细胞增殖以浓度和时间的方式。然而,GSC BuOH提取不影响小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞生存能力(数据没有显示)。

我们还发现HT-29细胞形态学变化GSC BuOH提取物治疗后(图2)。GSC BuOH治疗后(0、25、50、75、100和250μg / mL) 48 h,显示细胞形态学特征如集落形成和不规则的形状和大小,没有发现细胞的对照组。

3.2。GSC诱导G2 / M期细胞周期阻滞在HT-29细胞

不受控制的细胞增殖是肿瘤细胞的特征(16]。证明GSC BuOH提取物的抑制机制对结肠癌细胞,我们检查了HT-29细胞的细胞周期改变,流式细胞术。GSC BuOH提取物治疗后48 h, DNA内容HT-29 G2 / M期细胞增加浓度的方式比对照组。在G2 / M期细胞的比例,,,,相比,在控制(),当处理25、50、75、100和250μ克/毫升的GSC BuOH提取48 h,分别(图3)。这些结果表明,GSC BuOH提取导致HT-29 G2 / M细胞周期阻滞细胞。

3.3。GSC蛋白质水平降低的细胞周期蛋白B1和Cdc25c HT-29细胞

确定分子机制的G2 / M逮捕GSC BuOH提取、分子的水平参与G2 / M期细胞周期的检查。GSC BuOH extract-treated细胞强烈阻止细胞周期蛋白的表达B1和Cdc25c HT-29细胞中蛋白质浓度(0、25、50、75、100和250μg / mL)和时间(0、2、6、12、24、48 h)方式(数字4(一)和4(b))。然而,GSC BuOH提取没有影响的水平apoptosis-related蛋白质Bcl2和caspase-9(图4(a))。

4所示。讨论

由于增加结肠癌的发病率,缓解率相对较低,需要建立更有效的治疗方案,采用新颖和创新方法16]。活跃的药用化合物或提取物的使用传统药物或天然来源被认为是一种替代治疗方法。许多自然衍生化合物/提取物被认为是安全的,因为他们是来自一般消费食品。厘米是一个著名的药用蘑菇,在东方医学用于治疗各种疾病,包括癌症。先前的研究已经表明,厘米有广泛的药理作用,包括免疫调节和抗炎活动(7- - - - - -11]。

肿瘤细胞通常表现出一些特征比如高增殖、迁移,matrix-invasion势(17,18]。抑制肿瘤的生长是一个治疗靶点的抗癌药物的发展。调节肿瘤细胞生长和诱导细胞死亡的两个主要的方法来抑制肿瘤的生长19]。本研究评估GSC BuOH提取物是否anti-proliferative对HT-29细胞活动。虽然GSC BuOH、GS和CM BuOH提取物表现出对HT-29 anti-proliferative活性细胞,GSC BuOH提取显示anti-proliferative活动最低的IC₅₀(100μg / mL)的价值。严重扭曲HT-29细胞集落形成能力的丧失GSC BuOH治疗后观察。我们分析了变化在细胞周期进程HT-29 GSC BuOH通过流式细胞术治疗。细胞增殖是由不同基因定义的检查点,以确保发展的细胞通过细胞周期的不同阶段(20.]。在癌症细胞中,细胞周期检查点已知控制系统通过突变的积累(中断21]。在G2 / M期,受损的细胞有机会修复DNA或永久逮捕细胞生长如果损害程度严重22]。一些抗癌药物逮捕在G2 / M期细胞周期,诱导细胞凋亡和坏死,导致细胞死亡(23,24]。一般来说,G2 / M过渡是由一个复杂的细胞周期蛋白,细胞分裂即Cdc2和b型细胞周期蛋白(22]。蛋白质酪氨酸磷酸酶,Cdc25c扮演的角色有丝分裂激活的脱去磷酸Cdc2 /意思是,形成Cdc2 /细胞周期蛋白B1复合物,允许细胞进入有丝分裂(25]。许多研究表明,Cdc2 /意思是激酶活性增强在一些人类癌症细胞,因为他们的遗传和表观遗传改变22]。因此,我们调查了分子的表达是否卷入HT-29细胞G2 / M过渡GSC BuOH提取物治疗后改变。我们发现GSC待遇的差别导致了对这些Cdc25c HT-29结肠癌细胞和细胞周期蛋白B1表达。本研究的结果表明,GSC引起G2 / M期细胞周期阻滞和细胞周期蛋白的水平减少B1和Cdc25c,参与细胞周期的进展G2 / M期。此外,这些化合物的识别将GSC的anti-proliferative活动提高我们的理解。进一步的实验需要做澄清这些确定化合物的anti-proliferative机制。

5。结论

总之,GSC BuOH提取物可以作为一个有效的anti-proliferative剂诱导结肠癌细胞G2 / M细胞周期阻滞。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

m L Mollah和d . k .公园同样对本文亦有贡献。

确认

本文得到了智能韩国建国大学研究教授计划,首尔,韩国。