文摘

Sarcandra glabra作为一种“antipyretic-detoxicate药物”,一直广泛应用于中药(TCM)。的Sarcandra glabra提取(白银)是应用经常作为民间药物抗炎和anti-infectious药物。然而,相关实验数据支持这一有效的临床后果是有限的。为了模仿易感人群的生理条件,我们采用约束压力小鼠模型来调查上海黄金交易所的对抗流感的影响。老鼠感染流感病毒后三天克制,在上海黄金交易所的口头管理连续10天。体重、发病率和死亡率每天记录。组织病理变化,易感基因表达式和炎症标记物在肺部被确定。我们的研究结果表明,约束应力显著增加流感病毒的易感性和严重程度。然而,上海黄金交易所的口服可以减少发病率,死亡率和显著延长生存时间。结果进一步表明,上海黄金交易所的提高有着至关重要的影响易感性标志物水平恢复平衡的宿主防御系统和抑制炎症因子水平通过下调NF -B蛋白表达,减轻肺损伤。这些数据表明,上海黄金交易所的易感性和减少流感的严重性。

1。介绍

流感是由流感病毒引起的一种急性呼吸道疾病,严重威胁人类的生命。大多数人会完全从流感中恢复,没有其他特殊待遇除了退热的药物治疗和休息。然而,一些患者会出现其他症状和并发症,如臀部、关节痛、胸痛、淋巴结病,甚至肺炎。肺炎可以迅速发展,并可能导致呼吸衰竭和死亡(1,2]。尽管许多化学抗病毒药物临床使用,流感病毒耐药的出现和随后的病毒性肺炎仍然是流感病人发病率和死亡率的主要原因(3,4]。因此,更多的关注一直在探索自然和活性物质抗流感。

Sarcandra glabra(研究)。纳街(金粟兰科)是广泛应用于中医退热剂,使解毒,抗肿瘤,抗炎,anti-infectious药物(5]。Sarcandra glabra提取(白银)包含高水平的rosmarinic酸,isofraxidin,反丁烯二酸、类萜皂苷等。已经显示出潜在影响流感症状及其治疗的临床实践(5]。然而,只有很少的数据使用以来,上海黄金交易所的抗流感作用nonsuitable动物模型和积极的结果是很难获得通过体外抗病毒实验。这个悖论可以解释如果宿主因素是重要的流感感染的发病机理和结果。众所周知,流感病毒杀死了数以百万计的人在20世纪(6]。虽然流感病毒感染广泛的人,最有可能需要住院治疗的新生儿,老人,病人,和个人展示疲劳和压力,降低免疫力。据报道,超过90%的死亡发生在这些易感人群7,8]。压力可以增加易受病毒或细菌病原体,影响传染性疾病的严重程度和减少宿主免疫防御的力量(9,10]。使用约束强调小鼠模型的原因是因为克制是一种常用的压力。我们先前的研究已经表明,约束应力可能会提高患传染病的风险并延长传染性疾病发作(10),哪个更有利于模拟易感人群的临床特征。我们还成功地使用克制应激小鼠模型来评估天然产物抗流感的影响(10]。因此,我们采用克制应激小鼠模型来研究上海黄金交易所的流感的影响及其随后的肺炎。

2。材料和方法

2.1。上海黄金交易所的准备

Sarcandra glabra提取(没有。090303)是由广州Jingxiutang制药有限公司(广州)。上海黄金交易所的定性分析采用高效液相色谱法如前所报道(11]。如图1上海黄金交易所的主要化学成分是5-caffeoylquinic酸,3-caffeoylquinic酸,4-caffeoylquinic酸,咖啡酸,isofraxidin 4′- o -β-D-glycopyranosyl rosmarinic酸,rosmarinic酸。Rosmarinic酸和isofraxidin上海黄金交易所被用作标记的质量控制。上海黄金交易所的每克含2.4毫克rosmarinic酸和3.5毫克isofraxidin [12]。

2.2。动物和病毒

男性特定病原体免费昆明小鼠(13 - 15 g)从广东购买医学实验动物中心(广州)。所有的老鼠都保存在一个无菌动物的房间温度控制°C。12 h光暗周期维护,灯光从18:00 06:00时的时间。标准的实验室提供的老鼠的饮食和水。所有研究按照指南进行设置由美国国立卫生研究院和美国农业部(1996年出版数量85 - 23日修订)。/ FM / 1/47 (H1N1)流感病毒是由华南农业大学兽医学院(广州)。病毒株的传播在特定无菌受精卵和用于小鼠的杀伤力后三个段落的动物。含有病毒尿囊液被收集并存储在整除−80°C。系列稀释后的LD50测定小鼠的股票。两倍的价值LD50被用于病毒的挑战所有的实验。感染了鼻内接种小鼠麻醉乙醚。 The influenza-related pathogenic operation was performed in the Animal Biosafety Level 3 Laboratory in South China Agriculture University.

2.3。实验设计

实验小鼠随机分为六组:正常的控制,控制病毒(病毒)、模型控制(克制+病毒),积极控制(克制+病毒+ 50毫克/公斤利巴韦林),上海黄金交易所和两组(克制+病毒上海黄金交易所+ 250或500毫克/公斤)。利巴韦林和上海黄金交易所的接种到小鼠口服填喂法连续10天,而其他的组织只收到了水。在政府,第二天老鼠身体限制在50毫升聚丙烯离心管与孔18 h。恢复后三天,动物被吸入麻醉乙醚蒸气,然后一个近似(30的病毒数量μL)被灌输进鼻孔。

实验进行了一式三份的9 - 11为每个组小鼠观察每日体重的变化,生存,和一些疾病的典型症状,包括皱皮,红肿的眼睛,鼻子或嘴,弯腰驼背,改变呼吸和反应迟钝,21天,直到死亡。另一个实验是在重复进行8为每组小鼠。在病毒感染后第5天,小鼠体重,乙醚麻醉。血液通过心脏穿刺和肺被移除并且称重。

2.4。组织病理分析

监测流感病毒感染动物的肺组织学变化,所有的老鼠都牺牲了测定肺指数。同时,肺组织立即固定在4%缓冲福尔马林和嵌入在石蜡。肺段(4 - 6μ米)被切片机切片(莱卡)和安装在显微镜幻灯片。病理学改变进行光学显微镜下)染色(奥林巴斯)所描述。

2.5。测量血清的水平

血液样本收集和离心机,享年500岁g 15分钟获得血清。血清水平取决于格里斯测试(13,14]。

2.6。逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)

提取总RNA在细胞溶解肺组织(如前所述)(10)和reversely-transcribed cDNA运用鼠标moloney白血病病毒逆转录酶(表达载体)。病毒核蛋白(NP)基因,SP-A SP-D, ICAM-1 IFITM 3, il - 1β肿瘤坏死因子-α和伊诺mRNA水平在肺组织和内部控制18 s基因测定Veriti PCR系统(应用生物系统公司),使用引物列在表中1。PCR产品分馏在1%琼脂糖凝胶和溴化乙锭染色的可视化。溴化乙锭带强度的荧光测量使用图像分析系统(Bio-Rad大力神,CA),然后用数量一个量化分析软件(Bio-Rad大力神,CA),并表示比18岁。

2.7。西方墨点法

胞质及核蛋白质是从肺样本使用提取工具根据制造商的协议(凯基生物生物技术,中国)。样本运行在10% SDS凝胶在硝化纤维膜和electroblotted /页面。免疫印迹化验使用anti-NF -κB p65(1: 2000)抗体(细胞信号技术,Inc .)。immunodetection是通过使用一种增强化学发光检测设备(MultiSciences生物技术有限公司,中国)。乐队密度使用数量一个量化分析软件(Bio-Rad大力神,CA)通过计算每个字段的平均光密度。

2.8。统计分析

给出的数据为平均值±标准错误(SE)。统计比较的数据进行SPSS 19.0系统的使用方差分析。的值被认为是显著的。病发病率的差异(时间)和死亡率(时间死亡)组间在21天postinfection时期测定使用Lifetest SigmaStat生存分析程序(),分析了均值和中位数时间疾病和死亡。

3所示。结果

3.1。上海黄金交易所的影响在Restraint-Stressed小鼠流感引起的发病率和死亡率

上海黄金交易所的对甲型H1N1流感的影响评估在克制强调老鼠+病毒感染。鼻内接种的流感病毒后,老鼠每天监测为生存和体重变化。中观察生存率明显低于模型对照组相比病毒控制(,图2(一个))。只有22%的小鼠模型中对照组幸存下来,平均一天死亡(MDD)降低来天相比,病毒对照组()。利巴韦林(50毫克/公斤)显著提高存活率和MDD的90%天()。上海黄金交易所的还演示了抑制效应对死亡,占据45%和64%的老鼠生存在250和500毫克/公斤/天上海黄金交易所的治疗组,分别。上海黄金交易所的MDD 500毫克/公斤/天也长天()。此后,病毒感染小鼠的体重开始减少在第五天,跌至最低在第七天(图2 (b))。幸存下来的病毒感染小鼠体重开始增加8天,但模型控制老鼠一直减肥,直到第十天。上海黄金交易所的治疗在250和500毫克/公斤/天可以显著提高病毒感染小鼠的健康状况。体重变化相当稳定与其他组相比,在轻微的减肥一天6。此外,行为变化,如挤作一团的倾向,有环状羽毛的皮毛,调整呼吸,减少食物摄入量中观察到感染小鼠病毒感染后的第六天。发病率呈现病态的老鼠老鼠总数的百分比。如表所示2、组发病率的差异很明显超过21天的感染后时期。老鼠固定在一个克制笼子里18 h导致发病率的增加与病毒控制()。模型控制经验丰富的发病率100%的发病率,而只有80%的病毒对照组。平均时间生病天模型控制病毒控制。上海黄金交易所的治疗在250和500毫克/公斤/天显著缓解流感症状和抵消发病率与克制压力()。发病率的发生率是82%,250年上海黄金交易所500毫克/公斤/天组,而同时疾病和天,分别。这些结果表明,上海黄金交易所的提高生存率和延长生存时间的病毒感染剂量依赖性的方式强调老鼠。

3.2。上海黄金交易所的在Restraint-Stressed Influenza-Caused肺炎小鼠的影响

如图3(一个)在感染后的第五天,肺被广泛水肿为特征,红细胞外渗和炎症。部分支气管粘膜脱落或侵蚀。此外,大型病变所有肺上叶是模型组中发现的。肺指数被用来评估水肿程度由流感病毒引起的。如图3 (c)、肺指数正常控制的基准毫克/ g。这是增加到毫克/ g (病毒控制和进一步增加毫克/ g ()在模型控制。模型控制相比,利巴韦林显著恢复肺指数毫克/ g ()。此外,上海黄金交易所(250和500毫克/克/天)也恢复肺指数和毫克/ g ()。上海黄金交易所的影响在流感病毒诱导肺炎的发病机制强调老鼠)染色观察到(图3 (b))。与肺炎、肺部有炎症细胞浸润。肺泡满心出血渗出,肺泡壁增厚。此外,模型组的小鼠的肺组织病变显示显著的补偿肺气肿,支气管上皮增生。然而,上海黄金交易所的肺癌发病机制和利巴韦林组与模型组相比显著降低。

3.3。上海黄金交易所的影响在Restraint-Stressed小鼠流感感染的易感基因

rt - pcr用于探索如果黄金交易所将减少流感感染的易感性restraint-stressed老鼠。NP mRNA水平检查作为一个指示器的病毒复制和清除肺部的学位。如图4,NP mRNA表达模型小鼠的肺高出近两倍,在病毒对照组()。然而,上海黄金交易所的治疗(250年,500毫克/公斤/天)明显降低NP mRNA水平(,)。ICAM-1,此外,SP-A SP-D IFITM3,已知是至关重要的宿主防御和影响病毒的复制和清除能力在肺,也检查了。ICAM-1的mRNA表达增加,而SP-A SP-D, IFITM3克制压力明显减少小鼠相比,病毒控制。上海黄金交易所的管理(250年,500毫克/公斤/天)明显降低ICAM-1 mRNA水平和增加SP-A, SP-D IFITM 3 mRNA的表达。

3.4。上海黄金交易所的影响在Restraint-Stressed老鼠Influenza-Caused炎性细胞因子的生产

探讨上海黄金交易所的影响在influenza-induced肺炎的炎症反应,我们发现氮的浓度血清中含有激进没有,在肺组织伊诺的mRNA水平。与此同时,炎症标记物如il - 1β和肿瘤坏死因子-α肺组织mRNA水平也化验。如图5,病毒感染诱导增加血清没有水平。这是更高的感染病毒的抑制小鼠。然而,口服的黄金交易所(500毫克/公斤/天)感染小鼠相比没有显著减少血清水平与模型控制()。改变在伊诺mRNA水平符合上述发现。此外,如图6,il - 1的转录水平β和肿瘤坏死因子-α模型对照组显著增加,上海黄金交易所的组织(500毫克/公斤/天)明显降低mRNA水平。然而,il - 1βmRNA水平仅略减少利巴韦林治疗和上海黄金交易所的(250毫克/公斤/天)。众所周知,炎症标记物的生产是由转录因子NF -κ我们进一步研究了上海黄金交易所的NF -的影响κB激活。如图7上海黄金交易所,可以防止核p65积累(NF -的主要组成部分κB)在肺组织的感染stressed-mice剂量依赖性的方式。总的来说,结果表明,上海黄金交易所的保护作用对病毒造成肺炎。

4所示。讨论

在古代中国,中药(TCM)发挥了关键作用在抗击流感大流行7]。中医在临床实践中表现良好,显示,流感的治疗潜力15,16]。尽管许多中医已报告有一个有效的抗流感作用[14,17),有有限的数据支持。迫切需要找到一个合适的动物模型,评价中药抗流感活动。众所周知,抗病毒药物和中药工作在一个非常不同的方式在人类的身体。反病毒药物目标病毒和病毒诱导的并发症是无效的。相反,中药被认为在协同工作方式,与病毒和根据症状和身体保持身体在一个适当的平衡。因此,在筛选和评价中药抗流感活动、宿主因素不容忽视。我们还发现,上海黄金交易所的对抗流感的影响难以评估通过一般小鼠模型(补充图1网上doi: 10.115 / 2012/236539)。一些研究显示,人类流感病毒感染的发病机理取决于病毒和宿主因素(18]。在目前的研究结果表明,鼻内管理正常小鼠流感病毒可能只是部分引起疾病的动物,甚至开始爆发的肺炎。虽然在实验动物有个体差异,当受感染的老鼠加载与约束应力,诱导的疾病被发现在所有的动物。相反,那些没有克制的诱导率只有80%的压力。疾病的症状,如呼吸急促、立毛,迅速失去体重和变得奄奄一息,被严重感染后5天。此外,动物的死亡率明显压力与限制从30%上升到78%。当我们观察从腹侧看完整的肺,所有叶显示严重的水肿和出血性胸腔积液。肺癌病理幻灯片显示重型病毒性肺炎与克制stress-loaded大幅破坏和严重的炎症感染的老鼠。当我们在克制病毒负荷计算stress-loaded感染的老鼠,我们发现病毒持续并不能迅速清除。肺病毒复制的内容几乎是双重的高于正常小鼠测量时感染后5天。 Therefore, enhanced pathogenesis of influenza was attributable to restraint stress and consequential changes in immune defense of the lungs. Heightened cytokine and chemokine levels are also hallmarks of severe influenza infection, which have been observed in both human and animal models [18,19]。最近的研究表明,肺的炎症细胞因子和趋化因子水平或血清与病毒载量(密切相关20.]。与正常小鼠相比,一个显著的、夸张的肺癌和血清中促炎反应被发现克制强调老鼠。这可能是一个象征符号描述肺内病毒蔓延的程度。在以前的研究中,约束应力有显著改变CD4的平衡⁺T / CD8⁺T细胞和NK细胞活性降低11]。因此,当动物被暴露在一个unencountered流感病毒宿主的免疫防御无法有效地采取行动。事实上,克制强调老鼠可能更容易被病毒感染,影响相关易感基因的表达水平,从而消除动物的个体差异。这显然动物模型可以模拟实际的病毒性肺炎的病理状态,可以直观地观察和检测。因此,我们的动物模型提供了一个理想条件的影响的评价中药抗流感和随后的肺炎。

上海黄金交易所在目前的研究中,我们使用restraint-stressed老鼠模型来评估其影响对流感和结果表明,上海黄金交易所的口服感染stressed-mice可以减少发病率,促进小鼠从流感中恢复幸存下来。上海黄金交易所的管理期间,我们发现治疗小鼠在稍微更好的生理条件和提高了生存率。同时,也显著延长小鼠的生存时间。从完整的肺的角度,上海黄金交易所的治疗可以减轻水肿,红细胞外渗和出血性胸腔积液。我们进一步发现肺癌病理幻灯片,上海黄金交易所的抑制流感virus-stimulated肺形态学变化,包括降低血管结构破坏和肺泡。此外,数据还显示,上海黄金交易所的可能减少病毒负荷在restraint-stressed小鼠肺部感染后5天。这些结果表明,上海黄金交易所的减少炎症进展在肺的影响可能与减少病毒负荷。然而,上海黄金交易所直接杀毒效果不存在体外(数据没有显示)。

流感病毒感染宿主可分为五个阶段,吸附、入侵、复制、成熟和释放。当宿主细胞被感染了流感病毒,呼吸道和肺的collectins,表面活性剂蛋白A和D (SP-A SP-D)将承认,绑定,中和病毒,防止附件病毒宿主细胞(21,22]。一些研究表明SP-A和SP-D不足会加重流感病毒感染(23- - - - - -25]。之前的研究表明,转录因子NFAT(核转录因子激活T细胞)调节SP-A和SP-D基因转录,反过来,NFAT负受一种蛋白激酶(26,27]。压力可能导致激活一种蛋白激酶的表达增加,因此Akt激活可能导致增加NFAT的抑制,反过来又降低了转录激活SP-A和SP-D26,27]。除了SP-A SP-D不足,增加ICAM-1蛋白质含量也报道加剧病毒感染(28]。ICAM-1血管内皮黏附分子发现,气道上皮细胞。ICAM-1参与白细胞招聘和可能是一个入口网站对某些病毒(29日]。一些研究已经表明,压力能够诱导活性氧簇(ROS)的生产,而ROS表示增加ICAM-1水平(30.]。在这项研究中,我们发现克制压力明显增加ICAM-1 mRNA表达和降低SP-A SP-D mRNA的表达。这可能是一个潜在的机制约束压力如何影响呼吸道流感感染。然而,上海黄金交易所的口服可以恢复和进一步加强SP-A SP-D表达水平,以及减少ICAM-1的表达,有利于清除流感病毒。成功逃脱病毒感染宿主细胞时,流感病毒的单链RNA被toll样受体7 (TLR7)和视黄acid-inducible基因(rig - i)。I型干扰素通路诱导生产和激活interferon-inducible跨膜(IFITM)蛋白家族,这进一步激活免疫系统,帮助消除病毒(18,31日]。最新的研究发现,IFITM3避免与流感相关的发病率和死亡率(32]。我们的研究结果表明,约束应力降低IFITM3 mRNA表达,从而阻碍了细胞免疫信号转导。这延迟后免疫反应克制压力是兼容以前的结果,这表明,约束应力可能导致免疫抑制(11]。最近的证据也表明,上海黄金交易所的具有免疫调节作用。然而,上海黄金交易所的口服可以加强IFITM3 mRNA的表达。结合上海黄金交易所的证据可能防止restraint-stressed小鼠免疫功能低11),上海黄金交易所可以推断,可以改善免疫功能有效地帮助宿主明确流感病毒通过增加IFITM3 mRNA表达restraint-stressed老鼠。

事实上,流感病毒并不能做出重要贡献流感引起的死亡率,但“细胞因子风暴”引发的疾病的免疫反应产生的病毒可以导致肺组织炎症反应和致命的肺组织损伤。我们的研究结果表明,上海黄金交易所的能够减少促炎细胞因子TNF -α和il - 1βmRNA水平肺部感染后5天。我们进一步发现,上海黄金交易所的阻止核NF -积累κB p65肺部。这一结果是可预测的,因为rosmarinic酸,caffeoylquinic酸,咖啡酸,上海黄金交易所中的主要有效成分,具有抗病毒和抗炎作用33- - - - - -36]。此外,isofraxidin,上海黄金交易所的另一种活性组分,有强有力的抗癌,抗疲劳,反应力的,immune-accommodating和石片效果37,38]。因此,上海黄金交易所的immunoregulating效应可以帮助保持一个很好的平衡宿主的免疫系统,这可能是病毒间隙和缓解炎症过程的关键。一些研究认为上海黄金交易所的能力在提高免疫反应是由于其抗氧化能力(11]。此外,发现抗氧化剂抑制甲型流感病毒复制和甲型流感病毒诱导炎性基因表达(39]。我们之前的研究表明,上海黄金交易所的干扰氧化应激(11]。在这项研究中,我们发现病毒引发伊诺upregulation和随后的生产是由上海黄金交易所的显著抑制治疗。此外,rosmarinic酸的抗氧化性质已经证明了它能够减少D-galactosamine所致肝损伤(40)和脂多糖(41)通过过氧化物分子的清除和抑制cyclooxygenase-2 (cox - 2)42,43]。然而,严重的流感病毒感染增加LTB4 [44]。LTB4的生产是由cox - 2 (45]。我们以前的研究表明,上海黄金交易所的可以减少从中性粒细胞释放LTB446]。我们的发现的降低促炎细胞因子(il - 1β肿瘤坏死因子-α和NF -κB)在肺部受感染小鼠的治疗通过上海黄金交易所的兼容上面。上海黄金交易所的可能作为选择性cox - 2抑制剂在流感病毒感染。

我们的研究证实,上海黄金交易所的不仅有效地降低易感性restraint-stressed流感的老鼠,但也降低了病毒诱导促炎细胞因子水平,改善肺炎。这些结果可能为反病毒研究草药做贡献。

作者的贡献

Hui-Juan曹和Rui-Rong Tan同样在这工作

确认

这项工作是财政支持的国家药物研究重点实验室(没有。SIMM1106KF-13)和广东省自然科学基金(没有。S2011040004893)。作者感谢Pro Jian-Xin陈和他的动物生物安全三级实验室在华南农业大学。他们感谢易戴博士和Ying-Hui段提供高效液相色谱指纹图谱的上海黄金交易所的研究。

补充材料