文摘
本研究的目的是调查methanolic叶提取物的保护作用罗勒属basilicuml对benzene-induced hematotoxicity瑞士白化病老鼠。GC分析和亚急性毒性水平的提取进行了测试。老鼠被随机分为三组其中II和III被暴露于苯蒸气在剂量300 ppm××6小时/天5天/周2周和组控制。第三组实验处理的叶methanolic提取的剂量100毫克/公斤体重,在无毒剂量范围。血液参数(Hb %,红细胞和白细胞计数),细胞周期调控蛋白表达和DNA碎片分析骨髓细胞。有一个upregulation p53、p21水平的差别,对这些CDK2,到,细胞周期蛋白D1和E CDK6,叶extract-treated组。DNA不分散在三组相比,第二组()。目前的研究表明的次生代谢物o . basilicuml . methanolic叶提取物,包括精油单萜香叶醇及其氧化形成柠檬醛为主要成分,在细胞周期调节效应放松管制和苯诱导的小鼠的血液异常。
1。介绍
天然产物研究已经有前途的新线索医药发展(1,2)以及新的治疗药物的来源在植物次生代谢产物,某些植物或植物组(3]。兴趣这些次生代谢物一直专注于他们的药用价值4]。单萜一直是公认的具有重要药用价值尤其是癌症细胞。单萜是无营养的膳食成分的精油中找到柑橘类水果,樱桃,薄荷和香草。他们功能的生理化学引诱物或chemorepellents [5),主要负责许多植物的独特香味。这10个碳类异戊二烯是源自于甲羟戊酸途径在植物。
许多饮食单萜抗肿瘤活性,不仅表现出能够预防癌症的形成或恶化,但也回归现有的恶性肿瘤。各种各样的饮食单萜已被证明是有效的在癌症的化学预防和化疗6- - - - - -10]。单萜的癌症抑制chemopreventive活动在推广阶段的乳腺和肝脏致癌作用可能是由于抑制肿瘤细胞增殖,加速肿瘤细胞死亡,和/或诱导肿瘤细胞分化[11]。现在,单萜化学疗法的研究进展为人体临床试验从过去十年活动。单萜还拥有许多理想chemopreventive代理的特点,即有效的抗肿瘤活性,商业可用性、成本低、口服生物利用度,和较低的毒性,使其可行的开始考虑他们的人类癌症化学预防试验。
罗勒属basilicuml .俗称坦蒂在印地语和英语“罗勒”的神圣的草药之一印度教徒在印度次大陆。和印度最古老的,最富有、最多样化的文化生活与使用相关的传统药用植物(12]。整个工厂的罗勒属basilicuml .药用价值虽然主要是树叶,有时,种子,。它有一个多才多艺的传统医学。早期的研究特别的叶子罗勒属basilicuml提供承诺生物活性成分如杀虫剂、nematocidal、抗菌、抗真菌和抗氧化剂性能(13- - - - - -16]。也用作止吐剂剂(17]。此外,最近(18),抗癌活性罗勒属basilicuml .提取及其分数是评估使用人类癌症细胞系。
苯是一种无处不在的环境化学物质引起不同类型的haematotoxicity。这是一个非常挥发性液体,与一些有机和无机成分。这些气体构成各种组件的空气中污染物,巨大的环境和人类健康的担忧。暴露在这些污染物是常见的炼油厂,油田,充气站,石化行业,汽车机械车间。良好的人类人口的百分比是直接或间接地接触到这些污染物的日常活动。一般来说,这些职业性暴露人口构成了更大的风险经常接触的19,20.]。与慢性或相关联的潜在的健康危害subchronic接触这些无处不在的污染物在环境中吸引了公众和科学界的关注。
暴露小鼠苯蒸气诱发炎症反应,氧化应激,改变细胞周期进程和DNA损伤,等等,一起被卷入各种血液疾病,包括急性髓系白血病的发展(21,22]。在这方面,benzene-exposed动物模型可以作为重要的模板environmental-occupational癌症研究对不同参数测量的临床预防干预。本研究旨在确定口腔methanolic叶提取物的应用罗勒属basilicuml有任何作用,预防benzene-induced改变在小鼠骨髓细胞周期进程。
2。材料和方法
2.1。植物材料收集
新鲜的叶子罗勒属basilicuml .收集从药用和芳香植物花园,Kalyani大学植物学系Kalyani,印度,2011年8月,位于22°57′N纬度,经度88°22′E平均高度9.75米高于平均海平面。证实了植物材料的分类识别博士g . g . Maity教授分类,分类和植物系统的单位,植物学,Kalyani大学。凭证标本(PDG /机器人。136)是沉积和保存的植物学、Kalyani大学Kalyani,印度为参考。
2.2。其他材料
的主要抗体特定的细胞周期蛋白D1,细胞周期素E, CDK2,到,CDK6, p21 / Cip1、p53和肌动蛋白和二次抗体购自圣克鲁斯生物技术有限公司(圣克鲁斯、钙、美国)。所有其他化学物质用于我们的实验均为分析纯。收集到的亚急性治疗组血液用于血清生化参数的估计是血清谷氨酸草酰乙酸转氨酶(血清),血清谷氨酸丙酮酸氨基转移酶(血糖),血清碱性磷酸酶(ALP)、血清总胆固醇、总蛋白质、尿素、尿酸、肌酐和内容用试剂盒(跨度诊断,苏拉特,印度),制造商的指示。
2.3。实验动物
六到八周大的瑞士白化雄性老鼠(亩骶)从认为供应商购买定期从保持压力,被安置在一个不锈钢丝笼(Tarsons、印度)12小时的光暗周期和维护。颗粒的饮食(西孟加拉邦日记和家禽发展集团有限公司Kalyani工业区,Kalyani)随意除了每天6小时期间的苯吸入。水供应随意在研究自动通过油管。
苯(默克公司、印度)蒸汽被加热液体苯生成16°C和进入吸气室。实验小鼠的组织暴露300 ppm,苯为6小时/天,5天/周2周在1.3 m3吸入腔(S.B.设备、白平衡、印度)和一个对照组被暴露在环境空气同样的时间,间隔时间。苯浓度监测,钱伯斯半个小时。间隔期间的日常接触。室的温度和湿度自动维护°C和,分别。这种动物可以作为模型benzene-exposed haematotoxicity和白血病生成导致继发性急性粒细胞白血病(未发表的数据)。
2.4。植物提取物的制备
次生代谢物,包括类黄酮和其他酚类化合物,从干树叶中提取的罗勒属basilicuml .收集植物材料在阴影和地面干一个磨床2毫米直径的网格。干和粉植物材料(100 gm)提取先后使用500毫升的甲醇(1:5 w / v)通过使用索氏提取器24小时温度不超过沸点的溶剂23]。的提取使用绘画纸滤纸过滤(1号),然后集中在真空用旋转蒸发器在40°C。获得的残留物被存储在深色玻璃瓶−20°C在气密容器进行进一步的测试。油的产量计算基于干体重的植物材料。
2.5。gc - ms和GC-FID分析
gc - ms分析精油进行了惠普(hewlett - packard)气相色谱仪,型号6890,配备一个支撑材,使用HP-5MS毛细管柱(30米长×0.25毫米。d×0.25美国安捷伦科技膜厚度)。注射器被设定在250°C和探测器在280°C,分别。烤箱的温度色谱从60°C到280°C,分别在10°C的加热速度/分钟然后等温地关押了5分钟。喷射器的体积是1.0l .溶剂延迟2分钟,注入的分流比1:10。氦用作载体在15身分进气压力。精油成分被确定比较的GC保留指数(RI)和质谱与真实的标准化合物。量化的相对数量的单个组件执行根据面积百分比法。
2.6。植物提取物的亚急性毒性研究
原油methanolic叶提取物对其毒性进行评估o . basilicum未感染男性l .瑞士白化小鼠年龄在6至8周,重22 g。的毒性测试提取、30十动物的老鼠被随机分为三组(5个男性和女性)每笼。之前的口服剂量,一到两小时的小鼠禁食(24]。然后提取被溶解在蒸馏水和管理日常口头填喂法老鼠,第二和第三组和对照组(我)接收相应体积的蒸馏水(车辆),29天。第二组的小鼠口服的提取o . basilicuml的剂量50毫克/公斤,和老鼠在第三组提取的剂量1500毫克/公斤体重。然后,老鼠观察治疗后连续一个人力资源;断断续续四小时,然后经过一段29天。总行为变化的老鼠发现,外套条件下,放电,运动,体重变化,血清生化参数,血液参数,和死亡率30天测试亚急性毒性。
2.7。血液参数
与植物提取物治疗完成后,进行了动物在一夜之间迅速和牺牲斩首和血液收集的30天。血液中血红蛋白浓度(g %)决心使用沙利的血红蛋白计和总白细胞和红细胞数使用纽鲍尔的血细胞计数器25]。其他血液参数包括血小板计数、微分项单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等差异的红细胞比容、MCV、妇幼保健、MCHC进行。
2.8。骨髓抽样
牺牲了实验小鼠股骨骨的解剖和近端和远端被结束。磷酸盐缓冲溶液的pH值7.2轻轻注入轴的一端。这个过程又通过另一端排出骨髓成一组船准备单独的细胞悬液在一小时内停止苯吸入。
2.9。免疫印迹
蛋白质提取的骨髓被用单独准备用5种不同的动物股骨骨髓细胞在细胞裂解缓冲含有20% SDS, 2毫米phenylmethyl磺酰氟,磷酸和蛋白酶抑制剂/抑制剂(26]。蛋白质含量是量化使用布拉德福德方法(27]。从骨髓蛋白质提取物(15p21和10 gg为其他)变性,受到12% (W / V)的sds - page,然后转移到PVDF膜。经过孵化阻断特异性的结合位点与5%的脱脂奶粉和0.1%的渐变膜20三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐(ttb, pH值7.4)1小时在室温下,一夜之间,细胞膜被孵化在4°C稀释主要抗体的存在。膜被洗ttb孵化和1:2000年辣根过氧化物酶共轭二次抗体在室温下为50分钟。乐队形象化,细胞膜受到检测试剂1分钟。带密度测量使用一个图像分析仪(图片J, NIH)。
2.10。DNA碎片分析
DNA从骨髓中提取单个细胞制备(如前所述)使用试剂和协议提出了班加罗尔Genei(π。没有:KT23)。使用分光光度计DNA浓度为260 nm(瓦里安,德国)。DNA提取被接受使用1 x TAE缓冲0.8%琼脂糖凝胶电泳运行缓冲(Tris-acetate组成:40毫米,1毫米EDTA)和溴化乙锭(最终浓度为0.5凝胶g / mL)作为染色剂。5L 100个基点的DNA阶梯加载到一个在每一个试验。最后,使用凝胶凝胶可视化和拍摄文档系统(Genei图像系统)。
2.11。治疗Benzene-Exposed小鼠原油Methanolic叶提取物
因为没有毒性的植物提取物的迹象被发现在低收入和高剂量的植物extract-treated集团benzene-exposed老鼠处理提取的剂量100毫克/公斤体重口服苯暴露的日期开始的每天4周。对照组小鼠接受各自的体积的蒸馏水含有10% DMSO遵循同样的时间表。治疗期间,老鼠提供颗粒状饲料和水随意(表1)。
2.12。道德的间隙
在这项研究中使用的协议是动物伦理委员会批准,大学生态学系Kalyani(委员会为目的的控制和监督实验动物,印度)。
2.13。统计分析
双尾的学生t以及做决定的意义差异benzene-exposed和植物叶子extract-treated组,对照组。差异视为意义的水平。
3所示。结果与讨论
3.1。精油的o . basilicuml .叶子
简单的定量分析原油methanolic提取精油的成分,显示出了非凡的变化o . basilicum从西孟加拉邦l。精油的产量获得干燥的叶子o . basilicuml . 1.77% (w / v)和主导或样品的主要成分是香茅醇、柠檬醛总数的34.89%到23.51%不等的油(表2,图1)。尽管甲基胡椒酚,芳樟醇,甲基肉桂酸,丁香酚,丁香酚,和香叶醇油的主要组件是否会不同的o . basilicuml . (28- - - - - -30.]。石油成分的变化可以归因于不同的土壤条件和高度。这是观察到,芳樟醇,香叶醇是主要的组件罗勒属basilicuml .从孟加拉国和作者得出的结论是,石油成分可能依赖于气候条件(31日]。在目前的研究中,我们的研究结果表明,香叶醇、柠檬醛和的主要成分o . basilicuml在西孟加拉邦的条件。观察到的变化可能是由于不同的环境和遗传因素和植物的营养状况以及其他因素会影响石油成分。
3.2。评价植物提取物的无毒性
物理化学观测记录来确定潜在的毒性作用注入植物的动物。没有行为变化等不利影响,外套条件改变,放电和运动异常被认为对第二组和第三组的动物。没有老鼠被发现死于体重的研究和无意义的变化,血清生化参数和血液参数(表3由于正常生长的动物)。所以,选择剂量的植物提取物是无毒的。
3.3。植物材料逮捕Benzene-Induced细胞周期放松管制
减少表达细胞周期调控蛋白p53、p21等被卷入benzene-induced hematotoxicity小鼠(26]。根据我们的研究结果,我们推测,植物提取物可能对细胞周期调控蛋白调节的影响。如图2很明显,细胞周期蛋白(细胞周期蛋白D1, E)的表达水平,CDK2,到,CDK6 benzene-induced老鼠相比,控制老鼠相当高。然而,治疗小鼠benzene-induced的物质苯接触后导致抑制细胞周期蛋白(细胞周期蛋白D1, E)的表达水平,CDK2、到和CDK6相比之下,从参与小鼠获得的蛋白质。Cip1 / p21水平,这是一个普遍的抑制剂细胞周期进展,是转录激活p53苯暴露后(26,32]。治疗的植物材料导致增强benzene-exposed p21水平和p53的老鼠相比,参与苯暴露小鼠。
小鼠暴露于苯影响细胞周期调控骨髓和血液。监管cyclin-CDK复合物在细胞周期进程中发挥着关键作用不同阶段CDKs的负面由一组功能相关的蛋白质称为CDK抑制剂,如Kip / Cip家庭成员(33- - - - - -35]。p21 p21通用CDK抑制剂,抑制DNA复制过程(36,37),而p53是调节抗增殖信号的反应。与这些报告一致,methanolic叶提取物治疗导致了upregulation p53、p21和显著降低到和CDK6,细胞周期蛋白D1,和适度降低CDK2水平和细胞周期素E与hematotoxicity benzene-induced动物,这可能引起细胞周期阻滞主要在造血细胞G2期。因此,它可以建议调制在细胞周期进展和抑制细胞增殖的可能机制之一可能是叶提取物抑制细胞周期benzene-induced放松管制。
3.4。血液参数
结果见表4表明,红细胞的数量、白细胞和Hb (g %)一直在减少benzene-exposed组相对于对照组的动物。Hb (g %),红细胞和白细胞下降到9.96±1.3,2.11±0.19,3.28±0.45,分别。治疗后benzene-exposed老鼠的植物叶子上提取上述参数显著增加()和达到的价值,,,分别。这个结果也符合超表达p21在植物extract-treated动物群体免疫印迹分析所示。白细胞总数、淋巴细胞数显著增加(与植物提取物)治疗后。Hct RBC差异也显著增加()治疗后(表5)。
血液参数分析与风险评估相关的血液系统毒性的预测价值更高的人类(91%)当试验涉及啮齿动物和nonrodents (38]。血液是一个重要的生理和病理状态指数在人类与动物和通常的参数测量血红蛋白,红细胞(RBC)和白细胞(WBC)计数(39]。苯的hematotoxicity erythromyelopoiesis特点是抑制,导致大萧条的白细胞(主要淋巴细胞计数)和外周血红细胞水平(32,40]。这个结果也依照p21的过度免疫印迹分析(图所示2)。但治疗后的植物材料,减少血液参数被发现。
3.5。DNA碎片分析
如图3,DNA碎片分析骨髓细胞凋亡的特征很明显的苯接触后发现老鼠和它被分散在methanolic叶提取物治疗组少。数据同步与细胞周期调节激酶的结果。
4所示。结论
总之,保护植物次生代谢物是目前一个重要的战略控制的过程包括hematotoxicity各种疾病。因此,有必要探索药用植物或其他自然的代理可以对hematotoxicity保护剂。在目前的工作,我们的结果显示methanolic叶提取物的重要活动罗勒属basilicuml对benzene-induced hematotoxicity老鼠。这些提取可能促进chemopreventive活动在人类。在以上的基础上的证据,有可能是单萜香叶醇、柠檬醛、丁香酚,在提取可能负责这个活动。然而,这种说法要求广泛研究协同药效学相互作用的植物化学物质以及对信号调制的影响都是至关重要的,供multiactive天然药物的开发罗勒属basilicuml在不久的将来癌症化学预防。
确认
作者承认金融支持从大学拨款委员会(UGC),新德里,印度政府和科学工业研究理事会,新德里,印度的政府。他们也感谢DST-FIST计划,印度政府,植物学和动物学,Kalyani大学仪器设备。没有利益冲突有关的主要兴趣以及次要利益提到作者在研究领域的研究和出版。