文摘
Danggui-Shaoyao-San (DSS),一个著名的中国草药配方,已广泛应用于各种疾病的治疗。以前的研究已经表明DSS在啮齿动物产生的抗抑郁效果。本研究旨在调查机制(s)潜在的DDS的抗抑郁作用。结果表明,DSS治疗引起显著reserpine-induced上睑下垂的老鼠。此外,DSS治疗慢性不可预知的压力显著增加蔗糖消费——(CUS)治疗的老鼠。DSS治疗也明显减弱CUS-induced减少在老鼠大脑的去甲肾上腺素和多巴胺的浓度。此外,DSS治疗显著逆转CUS-induced增加血清丙二醛(MDA)含量和降低小鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果表明DSS的抗抑郁活性可能是由中枢单胺神经递质系统的调制和减少氧化应激。
1。介绍
抑郁症是一种常见的精神疾病影响许多人的生活质量。根据世界卫生组织的最新数据,抑郁有望成为第二个2020年疾病残疾的主要原因。人们普遍认为,等单胺神经递质5 -羟色胺(5)、去甲肾上腺素(NA)和多巴胺(DA)参与抑郁症的发病机理,和大多数抗抑郁药物发挥他们的行动提升单胺神经递质浓度(1,2]。氧化应激,这被定义为一个扰动之间的平衡的生产活性氧(ROS)和抗氧化防御系统,也已被证明能够在神经精神疾病的发病机制中发挥作用(3,4]。此外,临床前研究表明氧化应激的抑制作用可能导致某些抗抑郁药物的治疗效果5- - - - - -8]。
Danggui-Shaoyao-San (DSS)是传统的草药广泛使用在中国,日本和韩国。DSS,草药配方,首先被记录在“JinKuiYaoLue”,它由六个草药(表1)。传统草药药物是用来缓解痛经和其他腹痛的女性(9]。最近,一项临床研究表明,DSS是有效的治疗失眠(10),这是一种症状和抑郁的预测11]。临床前研究表明,DSS具有抗氧化、抗血栓形成的,认知增强和神经保护作用[9,12,13]。此外,以前的报告建议DSS治疗可以显著减少小鼠强迫游泳测试(静止时间14]。草药制剂也有效改善慢性应激行为改变老鼠,这是与中央精氨酸加压素系统(14]。然而,DSS的抗抑郁效果的作用机理还没有完全阐明。在这项研究中,我们的目标是探索不同的antidepression机制DSS的调查对单胺神经递质系统的影响。此外,DSS对大脑的影响单胺能的神经递质和血清抗氧化状态检查在抑郁症的动物模型15,16]。
2。材料和方法
2.1。DSS的准备
DSS的生药都购自浙江省中医医院(浙江省,中国)。他们识别和验证副教授KR。陈,药学院,浙江中医药大学,凭证标本(100925号)被保留。水提物的DSS准备如下程序口等。12]。总之,六个药材被混合比例和浸渍1 h和8个卷的蒸馏水,然后“煮1.5 h。接下来,冷却提取过滤。提取过程重复两次。提取的分数是汇集和集中使用旋转蒸发器。的产量提取基于干重29.32%。DSS提取包含1.43%的芍药苷的高效液相色谱分析(图1)。高效液相色谱分析条件如下:水域Nova-Pak C18高效液相色谱柱(4.6×250毫米)是用于分离。是通过一个权力平等主义的洗脱分离流动相由乙腈和0.04%磷酸(16:84年,v / v)在1.0毫升/分钟的流量。洗出液的监控是一个二极管阵列检测器波长230纳米。
2.2。化学试剂
5 -羟色胺(5 -)、去甲肾上腺素(NA)和多巴胺(DA)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州)。芍药甙购买从国家控制药品和生物制品研究所(中国,北京)。其他试剂分析成绩在中国制造。
2.3。动物
雄性ICR小鼠体重20 - 25 g从实验动物获得服务中心、浙江中医药大学、杭州、浙江。动物分别保持在12 h光/暗周期(灯在凌晨6点。,lights off at 6:00 p.m.) under controlled temperature conditions (22 ± 2°C) and given standard food and water随意。他们被允许适应使用前七天。所有实验的指导方针符合“实验动物保健原则”(NIH出版物编号为80 - 23,1996年修订)和中华人民共和国的法律对实验动物的使用和护理。实验动物实验伦理委员会批准的协议是浙江中医药大学。努力是动物的数量和痛苦降到最低。
2.4。在老鼠身上的逆转Reserpine-Induced下垂
动物被随机分配八个人分成5组:对照组(生理盐水),控制+ DSS-H组(3 g / kg),利血平+汽车集团(生理盐水),利血平+ DSS-L组(1.5 g / kg),和利血平+ DSS-H组(3 g / kg)。DSS和生理盐水intragastrically七天每天上午九点半到十点半。本研究中使用的剂量选择的基础上,徐et al。14和我们的初步测试。60分钟后过去的剂量,利血平组小鼠腹腔注射利血平2.5毫克/公斤。上睑下垂的程度的记录每只动物注射利血平后60分钟。评估的上睑下垂,老鼠被放置在架子上(20厘米以上板凳上)。上睑下垂的程度被评为根据以下评定量表:0,睁大眼睛;1、封闭的四分之一;2,关闭了一半;3,四分之三关闭;4,完全封闭的17]。
2.5。慢性不可预知的压力(CUS)
小鼠随机分为四组八个人:对照组,CUS +汽车集团(生理盐水),他因+ DSS-L组(1.5 g / kg),和CUS + DSS-H组(3 g / kg)。CUS过程进行描述的由毛et al。6),轻微的修改。短暂,老鼠强调组单独居住和暴露于以下压力每天一次21天:24小时食物不足,24小时水不足,7 h笼倾斜(45°),24小时接触外国对象(例如,一块塑料),1分钟尾夹(1厘米的尾巴),21 h脏笼(200毫升水100年g锯末床上用品),和夜间照明。DSS和生理盐水intragastrically 30分钟前每天每个压力一次21天。控制(轻)动物原状除了常规笼清洗等必要的程序。
2.6。蔗糖偏好测验
蔗糖偏好测试进行了1天,因为从9点半开始。如前所述的方式进行试验(18与一些细微的修改。简单地说,72 h在测试前,老鼠训练适应1%蔗糖溶液(w / v):两瓶1%蔗糖溶液被放置在每个笼子里,和24 h后1%蔗糖在一瓶自来水取代24 h。适应后,小鼠的水和食物被剥夺了12 h,其次是蔗糖偏好测试,免费获得小鼠两瓶含100毫升1%的蔗糖和100毫升的自来水,分别。1 h后,大量的蔗糖溶液和水的消耗记录,和蔗糖的偏好是计算使用以下公式计算:
2.7。血液和组织收集
24小时后行为测试(CUS)后2天,上午09:30至11:30,老鼠被斩首牺牲获得静脉血样在冰上。不同组的老鼠用于每个时间点。血清被离心分离的4000克10分钟在4°C和存储−80°C到化验。血液采集后,他们的整个大脑很快被删除,在液态氮冷冻和储存在−80°C到化验。
2.8。单胺神经递质水平的测量
大脑5 - NA,用高效液相色谱检测和DA水平加上电化学检测方法如前所述[19]。短暂,每个冷冻组织样本是200年由声波降解法均质Al 0.4高氯酸(解决方案),匀浆被保存在冰1 h然后离心机在12000 g (4°C) 20分钟。颗粒被丢弃。160年一个整除μ上层清液添加到80 LμL的解决方案B(包含0.2 M柠檬酸钾,磷酸氢二钾0.3,和0.2 EDTA)。混合物被保存在冰1 h然后离心机在12000 g (4°C) 20分钟了。二十μ合成的L上层清液直接注入ESA液相色谱系统配备了反相C18柱(150 4.6毫米身份证,5μ米)和电化学检测器(ESA CoulArray Chelmstord,妈,美国)。探测器可能被设定为50,100,200,300,400,和500 mV,分别。125毫米的流动相由柠檬柠檬酸acid-sodium (pH值4.3),0.1毫米EDTA, 1.2毫米octanesulfonate钠,16%甲醇。流量为1.0毫升/分钟。5、NA和DA的识别和量化是通过比较他们的保留时间和峰面积的标准解决方案。5的内容,NA, DA表示为ng / g湿重组织。
2.9。测量MDA和SOD活性水平
血清MDA水平决定通过测量硫代巴比土酸反应物质(20.]。血清SOD测定基于其抑制oxymine的氧化能力2−由黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统(21]。蛋白质含量是由Coomassie蓝蛋白结合22)使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准。测量是生产指令的详细程序在不同的试剂盒(南京建成生物工程研究所、中国)。
2.10。统计分析
数据表示为±SEM手段。之间的显著差异意味着进行使用单向方差分析(方差分析)其次是Dunnett测试。时被认为是显著不同。
3所示。结果
DSS在老鼠reserpine-induced上睑下垂的效果得到了表2。单向方差分析显示显著差异之间的平均评分上睑下垂组(,)。治疗动物DSS-H没有提供任何重大变化的平均评分上睑下垂控制相比。注射利血平导致显著增加的平均得分上睑下垂的动物()与控制。治疗动物DSS-L或DSS-H显著下降的平均分数reserpine-treated小鼠眼睑下垂(和、职责)与reserpine-treated控制。
DSS的百分比的影响蔗糖消费CUS-treated老鼠在图中给出了2。单向方差分析显示显著差异在蔗糖中消费群体的比例(,)。21天CUS曝光的比例显著降低蔗糖消费的动物()与控制(即。non-CUS-treated老鼠)。长期治疗DSS-H消费显著增加蔗糖的百分比CUS-treated老鼠()与CUS-treated控制。
DSS对大脑的影响在CUS-treated小鼠单胺神经递质水平表3。单向方差分析显示5 -的浓度存在显著差异,NA, DA在老鼠大脑中组(,,,,,、职责)。21天CUS曝光显著降低5 -的浓度,NA, DA在老鼠大脑(,,、职责)与对照组相比。DSS-H治疗显著增加钠的浓度和DA CUS-treated老鼠的大脑(和、职责)与CUS-treated控制相比,虽然DSS治疗没有对大脑5 -浓度产生显著的影响。
DSS的影响在CUS-treated小鼠血清抗氧化状态图3。抗氧化状态评估通过测量(图MDA水平3(一个))和SOD活性(图3 (b))。单向方差分析显示显著差异在MDA和SOD活性水平组(,,,、职责)。21天CUS曝光MDA水平显著增加()和降低SOD活性(相比)与控制。DSS-L或DSS-H治疗显著增加SOD活性在CUS-treated老鼠(和、职责)与CUS-treated控制。DSS-H治疗CUS-treated老鼠也显著降低MDA水平()与CUS-treated控制。
(一)
(b)
4所示。讨论
几个已经提出假设抑郁症的病理机制。抑郁症的早期的假说,即单胺假说,认为抑郁症的主要症状是由于大脑的功能缺陷单胺神经递质如5 - NA和/或DA (23]。符合这一观点,药物是通过增加生物利用度的脑单胺神经递质,如三环类抗抑郁药、选择性5 -羟色胺再摄取抑制剂,和单胺氧化酶抑制剂,广泛应用于临床抑郁症治疗(24]。reserpine-induced抑郁动物模型是基于单胺假说的萧条。利血平可以不可逆地抑制疱疹吸收类,包括去甲肾上腺素、多巴胺和5-hydroxytrytamine。因此,上睑下垂和低体温单胺类缺失观测到的商店(25,26]。引起这些症状可以通过抗抑郁药物的主要类。在这项研究中,预处理小鼠与DSS 7天明显引起了reserpine-induced上睑下垂,这表明DSS的抗抑郁作用可能是通过中枢单胺能的神经递质系统介导。
一些研究显示,客户可以诱导行为和生理变化类似于临床抑郁症的症状(8,15,16,27- - - - - -29日)和CUS-induced抑郁症模型可以用于评估通过蔗糖偏好测验(抗抑郁药的疗效8,16,19,27- - - - - -29日]。蔗糖偏好测试anhedonia-like行为改变的指标(16]。快感缺乏,抑郁症的核心症状,被诱导减少响应建模奖励反映在减少消费和/或偏爱甜的解决方案(16]。本研究的结果表明,小鼠接受21天时间内CUS消耗更少的蔗糖溶液相应的老鼠相比,在长期治疗DSS显著抑制这种行为改变。虽然我们没有使用常规抗抑郁积极控制在这项研究中,CUS-induced抑郁模型通常被认为是最有价值的和稳定的抑郁模型动物和已成功建立在我们先前的研究[6,18]。
进一步研究DSS的antidepression机制,DSS的影响在CUS-treated小鼠单胺神经递质系统进行了研究。我们的研究结果表明,CUS引起显著减少5,NA,老鼠大脑的DA水平是一致的与其他研究[30.- - - - - -34),而DSS治疗显著增加钠的浓度和DA,但不是5,CUS-treated老鼠的大脑。此外,之前的报告表明,DSS增加正常小鼠的大脑中单胺神经递质水平以及年龄小鼠(12,35]。这些结果表明,DSS的抗抑郁效果可能与单胺神经递质系统,特别是NA和DA系统。
最近的研究表明,活性氧(ROS)也在抑郁症的发病机理中发挥作用3,4]。先前的研究已经表明,慢性应激导致显著增加活性氧的生产(36]。过多的活性氧会导致损害的主要细胞内大分子,包括脂质,蛋白质,核酸,最终在神经功能障碍和抑郁8,37]。MDA,产生的脂质过氧化作用的产物,在氧化应激。它表明等离子体膜的氧化损伤和合成硫代巴比土酸活性物质,是脂质过氧化和氧化剂的压力成正比38]。据报道,脑MDA水平显著增加在啮齿动物暴露于慢性压力,可以逆转的抗抑郁药(6,7,36,39]。有一个内在的抗氧化防御系统在细胞清除ROS,防止细胞损伤。草皮,一个最重要的抗氧化酶,已经被证明可以直接催化过氧化物和过氧化物无毒物种的转换(40]。先前的研究已经表明,慢性应激引起的啮齿动物的大脑SOD活性明显降低,而抗抑郁药物治疗恢复SOD水平被发现(5,36]。一致,目前研究表明,21天CUS造成的氧化应激显著增强,MDA的特点是过度生产和降低SOD活性。然而,DSS治疗减毒CUS-treated老鼠,这些变化表明DSS的抗抑郁作用可能与其抗氧化活性相关。
它已经表明,氧化的单胺神经递质单胺氧化酶可能导致增加激进的负担(41,42]。另一方面,ROS可以调节突触传递,从而减少DA释放(39]。上述结果表明单胺氧化与生产过剩的活性氧在抑郁症的发病机制。有人建议,抗氧化剂是介导的抗抑郁效果通过单胺能的系统(43]。本研究还建议单胺系统和氧化应激的相关性CUS-treated老鼠。这一发现与先前的研究是一致的(5,6,44]。
总之,DSS的抗抑郁效果可能由中央单胺能的神经递质系统的调制和氧化应激的抑制作用。进一步调查之间的交互组件上草药的DSS是十分必要的。
承认
这项研究得到了浙江省高级创新卫生人才的培养计划(黄授予z)。