文摘
导致糖尿病周围神经病变的机制是复杂的,没有有效的药物治疗。一些中药的活性成分,葫芦巴碱对糖尿病和高脂血症有有利影响。葫芦巴碱的保护作用和机制在糖尿病周围神经病变进行评估在链脲霉素-和高碳水化合物/脂肪食源性糖尿病大鼠。老鼠分成四组结束时2周:控制,糖尿病,糖尿病+葫芦巴碱(40毫克/公斤),和糖尿病+ sitagliptin(4毫克/公斤)。项为期48周的治疗后,神经传导技术,冷和热浸试验,透射电子显微镜,实时聚合酶链反应和免疫印迹。血清葡萄糖、血清胰岛素、胰岛素敏感性指数、脂质参数,体重,坐骨神经传导速度,痛觉过敏,glucagon-like peptide-1受体信使rna和蛋白质,道达尔和磷酸化p38增殖蛋白激酶蛋白表达,malonaldehyde内容,和超氧化物歧化酶活性改变糖尿病老鼠,和附近的控制水平葫芦巴碱处理。轻微micropathological存在trigonelline-treated糖尿病大鼠坐骨神经的变化。这些发现表明,葫芦巴碱对糖尿病周围神经病变有利影响通过glucagon-like peptide-1受体/ p38增殖蛋白激酶信号通路,神经传导速度,抗氧化剂酶活性,改善micropathological坐骨神经的变化,减少脂质过氧化作用。
1。介绍
糖尿病的常见并发症,糖尿病周围神经病变(DPN)影响可能多达三分之一的成人糖尿病患者(1]。DPN的最常见的形式是一个感官和感觉异常等症状多神经病,不懈的疼痛(痛觉过敏),降低温度和振动感知阈值。临床试验没能证明任何药物治疗的有效性在稳定或改善神经功能,只有疼痛症状治疗方法与变量功效是可用的(2]。首先,治疗DPN的中心控制患者的血糖水平。如今,治疗DPN的唯一代理标签包括5%利多卡因补丁,度洛西汀,加巴喷丁和普瑞巴林。尽管这些药物临床使用,成功治疗DPN仍然是一个挑战(3]。从致病DPN的复杂性,主要机制为目标的新治疗干预导致神经损伤对未来治疗的并发症至关重要。
最近,糖尿病医疗行业有相当大的兴趣对于补充和替代方法,包括通过识别自然神经成分从中草药取代合成的4,5]。正如我们最近审查(6),葫芦巴碱,几个能治疗糖尿病的中药的主要成分的影响(7,8),有低血糖症的影响在大鼠(9- - - - - -12)和人(13,14),抗氧化效果在体外(15,16]。最近我们实验室的研究表明,糖尿病葫芦巴碱有有益的影响通过降低血糖和血脂水平,提高胰岛素敏感性指数和胰岛素含量,上调抗氧化剂酶活性,降低脂质过氧化作用[17]。葫芦巴碱也是的主要组件之一紫茉莉l .根具有潜在的胰岛素敏感性和降糖和降血脂药对糖尿病的影响18]。
内源性glucagon-like peptide-1 (GLP-1)是一种insulinotropic肽合成和分泌L-cells食物摄入量的胃肠道反应。当考虑到体内,glp - 1在2型糖尿病患者,改善glucostasis主要通过刺激内源性胰岛素分泌。GLP-1和相关肽具有神经功能包括神经营养和神经保护作用,除了glucoregulatory和能量平衡功能(19]。Dipeptidyl肽酶IV抑制剂抑制降解的GLP-1 Dipeptidyl肽酶IV酶。几个研究表明,GLP-1和dipeptidyl肽酶IV抑制剂,如Exendin-4 vildagliptin,提供保护实验DPN [20.- - - - - -24]。GLP-1受体刺激保持初级皮层和多巴胺神经元的细胞和动物模型中中风和帕金森症(25]。周围神经的糖尿病啮齿动物功能GLP-1R和GLP-1R-mediated ERK-signaling糖尿病啮齿动物保护大型电动机的坐骨神经纤维功能和机制的独立小C纤维结构的血糖控制(26]。糖尿病能激活p38 MAPK在神经组织中两大鼠(27)和病人和抑制p38 MAPK的有利影响与神经功能(28]。但功能GLP-1R-mediated p38增殖蛋白激酶(MAPK)信号通路在DPN仍然是未知的。
使用上面的背景下,本研究系统地研究葫芦巴碱的有益作用在低剂量链脲霉素的周围神经病变和高碳水化合物/脂肪食源性糖尿病老鼠,神经传导技术,冷和热浸试验,透射电子显微镜,实时聚合酶链反应和免疫印迹。效果是与一个标准的降糖药物相比,dipeptidyl肽酶IV抑制剂,sitagliptin。
2。材料和方法
2.1。实验动物
雄性Wistar鼠,重180 - 220克,买来外科研究所实验动物中心,培育在特定的无菌状态。所有实验动物实验伦理委员会批准,新桥医院、第三军医大学。所有的动物分别住在笼子里(一个鼠笼)。老鼠被允许标准饮食和饮料随意和适应的实验条件°C,湿度%固定12 h人造光周期为一个星期。
2.2。化学药品和试剂
葫芦巴碱盐酸盐(葫芦巴碱,纯度100%)从Sigma-Aldrich带来贸易有限公司,有限公司,美国。Sitagliptin磷酸(Sitagliptin Januvia)是由默克制药、白宫站,新泽西,美国。链脲霉素和β肌动蛋白多克隆抗体被从西格玛化学品,圣路易斯,密苏里州,美国。兔多克隆抗体GLP-1R和总和磷酸化p38 MAPK从圣克鲁斯,带来美国。胰岛素放射免疫检定法工具包提供的北京北生物技术研究所,中国。血红蛋白的包(Hb)、总胆固醇、甘油三酯、超氧化物歧化酶(SOD), malonaldehyde,和蛋白质测定得到的从南京建成生物工程研究所,中国。其他化学试剂均为分析纯试剂级商业来源。
2.3。诱导糖尿病和药物治疗
四个处理组定义:控制、糖尿病、糖尿病+葫芦巴碱,和糖尿病+ sitagliptin。糖尿病是由低剂量链脲霉素诱导治疗(35毫克/公斤,i.p。)和高碳水化合物/高脂肪饮食(70%标准饮食,12%猪油、9%蛋黄粉、白糖和9%种植园)(29日]。动物的空腹血糖水平高于16.7 L更易被用作糖尿病的两周后注射链脲霉素。葫芦巴碱(40毫克/公斤),sitagliptin(4毫克/公斤)涨跌互现日常车辆组成的标准饮食对糖尿病动物48周。标准饮食或高碳水化合物/高脂肪饮食得到了只有在车辆完全摄入的动物。每组中有10个老鼠。动物体重测量每2周在整个实验过程中,药物剂量相应调整。空腹血糖水平测量每8周记录糖尿病的持久性。8 h后迅速,尾巴一滴血液分析使用标准Glucometer (OneTouch;LifeScan Inc .、苗必达,CA)。
2.4。冷浸渍试验和热浸试验
动物受到冷浸渍试验(10°C)和热浸渍试验(45°C),这是老鼠尾巴的浸没在水中保持在提到的温度,然后尾巴轻轻延迟或观察斗争的迹象。截止时间是15秒(30.]。
2.5。神经传导研究
神经传导速度(NCV)记录(如前所述)(31日,32]。坐骨神经,记录电极(广告工具,PowerLab / 16 sp)被放置在脚的背部,膝盖和刺激电极和切迹。腓肠神经,阳极被放在第三个脚趾的脚,和阴极放在脚的脚跟。阴极和阳极被放置5毫米。两个10赫兹的频带是包容性的肌肉潜在录音(顺行的、运动)和10 2赫兹潜在录音(逆行的感觉)。
2.6。组织收获
药物治疗48周后,大鼠被ip戊巴比妥钠麻醉(60毫克/公斤),打开腹腔。在门静脉插管插入和门户血样中收集管包含dipeptidyl肽酶IV抑制剂(10毫升/ mL, ADL研究、圣芭芭拉分校,美国)通过门静脉血液样本(50μL)是用于测量Hb。血液样本被允许凝块得到的血清储存在−70°C的评估GLP-1(7-36)酰胺和其他生化参数。老鼠然后立即死亡和组织是收获如前所述[33,34]。左侧坐骨神经解剖和迅速沉浸在液态氮冷冻的基因和蛋白表达分析。右侧坐骨神经解剖,立即和部分浸在冰冷的抗氧化剂缓冲区,迅速被浸泡在液氮冻结,并存储在量化−70°C;其他部分被固定为透射电子显微镜。
2.7。基因表达
冷冻组织的总RNA提取使用RNA从工具包。互补DNA合成互补脱氧核糖核酸合成装备。实时PCR测定使用执行个体的cDNA SYBR绿色染料来衡量双螺旋DNA形成ABI棱镜7500序列检测系统(应用生物系统公司,培育城市,CA)、规范化的β肌动蛋白的RNA,并分析方法(35]。GLP-1R被使用的特定PCR引物:5′tga ACC TGT TTG猫有条件现金援助TCA-3′, 5′法TGG CAA GCC TGC ATT TGA-3′(加入。NM_021332)所描述的36]。
2.8。通过免疫印迹蛋白质表达
免疫印迹分析进行了我们之前报道37]。对于每个实验样本在重复运行。微密度分析的图像是由Image-Pro + 6.0(美国媒体控制论,银泉)。
2.9。等离子体生化参数测量
乙肝、血清总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)测量了日立7170全自动生化分析仪(日立、日本)使用商业套装,分别。GLP-1内容确定,血液被卷入肝素化管包含EDTA和dipeptidyl肽酶IV抑制剂(抑制退化glp - 1在血清dipeptidyl肽酶IV酶的存在),放射免疫检定法(北京gersion生物技术有限公司,中国)(20.]。SOD活性化验的方法Kakkar et al。38]。Malonaldehyde德雷伯和哈德利的方法估计的内容(39]。血清胰岛素浓度是衡量商业工具根据制造商的指示。胰岛素敏感性指数=日志(1 /空腹血浆葡萄糖×血清胰岛素)。
2.10。Micropathological测量
透射电子显微镜,3 - 4毫米长度不同组的大鼠坐骨神经的获得和固定在2%戊二醛(pH值7.3)0.1 mol / L磷酸缓冲盐在4°C。标本被固定在2%锇酸(0.1 mol / L),通过一系列分级的丙酮脱水,嵌入在环氧树脂。1微米的部分被切割,然后用甲苯胺蓝染色。合适的超微结构研究领域选择检查后1μ部分(70 - 80 nm),被削减的LKB-5超微切片机(瑞典)使用钻石刀和部分是安装在一个铜网格和沾雷诺兹醋酸双氧铀及柠檬酸铅(40]。他们为使用透射电子显微镜检查、拍照(日立- 7500,由日立、日本)。
2.11。统计分析
数据表示为的意思SD。所有的分组数据统计与SPSS 13.0进行。之间的显著差异意味着被单向方差分析评估(方差分析),紧随其后的是多个比较有显著差异(LSD)测试或图基的测试在适当的地方。被认为是显示统计学意义。
3所示。结果
3.1。影响药物对血清葡萄糖、胰岛素、脂质参数和体重
药品管理局(周0)之前,糖尿病老鼠高基线空腹血糖水平。糖尿病大鼠的血糖水平显著增加控制的比较。药物治疗期间,葫芦巴碱逐步降低空腹血糖正常水平(图1)。乙肝糖尿病大鼠水平显著高于控制的。葫芦巴碱和sitagliptin治疗48周恢复增加糖尿病Hb在控制的水平。糖尿病大鼠有明显的血清胰岛素浓度和decreased-insulin敏感性指数与控制的相比。葫芦巴碱治疗逆转血清胰岛素水平和胰岛素敏感性指数,但没有sitagliptin。糖尿病老鼠的TC和TG水平显著高于对照组。葫芦巴碱治疗48周显著降低TC和TG水平,但sitagliptin并不影响这些脂质代谢参数。控制老鼠的增长速度比另一组和糖尿病大鼠的体重继续增加(数据未显示)。初始(周0)之间的体重增加和最终(星期48)控制老鼠的体重显著高于其他组的。在48周,葫芦巴碱,但不是sitagliptin、治疗明显降低糖尿病患者体重增加(表1)。
3.2。药物对中译的影响和伤害感受
postdiabetes 48周,糖尿病大鼠显示显著降低电机和感官中译相比年龄控制老鼠。葫芦巴碱和sitagliptin治疗48周显著逆转糖尿病大鼠的运动和感觉神经传导障碍(表2)。
尾巴轻轻延迟在48周显著降低糖尿病动物在冷和热浸渍试验相比,控制动物。这个尾巴轻轻减少延迟在治疗显著逆转葫芦巴碱和sitagliptin(表2)。
3.3。坐骨神经的电子显微分析
超微结构检查显示,坐骨神经的控制大鼠正常micropathological神经纤维的形态与结构完整性和髓鞘,同心层状髓小跑的安排,统一的轴突内电子密度,和雪旺细胞的正常结构,线粒体和无髓鞘的纤维(图2(C))。但糖尿病大鼠显示重要的有髓神经纤维髓鞘板层分离,失去了分层结构,无序排列,褪色的电子密度,薄的轴突,神经丝障碍,和雪旺细胞的线粒体肿胀(图2(D))。葫芦巴碱的保护作用明显改善micropathology糖尿病坐骨神经(图2(T)), sitagliptin一样(图2(S))。
3.4。药物对glp - 1在血清水平的影响在坐骨神经和GLP-1R表达
glp - 1在血清和GLP-1R mRNA和蛋白表达水平在糖尿病大鼠坐骨神经都显著降低。Forty-eight-week葫芦巴碱治疗,sitagliptin显著增加glp - 1在糖尿病血清水平附近,控制老鼠。葫芦巴碱和sitagliptin显著增加了表达下调GLP-1R mRNA和蛋白表达在糖尿病坐骨神经附近那些控制老鼠(表3和数字3(一个)和3 (b))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.5。药物对道达尔和磷酸化的影响p38 MAPK在坐骨神经蛋白表达
磷酸化p38 MAPK在坐骨神经蛋白表达显著增加,而总p38 MAPK表达改变与非糖尿病患者相比,糖尿病大鼠的控制。Forty-eight-week葫芦巴碱和sitagliptin显著降低了治疗糖尿病坐骨神经调节蛋白磷酸化p38 MAPK表达控制老鼠和附近仍然并不影响总蛋白质磷酸化p38 MAPK表达(数字3(一个),3 (c),3 (d))。
3.6。影响药物在血清超氧化物歧化酶活性和Malonaldehyde内容
活动的变化在大鼠血清超氧化物歧化酶和malonaldehyde中描述表4。超氧化物歧化酶活力显著降低和升高malonaldehyde内容观察糖尿病大鼠的血清。显著提高超氧化物歧化酶活性和降低显著减少增加malonaldehyde内容观察糖尿病大鼠和回归到附近的控制水平与葫芦巴碱和sitagliptin 48周后治疗。
4所示。讨论
DPN 1和2型糖尿病是一种常见的并发症,造成高血糖诱导氧化应激(41]。当前的研究评估了葫芦巴碱对大鼠体外DPN的发展的影响。我们发现:(1)葫芦巴碱显著提高电动机和感官中译和伤害感受;(2)葫芦巴碱对神经元保护组织(坐骨神经);(3)葫芦巴碱降低氧化应激在坐骨神经;(4)GLP-1R和p38 MAPK活性受葫芦巴碱,可能与DPN的发展有关。
糖尿病大鼠体外实验是建立模型的2型糖尿病发展的神经病变(42]。使用低剂量链脲霉素和高碳水化合物/高脂肪饮食协议,我们证实糖尿病诱导和动物生存48周。糖尿病大鼠体外实验开发了空腹血糖增加,和Hb和体重增加相对于控制大鼠,与先前的报告相一致(29日]。Forty-eight-week葫芦巴碱有anti-hyperlipidemic治疗效果和降低血糖,Hb老鼠,体重DPN。血脂异常是一个重要的贡献者DPN发展,降血脂药剂可以防止或逆转diabetes-induced神经变性(43]。
我们演示了葫芦巴碱的影响GLP-1R / p38 MAPK信号通路在糖尿病大鼠体外实验。Forty-eight-week葫芦巴碱治疗增加血清GLP-1水平和GLP-1R表达和调节磷酸化p38 MAPK活性下降,但并不影响总p38 MAPK在坐骨神经蛋白表达。虽然确切的机制还不清楚,对DPN葫芦巴碱的影响可能部分归因于对GLP-1R / p38 MAPK信号通路的调控。外生GLP-1R激活显著减少glucose-dependent活性氧生成在下丘脑(44]。GLP-1R受体激动剂的抗氧化作用,exendin-4等对周围神经系统再生的影响。在体外实验糖尿病大鼠背根神经节,p38被oxidative-nitrosative激活压力(45]。
糖尿病大鼠体外实验开发持续DPN 48周后糖尿病以增加热延迟和减少中译。热延迟被葫芦巴碱治疗显著降低,与NCV研究证明了相应改善的趋势。我们也观察到有髓神经纤维髓鞘板层的分离,失去了分层结构,无序排列,褪色的电子密度,薄的轴突,神经丝紊乱,线粒体肿胀坐骨神经的雪旺细胞透射电子显微镜。这些超微结构变化是48周提高了葫芦巴碱治疗。一些研究表明,葫芦巴碱可能增加背根神经节神经元的兴奋性46[],促进功能性神经突结果47),防止树突和轴突萎缩引起的淀粉样蛋白β(25 - 35)剂量依赖性的方式48]。的糖尿病诱导50周后进行组织学研究表明,提供的神经保护葫芦巴碱导致坐骨神经的长期保存和它的功能。
葫芦巴碱治疗有降糖作用和部分纠正DPN。葫芦巴碱有抗氧化效果在颗粒系统中,人类结肠癌细胞系(15),在脂质体过氧化(16]。确定改善DPN的观察是由于diabetes-induced氧化应激,减少氧化损伤的生物标志物在血清化验。血清SOD活性显著降低,malonaldehyde内容显著提高糖尿病大鼠体外实验,符合先前的研究显示,糖尿病增加氧化脂质(49,50]。我们的研究结果是一致的与DPN的氧化应激模型(41因为热延迟增加malonaldehyde水平高度相关,SOD水平下降。葫芦巴碱治疗显著降低两种生物标志物,附近,控制动物的水平。因为葫芦巴碱纠正高血糖和减少氧化应激,我们得出的结论是,在DPN葫芦巴碱促进抗氧化活性。许多药物具有抗氧化功能是有效治疗DPN的动物模型,包括抗氧化反应元素激活白藜芦醇(50)和天生的抗氧化剂、染料木素和黄芩甙元药物不良反应(49,51,52]。
总之,本研究确定了葫芦巴碱作为多目标药物减轻DPN的几个表现。这些结果提供筛选生物碱的动物实验研究的基本原理,特别是改善药理档案,如口服,更少的副作用,和可接受的药物特性,作为潜在的治疗DPN甚至其他糖尿病并发症。
确认
作者欣然承认中国的国家自然科学基金资助(没有。81100597),重庆科委自然科学基金项目(没有。CSTC 2009 ba5012),第三军医大学的自然科学基金(没有。2009 xqn34)。