文摘
绿色蜂胶提取物的免疫调节和抗炎活动的蜜蜂研究了使用急性和慢性炎症模型。瑞士小鼠麻醉和一个棉花球肉芽肿是植入皮下组织。然后老鼠被分成六组,接受apyrogenic水或口服摄入不同的蜂胶提取物(5毫克/公斤)。根据治疗组被指定为E1A E1B, E10, E11和E12汽油。对照组收到apyrogenic水。治疗是由六天当老鼠被杀。血液和支气管肺泡灌洗(BAL)收集测量白细胞招募。在急性肺部炎症,Balb / c小鼠接受脂多糖(LPS)大肠杆菌鼻内路线为三天。与此同时老鼠收到口头路线apyrogenic水(控制)或E10汽油和E11蜂胶提取物。拜尔港进行评估炎性浸润,细胞因子量化。结果表明,E11提取物有抗炎属性在这两个模型的抑制促炎细胞因子和抗炎细胞因子的增加表明免疫调节活动。
1。介绍
由于颜色(绿蜂胶是众所周知的1,2),所产生的的蜜蜂蜜蜂,利用Baccharis dracunculifolia直流(菊科),一个常见的物种在巴西塞拉多,作为主要的植物来源3]。几项研究已经报道绿蜂胶antiulcerogenic [3,抗炎4,抗诱变剂的5,抗真菌6- - - - - -8),免疫调节9),血管生成(10),和抗氧化剂11]属性。蜂胶的生物活性是由于其高水平的酚酸(12),而黄酮类化合物被认为是负责欧洲蜂胶提取物的活动13]。巴西绿蜂胶的典型成分caffeoylquinic酸、肉桂酸prenylated衍生品如artepillin C和baccarin [14,15]。
自然物质的免疫调节作用已被视为替代辅助疗法治疗各种疾病(16]。蜂胶的情况下,这种影响一直与不同的组合成分(17]。绿色管理的蜂胶在动物受到慢性压力过氧化氢的生成增加,表明该产品调节巨噬细胞的激活(18]。在一个在活的有机体内慢性炎症模型,它也已经证明,绿蜂胶提取物抑制细胞迁移在不影响胶原沉积。因此,绿蜂胶可以用来控制炎症反应(19]。由于先前的知识可能影响绿蜂胶的炎症免疫反应,本研究调查了当地和系统性效应不同提取物的巴西绿蜂胶在炎症反应在不同的实验模型。
2。材料和方法
2.1。收集和制备蜂胶提取物
本研究使用冻干样品水溶液提取蜂胶由api的植物,小溪Preto, SP,巴西。提取生产遵循专利标准化过程(π0405483 - 0),发表在《航空杂志上Propriedade没有。1778年12.01.2005 [20.]。在这个过程中,不同的米纳斯吉拉斯的蜂胶样本(毫克),圣保罗(SP),南里奥格兰德(RS),巴拉那河(PR),和圣卡塔琳娜州(SC)。提取混合在标准化的浓度,导致一个样品池,绿蜂胶是主要的。冻干提取被数根据提取的类型:E1A E1B从直接提取蜂胶提取准备(池)使用工业溶剂,虽然E10, E11,和E12汽油提取物浓度和碱性水解得到,根据德安德拉德et al。21与修改),标准化的蜂胶提取物(EPP-AF)和纯净水的溶解度。
2.2。了采用高效液相色谱法测定蜂胶提取物的化学特性
定量分析的蜂胶提取物进行了高效液相色谱法(HPLC-Shimadzu)配备CBM-20A控制器,一个LC-20AT四元泵、一个SPD-20A M二极管阵列检测器,和日本岛津公司LC软件,版本1.21 SP1。一个Shim-pack CLC-ODS (M)(4.6毫米×250毫米,粒子直径5毫米,孔隙大小100)岛津制作所列。一个梯度的流动相由甲醇(JT Baker)和酸化水与甲酸(0.1% v / v)从20%到95%不等。77分钟的运行0.8毫升/分钟的流量,与检测在275 nm,。下列化合物被用作标准的高效液相色谱分析:咖啡酸(丙烯酰胺),p-coumaric酸(丙烯酰胺)和trans-cinnamic酸(丙烯酰胺),artepillin C和光)(kouichi,没食子酸(Synth),异樱花亭(ChromaDex)和4′O-methyl-ether aromadendrin。这些化合物以前孤立和标识为所描述的(22),请作者提供的。水在Milli-Q净化系统处理。冻干蜂胶样品(),命名为E1A E1B E10, E11和E12汽油稀释在甲醇/水和均质使用超声波浴。0.45后过滤μm过滤器,15μL(每个样本注入高效液相色谱系统。
2.3。动物
瑞士和Balb / c小鼠(8 - 12周,25 - 30 g)。动物被老鼠繁殖分配设施联邦大学的马拉尼昂。动物收到了水和食物随意,同时维护和依照规则SBCAL(巴西社会动物科学实验室)协议(CEP / UEMA没有。010/2007)。
2.4。棉粒肉芽肿
方法采用肉芽肿形成被击打和Shideman23),适应在我们的实验室。动物被分成六组(1 control-5实验)(/组)。对照组收到200μL apyrogenic水口头(订单)(图1)。实验小组收到不同的蜂胶提取物5毫克/公斤p。o六天,按照收到提取被称为E1A E1B, E10, E11和E12汽油。动物是通过肌肉注射麻醉的溶液2%甲苯噻嗪以氯化物处理(20毫克/公斤)和5%氯胺酮氯化(25毫克/公斤)2:1的比例。一个小切口是在背的皮肤区域引入皮下植入消毒棉花(9 mg-prior介绍)。植入后7天会献祭动物,当棉花植入物被移除,重获得湿重(总重量)。然后,植入物被轻轻按到随后的微分计算表的染色后细胞肉芽肿中发现的幻灯片Instant-Prov工具包(Newprov、Pinhais、巴西)所描述的制造商。随后,棉花植入在炉干在37°C 48小时,体重测量肉芽肿的干重,这与细胞形成的肉芽肿重量。从最终的重量,现在水肿的肉芽肿是使用以下公式计算:水肿出现在肉芽肿的重量= Ps -ππ是初始重量(总)和Ps是干重。
2.4.1。血液参数的评价
确定血液参数,100μL小鼠的血液收集棉花植入后七天。血液储存在1.5毫升管与乙二胺四乙酸(EDTA)作为抗凝剂。自动血液分析仪(poch - 100 - iv Diff, Sysmex集团)是使用。以下参数进行了分析:红细胞、血红蛋白、血细胞比容,意味着微粒体积(MCV),意思是微粒血红蛋白(妇幼保健),意思是微粒血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞分布宽度(RDW)和白细胞,中性粒细胞、淋巴细胞和血小板。
2.4.2。量化淋巴器官的细胞的数量
动物牺牲后,脾脏被切除之前,称重,磨碎5毫升的磷酸盐溶液中使用筛(PBS)。获取骨髓细胞,股骨摘除和灌注1毫升的PBS。腹股沟淋巴结被切除,称重和磨碎,1毫升的PBS。细胞悬浊液被保存在冰浴。所有细胞计数进行用结晶紫溶液(0.05%,30%乙酸)所描述的马舍尔et al。24]。
2.4.3。支气管肺泡灌洗
动物的气管被曝光,配备了一个套管,1毫升的冷PBS注射用注射器在支气管肺泡空间。经过短暂的按摩胸部,解吸气至少三次。收集肺、体重和固定在10%的福尔马林后续组织病理学分析。决定细胞的总数支气管肺泡灌洗,细胞悬浮液与结晶紫染色(0.05%)的比率在30%醋酸9:1。细胞数在纽鲍尔室使用光学显微镜(×400)。准备使用了微分计算幻灯片citospin(800转/ 3分钟),然后被固定和染色使用Instant-Prov工具包(Newprov、Pinhais、巴西)25]。
2.5。诱导的急性肺部炎症的滴剂脂多糖(LPS)
Balb / c小鼠被分为三组(/组):控制、E10汽油和E11。对照组收到200μL apyrogenic水,组指定E10,和E11提取获得的剂量5毫克/公斤,订单。这些动物麻醉肌内和0.4毫升的2%甲苯噻嗪chloridrate(20毫克/公斤)和5%氯胺酮氯化(25毫克/公斤)。微量吸液管(Gilson) 10μL有限合伙人的解决方案(1毫克/毫升无菌PBS)是由产气的路线使用鼻腔滴注法。这种感应是连续三天(图完成的2)。一天第一个有限合伙人应用程序之前,控制,E10, E11治疗开始。这种治疗持续了四天,牺牲的动物进行24小时后过去应用有限合伙人,当支气管肺泡灌洗进行如上所述[26]。
2.5.1。细胞因子测定
的浓度il - 6、il - 10、TNF -α,TGF -β细胞因子的测定支气管肺泡灌洗取自动物使用夹心ELISA方法,根据制造商的规格(美国eBioscience,圣地亚哥,CA)。一夜之间,捕捉每个细胞因子单克隆抗体被孵化在4°C康宁配角9018板(100μ信用证)。孵化后盘子洗了PBS + 0.05%渐变20日和非特异性反应被添加10%胎牛血清(FCS) (200μ信用证)60分钟。盘子洗,样品添加(100μ信用证)。在4°C 24小时孵化后,盘子都洗和检测抗体(100 uL /)补充道。板块是在室温下培养1小时。进一步洗涤后,共轭抗生物素蛋白过氧化物酶补充道,和板在室温下培养30分钟。比色反应是由增加100μL的三甲衬底/。然后阻塞的反应是由添加50μL / 2 n H2所以4在450 nm,吸光度测定。光密度值(OD)被转换为pg / mL或ng / mL基于曲线得到不同浓度的重组细胞因子。
2.6。统计分析
未配对的学生进行了测试,采用作为重要的价值。比较蜂胶提取物,我们分别进行了进一步分析的六个标准;分析的结果单向方差分析Bonferroni紧随其后的多重比较。使用GraphPad棱镜执行统计分析软件(5.0),为进一步计算,使用Microsoft Excel 2010项目。
3所示。结果
3.1。水的化学特征提取的绿蜂胶
的主要标准在所有测试水提取物绿蜂胶p-coumaric酸,但所有其他标准(咖啡酸、肉桂、aromadendrin和异樱花亭)也被发现在所有提取较低水平。Artepillin C中没有检测到1只提取。统计的差异这些化合物的浓度如表所示1。
3.2。蜂胶提取物治疗的效果在棉粒肉芽肿
几种类型的测试提取诱发不同的效果在肉芽肿的形成,都与总重量(图3(一个)),干重(图3 (b)(图)和水肿3 (c))。E1A诱导减少总重量的肉芽肿,和水肿控制相比,虽然E1B没有引起任何变化。E10诱导促炎效应,而E11和E12汽油表现出抗炎效果,总重量在3。
(一)
(b)
(c)
3.2.1之上。蜂胶提取物治疗的效果在动物的血液参数与棉粒肉芽肿
提取E1A, E1B和E12汽油没有诱导动物血液的变化。然而,E10汽油和E11诱导白细胞的数量和其他的增加白细胞与对照组相比,尽管E11也诱导血小板的减少而对照组(表2)。
3.2.2。治疗的效果与蜂胶提取物对动物的淋巴器官的细胞结构诱导棉花粒肉芽肿
提取E1B, E10、E11和E12汽油诱导骨髓细胞的数量减少而提取E1A, E1B,和E10诱导脾细胞的数量减少,与对照组相比。相反,提取E1A E10, E11诱导淋巴细胞的数量增加而对照组(表3)。
3.2.3。蜂胶提取物治疗肺部炎症的影响引起的皮下植入的棉花
评估治疗的效果是否与蜂胶提取物是由于系统性炎症肺,肺与肉芽肿炎症动物评估。减少炎症细胞的数量在总BAL治疗后观察细胞计数和提取E11 E12汽油。显著增加巨噬细胞的数量在球收集从动物对待E1B E10,而中性粒细胞的数量显著减少提取E1B治疗后,E10, E11,和E12汽油,与对照组相比。淋巴细胞的数量并没有改变(图4(一))。所有治疗组的主要细胞类型在球是巨噬细胞和中性粒细胞,除了集团对待E12汽油,淋巴细胞的主要细胞类型(图4 (b))。
(一)
(b)
3.3。蜂胶提取物治疗的效果LPS-Induced肺部炎症
鉴于动物肺肉芽肿炎症效果观察,蜂胶在急性肺部炎症的影响,由有限合伙人,评估。对于这个测试,我们选择文章的节选E10,诱导促炎效应和E11诱发肉芽肿模型中的抗炎作用。治疗E10汽油和E11诱导的炎症细胞数量减少,巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞在球(图5(一个)),而淋巴细胞优势只是E11-treated组(图中观察到5 (b))。
(一)
(b)
3.3.1。蜂胶提取物治疗对细胞因子的影响生产的上层清液中支气管肺泡灌洗的动物对待LPS-Induced肺部炎症
有一个降低TNF -的浓度α和治疗组il - 6 E10汽油和E11相比控制。另一方面,有一个增加TGF -β和il - 10在两组与对照组相比(图6)。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
本研究评估绿色蜂胶水提物的影响在两个不同的模型炎症。水提取蜂胶的很少的治疗活动的调查,尽管潜在的抗氧化剂和抗炎活动,更好的吸收比ethanolic提取(27]。所示,蜂胶水提物的有很强的消炎的潜力,在肺和肉芽肿模型,特别是在第一种情况下。诱导棉花粒肉芽肿模型在这项研究中的应用是一种方法,已被广泛用于评估transudative,渗出性和增生性组件的炎性疾病自干态和湿棉花植入的重量使水肿和炎症浸润的推理23]。
这个模型被用来评估口腔治疗的效果与水提取蜂胶。经过六天的治疗观察E10提取诱导增加水肿和炎性浸润(图3)表明proedematogenic和促炎的效果。此外,E11提取物诱导相反的效果,因为它减少水肿和细胞浸润。E11和E12汽油提取减少总重量(图3(一个)),干重,表明炎性浸润(图3 (b)(图)和水肿3 (c)作为抗炎药)。E1A E1B提取因变量的影响,和E1A提取诱导减少总重量(图3(一个)(图)和水肿3 (c)),而E1B提取并不影响细胞的总重量(图3(一个))或水肿(图3 (c))。
之间的差异观察提取的影响可能是由于每个提取的化学特性。所有提取包含咖啡酸、p-coumaric和肉桂,aromadendrin和异樱花亭。Artepillin C被发现在所有提取E1A除外。然而,这些化合物的浓度差提取(表1)。以提取E10 E11,显示差异肉芽肿模型,作为一个例子,提取E10显示更高浓度的所有标记除了p-coumaric酸和aromandendrin提取E11相比。此外,E10的标记浓度最高的是artepeillin C,而对于E11 p-coumaric酸(表1)。
酸的作用(p-coumaric,肉桂和咖啡)肉芽肿模型测试的剂量1毫克/公斤,但没有显著差异的参数评估观察(数据未显示),这使得我们认为抗炎效应观察到在这项研究并不是由于这些酚酸单独的行动,但他们之间的累加效应。然而,在其他实验模型这些酚酸已经被证明的其他行为,如肉桂酸与蜂胶是先天的和后天免疫证明行动,刺激淋巴细胞的增殖,并诱导细胞因子的生产(28]。它也表明咖啡酸可能是有用的在控制肿瘤的生长在实验模型29日]。巴罗斯et al。30.)利用胃溃疡模型表明,酚酸有antiulcerogenic活动。此外,在活的有机体内研究artepelin C,绿蜂胶的主要组成部分,显示,抑制前列腺素E2 (PGE2)生产的腹膜炎模型(31日),证明其对炎症的影响。莫拉et al。10]表明,水提取物的抗血管增生和抗炎活动绿蜂胶似乎是由于存在artepillin C, caffeoylquinic酸和提取的角。
蜂胶的复杂化学成分可能是答案的存在许多与这个养蜂产品有关的活动。酚类化合物是最著名的组件的蜂胶,因为他们被认为是负责大部分的属性。这是由于这样的事实,酚类化合物起到多种作用,如抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗癌等作用[32- - - - - -34]。此外,它们之间的相互作用,在一个包含不同浓度的提取,可能会导致不同的效果。
考虑之间的差异观察E10 E11提取物,如生物活性在肉芽肿模型中,观察到的化学标记相比,我们调查是否提取有微分系统性的方式采取行动。首先血液数据评估,这提供了重要的生理和病理指标变化在人类和动物35]。这个数据显示增加白细胞数量动物对待E10汽油和E11提取物(表2)。这些白细胞主要是淋巴细胞和中性粒细胞。结果进一步证明了E10 E11提取物,除了改变细胞迁移到肉芽肿的形成,也影响招聘的细胞从骨髓进入血液和组织。
澄清的变化观察到血液中是否会由于改变骨髓细胞生产和检查是否有招聘的变化和/或白细胞扩散到淋巴结和脾脏,这些器官的细胞也被量化。有一个减少在动物的骨髓细胞的数量处理E1B, E10, E11,和E12汽油提取物,建议增加细胞招聘从骨髓血液和解释血液中的白细胞数量的增加。我们也观察E1A脾细胞,减少E1B,和E10提取物和腹股沟淋巴结细胞增加了E1A E10, E11提取物(表3)。
E10汽油和E11提取显示全身效应,我们评估治疗的效果在肺部炎症引起的肉芽肿。为此,我们使用了总细胞数和差异落下帷幕,这是标准的指示性呼吸道的炎症反应,在肺巨噬细胞是主要的细胞(> 90%)在健康动物(36]。
我们观察到显著减少炎性浸润动物接受E11和E12汽油提取。微分的计算数量的增加引起的巨噬细胞提取E10汽油和减少引起E11提取观察(图5(一个))。这些结果表明,E10汽油和E11提取物有能力调节炎症细胞招聘区域,减少中性粒细胞炎症可能是有害的炎症组织(36]。
从结果,表明E10 E11提取物诱导相反的作用在这两个模型的肉芽肿以及巨噬细胞浸润的落下帷幕,我们调查是否这些对立的效果也会观察到在LPS引起的肺部炎症,一种广泛使用的促炎的代理。然而,在这个模型中,提取显示抗炎作用,在减少炎症细胞的总数,巨噬细胞和中性粒细胞观察(图5(一个))。此外,淋巴细胞的比例量化时,注意到两个提取物诱导这些细胞的招募的增加(图5 (b))。这些结果强烈表明,E10汽油和E11提取物调节细胞反应的模型通过改变LPS-induced肺部炎症免疫细胞参与这个过程的概要文件。
考虑到所有的炎症过程与细胞的参与及其介质进行的细胞因子(37),尤其是由T淋巴细胞的变化模式,可以安排一个免疫反应按照微分环境产生的细胞因子(38]。因此,我们调查发现肺部炎症的抑制作用是否与调制等促炎细胞因子il - 6和TNF -α和细胞因子il - 10和TGF -等β在肺。事实上,我们证实了E10汽油和E11提取物诱导减少分泌il - 6和TNF -α和增加TGF -β和il - 10,这或许可以解释抑制炎症的观察(图6),尤其是当考虑到,在一个正常的肺,TGF -β参与维持肺内稳态通过限制病理炎症反应(39]。
细胞因子il - 6,除了研究最多的细胞因子之一,多效性的行动,影响抗原免疫反应和炎症反应(40)自限性的炎症反应(41),连同其他细胞因子研究的概要介绍的分辨率对LPS诱导的炎症反应。我们的结果证实,Khayyal et al。42),显示使用水提取物的蜂胶可以减少夜间哮喘发作,这是与减少促炎细胞因子(TNF -α,引发il - 6)和il - 10的增加。同样,Sy et al。43)使用一个模型引起的肺部炎症的卵清蛋白(OVA)和证明蜂胶治疗抑制肺部炎症和降低血清的IgE水平和IgG1。
然而,我们获得的结果不同意那些Orsatti et al。9),表明政府的巴西绿蜂胶乙醇提取物剂量200毫克/公斤连续3天在老鼠身上也增加先天免疫和炎性因子(il - 1和il - 6)的表达。然而,有必要强调Orsatti et al。9)使用大剂量相比,用于我们的工作,以及使用乙醇提取。在我们的模型中观察到,一个诱导增加TGF -β和il - 10监管细胞因子,导致炎症过程的规定(44,45)通过添加促炎细胞因子的调节作用。我们的数据可能表明,E10汽油和E11提取物显示本地和系统性抗炎作用产生的免疫调节作用。
这些影响可能是由于协同效应和/或各种绿蜂胶的累加效应的化合物从而减少炎症。提取也能够调节促炎和抗炎细胞因子的生产,防止肺部炎症过程的放大。因此,测试提取可能成为新的治疗选择用于过敏性呼吸道疾病和炎症。
将进行进一步的研究来描述生物活性成分在炎症和其他模型来评估这些提取物的抗氧化潜力在活的有机体内因为大量的酚类化合物被发现绿蜂胶和能够干扰炎症过程,因此研究蜜蜂产品对免疫系统的影响。
确认
由于将资助研究FAPEMA(没有。580342/2008-5)。CNPq (CNPq调用/ RHAE n。67/2008)资助的研究和奖学金的硕士学生Mayara克里斯蒂娜•平托da Silva Aramys席尔瓦dos Reis,和博士生Graciomar康西卡奥科斯塔博士和教授的研究生产力Rosane Nassar莱斯Guerra博士和教授弗拉奎尔费尔南德斯do Nascimento,斗篷乔琳Lopes马查多的硕士奖学金,迭戈de Sousa阿鲁达洛佩斯和安妮Karine马丁斯Assuncao。