的抑制作用Nelumbo Nucifera(Gaertn.)关于NC/Nga小鼠特应性皮炎样皮损的发展

抽象的

特应性皮炎（AD）是一种慢性炎症皮肤病，具有复杂的病因，包括免疫反应。该研究进行了检查效果Nelumbo Nucifera2,4-二硝基氯苯(DNCB)皮下重复应用于NC/Nga小鼠背侧皮肤引起的ad样皮肤损伤。三种不同剂量的NL(5、25和50 mg/小鼠/天)从DNCB致敏当天开始口服，持续4周。NL的疗效通过组织病理学检查、血液IgE水平、经皮水分流失(TEWL)测量、抓挠行为和皮肤严重程度评分来判断。NL导致临床严重程度评分、TEWL、抓挠行为和血液IgE水平的抑制。组织病理学分析显示NL组表皮增厚和肥大细胞脱颗粒明显减少。这些结果表明，NL可能是治疗AD的一种有用的自然资源。

1.介绍

特应性皮炎(AD)是一种依赖于环境、免疫和遗传因素相互作用的慢性复发性炎症性皮肤病[1]．AD的发病率在过去30年急剧上升，近年来的上升可归因于包括工业化和城市环境在内的环境影响[2]．流行病学报告表明，广告影响全球最多10-20％的儿童，可以坚持成年。据估计，在生命的第一年的65％的患者中，在5岁之前的患者中，患有65％的患者在患者中开发了广告症状[3.]．广告中的病变皮肤的特点是水肿，出血，侵蚀，干燥，以及通常在耳朵，背部和颈部和面部区域的局部定位的脱发[4.]．对广告中的病态皮肤的病理检查显示急性病变中的肺刺症，高曲率病和平缓性表皮增生，棘菌病和患者淋巴细胞和肥大细胞的血管累积[5.]．虽然遗传、环境、皮肤屏障、药理学、心理和免疫因素之间复杂的相互关系有助于AD的发病，但疾病的免疫学基础相当重要，已被广泛研究[6.]．AD，哮喘和鼻炎等过敏性疾病的特征在于Th2主导的反应，其由IL4，IL-5和IL-13介导，并诱导B细胞级切换到IgE [7.]．NC/Nga小鼠是1957年日本花式小鼠的近交系，最近被证明在空气不受控制的常规环境中自发发生ad样皮炎并产生IgE [8.那9.]．然而，在特定病原体（SPF）条件下提高时，NC / NGA小鼠没有显示皮肤病。具有化学抗原如诸如麦克里氯化物的外膜施用引起的小鼠中的对小鼠的过敏反应接触过敏反应。有趣的是，具有这些药剂的局部施用的重复不仅会诱导皮肤反应的动力学从延迟类型到即时型响应的转变，而且还将细胞因子Milieu从TH1到TH2剖面变化[10.那11.]．

Nelumbo NuciferaGaertn。(睡莲科)是一种广泛分布于印度、中国、日本和韩国的大型水生草本植物，不仅具有观赏和食用价值，而且在东亚也被用作药用植物。几乎每一部分N. Nucifera据报道，包括叶，花，种子和根茎具有不同的治疗效果[12.]．已经提及叶子通过增加小鼠的脂肪组织中的脂肪分解来显示抗菌活性[12.那13.]．有关于N. Nucifera具有乙酰胆碱酯酶活性和精液的根茎，具有反神经炎和镇静活动[14.]．N. Nucifera富含生物碱和黄酮类化合物。而且，N. Nucifera叶子含有丰富的黄酮类化合物，如木犀草素、槲皮素和异槲皮素[15.]．本文研究了水提液的作用N. Nucifera评价由DNCB（2,4-二硝基苯）重复局部施用引起的NC / NGA小鼠的污水症状的叶片（NLS）。

2.材料和方法

2．1.动物

男性5周龄NC / NGA小鼠（20-23克体重）购自SLC Inc.（日本东京）。将小鼠保存在受控温度下的标准塑料笼中（°C），湿度（)、100%新鲜的肝过滤空气、24小时昼夜循环(6时~ 6时亮灯)。实验期间，小鼠不受任何限制地提供基础饲粮和无菌水。实验开始前，所有小鼠均经过一周的适应期。所有的动物研究都得到了木浦大学自然科学研究生院动物保护委员会的批准，所有的饲养实践和动物保护都符合韩国动物保护协会的指导方针。

2.2。试剂

DNCB购自Sigma-Aldrich，Inc。（美国圣路易斯圣路易斯，美国）。从Kanto Chemical Co.，Inc。（东京，日本）和Carlo Erba Reagents SA购买橄榄油和丙酮。（法国）分别。将DNCB溶解在橄榄油/丙酮（3：1）中为1％（w / v）和0.4％（w / v）溶液，并用于敏化和诱导。

２.３.应用DNCB

通过使用含有80％的巯基乙酸甲酯的电动剃须刀和毛发去除乳膏除去NC / NGA小鼠的背发。第二天，背部皮肤敏感，200 μ.L的1% DNCB (w/v)在橄榄油/丙酮(3:1)中。四天后，小鼠被施加200μ.L每周重复每周3次（周一，星期一和周六）对背部皮肤的0.4％dncb（w / v）4周。每组含有7只小鼠。

２.４.的制备Nelumbo Nucifera叶（NL）提取物

的叶子N. Nucifera均来自韩国务安。用索氏提取液3000 mL蒸馏水提取1 Kg的叶片，提取3 h，重复提取3次。过滤除渣后，滤液蒸发冻干，得到NL粉。干提物得率约为原料的12%。

2．5．管理问

将NL溶解在蒸馏水中，并在敏感天中使用胃Sonde喂食小鼠，直至4周。用蒸馏水加入该对照。NL以3种不同的剂量（5,25和50mg /小鼠/天）施用。

2.6。经表皮水分流失(TEWL)

用皮肤蒸发水记录仪(Tewameter TM300;勇气和Khazawa，科隆，德国)。所得数据由微处理器分析，以g/m表示²/H。每周测量TEWL 4周。当TEWL读数稳定在探头置于皮肤大约30秒后，测量记录。

2.7。抓挠行为和血液IgE水平的评估

将小鼠单独放置在透明的塑料笼中并使其适应15分钟。此后，行为被录像10分钟。在播放期间观察到鼻子，耳朵和背爪的背部皮肤。忽视了在修饰期间舔腹部和背部皮肤。每次发生头部，颈部，背部皮肤，耳朵和鼻子的划伤以获得最高分。根据制造商的说明，使用IgE套件（Shibayagi Co. Ltd.）测量血液中的IgE水平。

2.8。评估皮肤严重程度

对面部、耳朵和身体背部的皮炎的严重程度进行盲法评估。评估的症状包括:(i)红斑/出血、(ii)皮肤瘙痒和干燥、(iii)水肿、(iv)刮伤/糜烂和(v)地衣化，评分如下:无= 0;轻度= 1;温和= 2;严重的= 3。每个评价症状的评分(最高为15分)的总和被认为是皮肤严重程度评分。每周评估皮肤严重程度，持续4周。

2.9。组织病理学检查

4周后，所有小鼠在乙醚麻醉下安乐死，切除小鼠背侧皮肤，10%磷酸缓冲福尔马林(pH 7.2)固定，石蜡包埋。部分4μ.m是显微镜的。将该叶片在二甲苯中脱碱化，在梯级醇浴中脱水，并用苏木精和曙红染色或酸化甲苯胺蓝。最后，通过光学显微镜（Olympus，Tokyo，Japan）检查它们，使用aperio型图像分析计算表皮层的厚度。在随机选择的四个位点中每平方毫米真皮的肥大细胞数来自甲苯胺染色部分。

2.10。统计分析

所有实验数据都表示为平均值±标准偏差。通过单向ANOVA分析确定不同基团变异的重要性。值≤0.05被认为是显着的。

3.结果

3.1。NL对皮肤严重程度的影响

NC/Nga小鼠经反复应用苦三氯化钠后出现ad样皮肤损伤。对照组皮肤严重程度随DNCB攻毒次数的增加而逐渐增加。口服NL 4周可抑制ad样皮损的发生。各组28天皮肤严重程度如图所示1．每一组的皮肤严重程度在致敏后14天或多或少相似。但14天后，对照组的皮肤症状比nl组有显著变化。各组皮肤严重程度评分如图所示2．

3.2。组织病理学分析

背部皮肤部分的血毒素和曙红染色揭示了血管瘤，渐变症，刺激性，不同程度的细菌症，表皮中单核细胞的外尿量，以及炎症细胞的浸润细胞进入对照组的上部真皮，同时在NL-中抑制了所有这些参数。如图所示的施用组3(一个)．表皮厚度的定量数据如图所示3 (b)．对照的表皮厚度是μ.M虽然NL50的那个是1 μ.米(）.背侧皮肤切片甲苯胺蓝染色显示，与给予nl组相比，对照组真皮上肥大细胞浸润和脱颗粒更多，如图所示4(一)．肥大细胞浸润脱颗粒的定量数据如图所示4（b）．对照组、NL5、NL25和NL50每平方毫米肥大细胞数均显著高于对照组那那和分别。

３．３．NL对血液IgE水平的影响

NC / NGA小鼠与DNCB的皮肤皮肤皮肤致敏和挑战升高了IG E水平μ.g/mL(正常，未治疗组)μ.g / ml。NL50的给药抑制了IGE水平μ.g/mL，是对照的2倍左右。同样，NL25抑制IgE的升高μ.统计学意义的g / ml（）.数字5.显示NL对第28天血液IGE水平的影响。

3．4．NL对抓痕行为和水分流失的影响

组的平均划痕行为的平均数没有差异，长达14天。然而，来自第3周的群体之间的划痕行为发生了变化。在第25天评估的抓挠行为如图所示6.．在NL50中，划痕的数量减少了超过三倍。一致于NL对肥大细胞脱粒的影响，NL降低了刮擦行为。NL-施用的组的TEWL与14天的对照不同。然而，NL25和NL50的给药在第21和28天显着抑制TEWL（图7.）.

4。讨论

AD是一种慢性炎症性皮肤病，病因复杂，包括免疫反应、易感基因、环境触发和皮肤屏障功能受损[1]．AD患者皮肤病变的特征是存在炎性浸润，包括T淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞[5.]．皮质类固醇等甾体药通常规定减轻广告的症状。然而，重复使用皮质类固醇会导致严重的皮肤萎缩，感染易感性和肾上腺抑制[16.]．NC / NGA小鼠源于日本花哨的小鼠作为自交系，每当在常规情况下饲养的时候自发地发展嗜酸性粒细胞，肥大细胞，淋巴细胞和巨噬细胞数量增加的ad样皮肤病变4.]．虽然SPF NC / NGA小鼠既不显示临床症状也不显示IGE大实生产，但既稳定地唤起湿疹也必须适用抗原或螨虫抗原[17.]．与这些报道一致，DNCB对NC/Nga小鼠背侧皮肤的表皮增敏和刺激诱发了AD样皮肤病变的发生率。苏木精、伊红和甲苯胺蓝染色的皮肤病变组织学检查显示表皮和真皮增厚，原因是白细胞浸润、增生、真皮溃疡以及皮肤上免疫细胞(如T细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞)的浸润。与对照组相比，nl组大鼠表皮和真皮厚度减少，免疫细胞浸润明显减少。活化的角质形成细胞过度产生趋化因子，如胸腺和活化调节趋化因子(TARC)，吸引免疫细胞进入表皮，导致棘皮病[4.]．在我们的在体外研究，治疗NL（250和500 μ.g/mL)处理24小时后，活化的角化细胞显著抑制TARC的产生(数据未显示)，表明抑制TARC抑制免疫细胞的浸润，从而抑制表皮增厚。此外，据报道，th2特异性趋化因子、TARC和单核细胞来源的趋化细胞因子及其受体CCR4在NC/Nga小鼠的病变中高表达[4.]．半抗原(如苦胆酰氯)通常用于诱发变应性皮炎，并被认为主要引起th1主导的反应。然而，最近有报道称，苦胆酰氯对小鼠皮肤的多次长期刺激会导致皮肤炎症转变为一种以th2为主的慢性炎症反应，类似于人类AD [18.]．研究证实AD血清IgE升高可能是由于Th1/Th2失衡向Th2倾斜所致，Th1/Th2失衡在AD的病理中起重要作用[19.]．肥大细胞是包括过敏性疾病和炎症反应在内的各种生物过程的重要参与者，它储存有生物活性的炎症介质，如组胺，并在其表面膜受体上表达IgE，具有高亲和力和特异性[20.]．抗原与表面结合IgE的相互作用引发一系列生化事件，最终释放组胺和产生细胞因子[21.]．组织学检查显示NL对肥大细胞脱颗粒有明显的抑制作用，可能是由于抑制IgE的过度生成。瘙痒症是一种引起AD患者抓挠欲望的不愉快感觉，可能与组胺、蛋白酶和细胞因子有关，这些细胞包括脱颗粒肥大细胞[22.]．在我们的研究中，NL抑制了抓挠的发作，这可能是由于抑制了肥大细胞的脱颗粒。与AD相关的皮肤干燥症和皮肤屏障功能障碍，是由于神经酰胺水平降低，加速水分流失和减少水电容，导致特应性皮肤干燥[23.]．在我们的研究中，使用NL可以抑制TEWL，从而改善皮肤状况。虽然半抗原重复致敏模型不是一个基因驱动的模型，但它的许多方面可能适用于外源性过敏原驱动的AD。综上所述，我们证明了口服NL可抑制DNCB对NC/Nga小鼠背侧皮肤反复增敏所致AD样皮肤病变的发展。NL含有大量木犀草素、槲皮素、异槲皮素等黄酮类化合物[15.]作为药理活性成分。这些类黄酮的抗炎作用表明它们可能对各种炎症性疾病有疗效[24.]．此外那口服NL 4周无明显的毒性作用，如减少摄食量和体重。因此，我们的实验结果表明，NL可能是一种潜在的自然资源，以管理AD，但参与治疗的作用机制仍有待探索。

5。结论

本研究提供了口头管理的证据N. Nucifera叶子提取物减弱了DNCB诱导的Atopic皮炎，如皮肤病变在NC / NGA小鼠中。虽然我们研究了NL在化学抗原诱导的模型中的影响，但是许多方面可能适用于外部过敏原驱动的广告。

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