文摘

背景。在肝脏病学实验研究都集中在发展中传统药物潜在的药理解决方案旨在保护肝脏免受肝硬化。沿着同一条直线,本研究调查了乙醇作为动力的影响从中药植物提取Boesenbergia圆形大厅(BR)在肝硬化。方法/结果。毒性的BR提取测试3组大鼠受到车辆(渐变20 10%,5毫升/公斤)和2 g /千克和5克/公斤剂量的提取,分别。接下来,实验上的硫代乙酰胺注射液引起的肝硬化大鼠模型。老鼠被分为五组,分别口服药物有10% Tween-20(5毫升/公斤)(正常对照组)、10% Tween-20(5毫升/公斤)(肝硬化对照组),50毫克/公斤的水飞蓟素(参照组),和250毫克/公斤和500毫克/公斤BR提取(实验组)每天8周。老鼠在正常组腹腔注射无菌蒸馏水(1毫升/公斤)3次/周,与其余组腹腔注射硫代乙酰胺(200毫克/公斤)三次每周。在8周的结束,动物被牺牲和采集样本进行全面的组织病理学、凝固和生化评价。同时,BR提取物的抗氧化活性测定并与水飞蓟素。急性毒性试验表明,提取的数据是安全的使用。老鼠的肝脏的组织学分析肝硬化对照组显示统一的粗颗粒的表面,hepatocytic坏死和淋巴细胞浸润。但是,表面形态看起来更为顺畅和细胞损伤小得多的肝脏的正常控制,水飞蓟素和BR-treated组。 In the high-dose BR treatment group, the livers of the rats exhibited nearly normal looking lobular architecture, minimal inflammation, and minimal hepatocyte damage, the levels of the serum biomarkers and liver enzymes read nearly normal, and these results were all comparable to those observed or quantified from the normal and silymarin-treated groups. The BR extract had the antioxidant activity about half of what was recorded for silymarin.结论。肝硬化的进展可以使用乙醇作为动力BR提取、干预和肝脏的房地产现状,结构和功能可以被保留下来。这种能力的提取需要进一步研究探索药物潜在的成功的意义治疗肝硬化的人类。

1。介绍

制药化合物与配方基于干扰素、宝贵、青霉胺,和糖皮质激素是目前治疗常见的肝脏疾病的肝硬化,脂肪肝、慢性肝炎,但药效不一致或副作用发生率高(1]。从植物中提取的天然化合物提供的替代治疗方案,是安全的和有效的2]。提取物新发现或已知植物物种不断测试动物模型系统模拟人类疾病和伤害(3]。目前,许多天然提取物用于治疗人体疾病的器官,但除了肝脏(4]。因此,潜在角色和这些提取物在肝脏疾病的有效性有待研究。一个从多年生草本植物中提取得到Boesenbergia圆形大厅这类(BR)是其中一个,等待探索它在肝脏疾病中的作用。

植物BR属于家庭姜科和传统上被称为temu kunci。具有独特的指状的根状茎,通常用作民间医药在治疗一些疾病包括口疮的东南亚,口干,胃不舒服,白带,痢疾。过去的科学调查报道,BR植物的提取分离使用各种解决方案(如甲醇、己烷、氯仿)有神经保护5),抗菌6,抗癌7],拒食素[8),和抗病毒9)的影响。methanol-based提取被证明含有化合物槲皮素和山柰酚,扮演着至关重要的作用在抗氧化和消炎瀑布或过程(10]。当己烷或氯仿是用于隔离的过程,结果提取包含其他重要的抗氧化剂:三黄烷酮类(pinostrobin、松属素和alpinetin)和两个化合物(cardamonin和boesenbergin) (11]。

我们实验室一直在调查各种植物提取物预防的治疗价值和保护肝脏毒素(12]。作为我们努力的延续,在这项研究中,第一次,我们评估了先前证明乙醇作为动力BR提取物的抗氧化性质在进步的肝损伤。特别是,我们测试了提取作为治疗的疗效剂对大鼠肝硬化模型诱导化学硫代乙酰胺(TAA)管理。我们一直使用这个实验模型,因为它密切模仿人类疾病的病因和病理观察。

客观地评价了BR提取对肝硬化的治疗价值,我们也采用另一种草药物质silymarin-a hepatoprotectant有根深蒂固的记录(13]。水飞蓟素是一种纯化从植物的种子中提取得到Silybum marianum和广泛应用作为一个支持性治疗肝脏疾病,如肝硬化、肝炎、脂肪酸渗透由于酒精和有毒化学物质(14]。我们将取得的积极作用与肝硬化肝脏的BR提取基准水飞蓟素所提供的保护。在下面,我们描述的每一个流程和过程用于我们的实验评估的抗氧化能力,毒性和BR提取的有效性。我们现在获得的大量数据显示病理和生化变化和没有提取物治疗组实验,详细讨论我们的发现关于theBR提取的价值作为一个潜在的代理保护肝脏免受肝硬化。

2。材料和方法

2.1。实验动物

动物协议管理实验动物实验伦理委员会的批准,医学院,马来亚大学、马来西亚和伦理数量点/ 07/05/2010 / MMA (a) (R)和PM / 28/08/2010 / MAA (R),雄性sd大鼠中6 - 8周大,体重在180和200 g从机构获得动物设施。在整个研究中,老鼠被关心人道和维护正常的昼夜节律遵循的指导方针提供的“指导护理和使用实验动物”由美国国家科学院和研究所发表的健康,马来西亚。老鼠有标准颗粒饮食和自来水,放在wire-bottomed笼子在25±2°C,暴露于12小时光明与黑暗周期,和住在一个动物的房间50 - 60%湿度范围。

这项研究是在三个阶段中执行。第一阶段涉及消除BR植物根茎的提取和测量其氧化性质。在第二个阶段,提取的毒性研究36(18男性和18个女性)健康斯普拉格Dawley老鼠。在第三阶段,提取的功效在抑制肝硬化的发展评估使用30只健康成年男性斯普拉格Dawley大鼠体重200 - 240克。这个实验阶段所需的化学诱导肝硬化TAA注射到老鼠和使用另一个植物提取水飞蓟素一个参考比较。

2.2。从植物中提取去除BR

新鲜根茎植物BR的购买从一个商业公司(人种资源有限公司Sdn,马来西亚雪兰莪州),并确定通过比较它与凭证标本存放标本的Rimba Ilmu,科学研究所的生物学、吉隆坡、马来西亚马来亚大学。洗后先用自来水和蒸馏水后,根状茎切片,留在一个阴影10天时间干。干样本然后建立精细,100克的粉混合在1000毫升95%的乙醇溶液在室温下为7天。乙醇提取物在减压蒸馏在Eyela旋转蒸发器(美国Sigma-Aldrich)和干在40°C孵化器3天给讨厌的收益率为9.49% (w / w)。口服的老鼠,最终产品的进一步溶解在渐变20 10% (w / v)和所需的政府表示为浓度的剂量毫克/毫升/公斤体重。

2.3。BR提取物的抗氧化能力

BR提取物的抗氧化能力是决定使用一个测试其对活性氧的清除能力或敏感试剂含有铁。在这方面,铁降低抗氧化能力(收紧)BR提取的决心使用下面的分析中描述的方法(15),但略微修改。收紧试剂是由混合300毫米醋酸缓冲(3.1毫克/毫升,乙酸钠pH值3.6),10毫米2,4,6-tripyridyl-S-triazine (TPTZ)(默克公司,德国达姆施塔特)解决方案和20毫米FeCl₃·H₂O(5.4毫克/毫升)。BR提取和以下标准:没食子酸、槲皮素、抗坏血酸、芦丁、Trolox,和2,6-di-tert-butyl-4-methyl苯酚(二叔丁基对甲酚),是在大量的采样10μ1毫克/毫升,10 Lμ每个连同10 LμL(0.1毫克/毫升水飞蓟素。每个样品分别,290年μL的试剂TPTZ补充道。由此产生的混合物的吸墨性阅读重复在每4分钟长达2小时使用ELISA读者(日本岛津公司、荷兰)在593 nm波长。我们注意到仪器的动态范围仅限于读剂量的500毫克/公斤BR提取和50毫克/公斤剂量对水飞蓟素老鼠日常管理,如下所述。来弥补这一缺陷,我们进行等量的测量获得的比例接种剂量增加了20倍,分别。的读数包含BR的混合物提取和水飞蓟素比较按照以下标准:没食子酸、槲皮素、抗坏血酸、芦丁、Trolox,和二叔丁基对甲酚(2,6-di-tert-butyl-4-methyl苯酚)14]。

2.4。BR提取物的毒性

BR提取物的毒性评估在正常健康老鼠通过显著高剂量的提取。老鼠被分配同样分成3组,每6雄性和雌性6,贴上车辆(Tween-20 10%, 5毫升/公斤)和2克/千克和5克/公斤的粉末制备、提取。老鼠剥夺食物而不是水加药前。食物是保留给药后3 - 4小时。动物被观察到在30分钟和2,4,8日,24日,48小时后口服检测临床或毒性症状的发作。动物们牺牲了15天。通过颈静脉,血液直接收集时的牺牲。组织凝血酶原时间和血清生化参数测定标准方法(后16]。

2.5。治疗组和实验

一组实验进行了测试BR提取对肝硬化的治疗效果。为此,三十雄性老鼠被获得,随机分为5组,每个由6大鼠。实验持续了8周,所有的老鼠都存活在这个时间段。分类的组织如下。

第1组作为正常对照组。这组大鼠口服药物有10% Tween-20每天(5毫升/公斤),腹腔内注射用无菌蒸馏水(IP)(1毫升/公斤)三次每周。

其余的老鼠组2 - 5暴露在硫代乙酰胺(TAA)毒性诱导肝硬化肝脏。持续的接触与这个数量的TAA诱发肝脏病理生理和形态方面的变化与肝硬化的病因中看到人类[17),因此常作为首选模型用于实验研究肝硬化。最高等级的TAA购买以晶体形式从Chemolab供应,(美国Sigma-Aldrich)。晶体在无菌蒸馏水稀释和搅拌直到完全溶解准备5 g / L的股票的解决方案。TAA IP每周3次注射的剂量(200毫克/公斤/毫升蒸馏水)(18]。

组2作为肝硬化对照组与肝硬化大鼠注射IP TAA每周3次的剂量(200毫克/公斤/毫升蒸馏水)和口服交付10%的渐变每天20(5毫升/公斤)。

组3是silymarin-treated组。在这组肝硬化大鼠口服药物与水飞蓟素(50毫克/公斤)。水飞蓟素(国际实验室,美国)是一个标准的药物和制备溶解在10%渐变20 [19]。

组4和5是治疗组,在肝硬化大鼠分别与BR提取口服250毫克/公斤,每日剂量500毫克/公斤。

我们合理化,上述协议的应用水飞蓟素治疗或并行BR提取使用TAA注入诱导肝硬化临床等效后尽快制定治疗肝硬化的诊断。在这方面,治疗是预防,因为它减缓肝硬化的发展和保护肝脏免受进一步恶化。

8周后,每只老鼠快速灌注治疗24小时后过去然后在氯胺酮(30毫克/公斤,100毫克/毫升)和Xylazil(3毫克/公斤,100毫克/毫升)麻醉(20.]。通过颈静脉,血液被撤回,收集对凝血酶原时间和生化检查。灌注后,肝脏切除,在冰冷的生理盐水清洗,涂抹在滤纸称重和仔细检查是否存在任何严重病理。肝脏组织进一步评估如下所述。

2.6。死后的肝组织分析

组织病理学分析,肝脏标本固定在10%缓冲甲醛、处理自动化组织处理机器,然后嵌入石蜡。部分准备在5μ米厚度,沾hematoxylin-eosin()),并在光学显微镜下检查。

确定正常的肝细胞,正常细胞的数量统计在肝硬化的中心区域和正常区域相邻两边的肝硬化区域使用光学显微镜油浸物镜(×40)覆盖0.15毫米²(21]。正常细胞的百分比计算使用公式:%正常细胞=[(正常细胞/(正常+凋亡细胞)×100)。

2.7。评价细胞损伤

丙二醛(MDA)是一种天然产品的脂质过氧化作用后细胞损伤,和作为细胞氧化应激的指标22]。酶超氧化物歧化酶(SOD)在管理抗氧化防御机制中扮演重要角色的活动,因此在预防疾病与氧化应激(23]。检查行动的BR提取的MDA和SOD水平在所有实验大鼠的肝脏组织1 - 5,肝脏组织提取,在盐水洗,均质10% (w / v)在50 mM冷磷酸钾缓冲(pH值7.4)通过使用tephlon均质器(Polytron, Heidolph RZR 1,德国),和处理在3500转10分钟在4°C离心机(德国贺利氏)。从上层清液MDA水平测量使用硫代巴比土酸作为脂质过氧化标记(24]。同样,SOD活性评估是基于描述的方法(25]。

2.8。生物化学分析

牺牲,老鼠的血液样本收集通过颈静脉进入管与柠檬酸钠测定凝血酶原时间的评估或gel-activated管血脂和生化标记如碱性磷酸酶(美联社)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、血清总蛋白、蛋白和胆红素。gel-activated管被允许结块,在3000转离心10分钟4°C。血清样本用于测量肝脏生化药剂。标记是spectrophotometrically化验standard-automated技术使用的设备在中央诊断实验室的马来亚大学的医疗中心。

2.9。统计分析

从实验测量组1 - 5进行评估统计,和统计组之间的差异决定使用单向方差分析其次是图基事后测试使用SPSS程序(SPSS Inc .版本18日,芝加哥,美国)。的值被认为是作为一个象征测量之间的统计上的显著差异的两个比较组。所有阅读和计算值被报告为±SEM。

3所示。结果

3.1。BR提取物的抗氧化特性

如图1铁降低抗氧化能力(收紧)1毫克/毫升的BR提取测量更易与1毫克,校准曲线方程,。的测量值相对低于标准没食子酸、槲皮素、抗坏血酸、芦丁、Trolox,和二叔丁基对甲酚,但是与参考药物水飞蓟素,阅读更易与0.1毫克。水飞蓟素包含几个抗氧化化合物扮演王亚南角色。BR提取可能扮演类似的角色,因为它具有自由基清除性质,因此帮助肝脏维持现状。

3.2。急性毒性试验

所有的大鼠急性毒性测试仍然活着,没有体现死亡率或任何可见的迹象,整个15-days-long毒性研究的高剂量BR提取2 g /千克和5克/公斤,他们接受。物理观测显示没有改变他们的皮和毛皮的迹象,眼睛和粘膜,行为模式,震颤,汞中毒,腹泻次数和睡觉。对雄性和雌性大鼠的体重逐渐增加,但相比没有显著不同的控制老鼠。总值验尸结果没有显示可见的任何器官的变化。临床观察,血清生化测量反映正常的肾脏和肝脏的功能状态,和组织病理学评价肾脏和肝脏组织一起显示没有明显差异之间的控制和测试组,如图所示的定量数据表1和2,定性数据图2。

3.3。肝硬化的BR提取的影响

3.3.1。体重和肝脏指数

每个老鼠的全身是加权之前牺牲。同样,肝脏切除后加权(表3)。控制大鼠组1中遵循自然增长的模式,达到正常体重增加约200 g - 347 g 8周。TAA的注入使大鼠肝毒素的(组2)和生长迟缓的加权(意味着= 217 g)大大小于测量从其他组。当身体重量的因素,肝硬化大鼠在2组肝指数最高(平均= 5.27)。水飞蓟素的老鼠和高剂量(500毫克/公斤)BR治疗组3和5,分别获得权重一样相当于正常大鼠组1。老鼠在低剂量(250毫克/公斤)BR治疗组4最好体重增加比组2,但不如那些获得在3和5组。

这些发现暗示治疗的结果是容易服用剂量,但这个大剂量的BR提取似乎是最优的,因为它是有效的水飞蓟素在抵消肝硬化的进展。根据这一点,我们建议使用500毫克/公斤BR在策略提取任何治疗计划的剂量目标来抵消未来肝硬化与平移实验研究的焦点。

3.3.2。大体解剖学和组织病理学

数据3和4总值分别描绘了表象和H&E-stained示例的部分肝脏样本实验1 - 5组。严重,控制老鼠的肝脏在组1(图3(一个))出现在红色,有光滑的表面,并没有显示任何结节的迹象。组织学检查(图4(一))显示,正常肝结构和正常的肝细胞板由正弦毛细血管和中央静脉。在肝硬化组2中,肝脏出现拥挤许多微和macronodules(图3 (b)),失去了正常结构的再生结节,由纤维septae从中央静脉门户三合会(图4 (b))。此外,纤维septae伴随着严重的炎症细胞胆管和重型入侵扩散。肝硬化结节显示厚厚的紫色的胶原纤维束。参考控制肝脏的水飞蓟素组3(数据3 (c)和4 (c))和高剂量的BR提取(数字3 (e)和4 (e))显示一个相对较小的micronodules,数量较小的纤维septae发展和扩张,增加扩展相比正常肝实质的参照组3。相反,低剂量的肝脏博世集团4被小macronodules占领和较小的纤维结节比参照组3,但尽可能多的改进并没有出现在3或5组。基于视觉评估这些结果提供进一步独立确认应用BR提取是有效保护肝脏免受肝硬化的进展。

3.3.3。细胞损失和生存

结果正常的肝细胞见图5老鼠在组1 - 5。数据显示,TAA的政府已经观察到显著减少正常肝细胞的数量从94%左右测量肝脏的正常大鼠组1到11%从在2组肝硬化大鼠的肝脏。Hepatocytic脂肪变性也在场。在低剂量BR(250毫克/公斤)治疗组4,正常细胞的人口是高,约71%。但是,高剂量的治疗BR保持更高数量的正常细胞,约为93%,几乎是等于从silymarin-treated获得那些老鼠在3组和类似的以同样的方式在组1正常大鼠。

的损失,探讨了肝硬化大鼠肝脏的肝细胞间接通过脂质过氧化与MDA和抗氧化剂与SOD酶活性,结果在数据绘制6和7。MDA水平读相对较高的价值nmol /毫克蛋白在肝硬化对照组相比,正常的阅读小组nmol /毫克的蛋白质。SOD读数跟随这个趋势,但相反,这意味着肝硬化大鼠在2组较低的价值u /毫克的蛋白质比μ/毫克蛋白组1的法线。这些结果表明肝硬化肝脏严重受损细胞的存在。治疗的肝硬化大鼠BR提取大大帮助肝细胞的存活的同时降低MDA和SOD含量增加低收入和高剂量组,但后者的效果更加明显。低收入和高剂量组,MDA读取蛋白质与nmol /毫克nmol /毫克蛋白和SOD读取u /毫克蛋白与分别u /毫克的蛋白质。MDA和SOD读数正常组蛋白质和nmol /毫克u /毫克蛋白,分别为水飞蓟素和相应的值治疗组蛋白质和nmol /毫克分别u /毫克的蛋白质。这些结果共同表明,BR处理提供了宿主环境有利于防止和保护肝细胞免受进一步的损失。

3.3.4。肝脏标记和血脂水平

每个大鼠肝功能测定通过确定等离子体的特定的肝酶和血脂水平,和表中给出的结果4,5,6。根据表中的数据4和5,TAA-induced肝损伤明显的特定的肝酶水平升高美联社,ALT、AST、LDH、胆红素、凝血酶原时间比()和显著下降的肝硬化大鼠蛋白和白蛋白水平组2与那些从其他组。同样,肝硬化大鼠的血脂水平显著改变,胆固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯水平更高,高密度脂蛋白水平较低(表6)。高剂量BR(500毫克/公斤)治疗组5导致读数的生化标记与对照组1和silymarin-treated第三组(50毫克/公斤),和比数据从低剂量的治疗获得BR(250毫克/公斤)4。这些数据进一步支持定性总值解剖,组织病理学发现,定量细胞计数,上面提到,和证明毒性的影响引起的TAA对肝脏功能的积极作用可以有效地抵消了BR提取物治疗,但剂量依赖性的方式。

4所示。讨论

肝硬化已经成为一个严重的公共卫生问题,因为更广泛的使用处方药的副作用在现代生活或物质滥用。因此,目前的研究都集中在理解底层的新陈代谢和随后找到新的治疗方案,中断信号通路,减少对肝脏造成的损失(26]。超出了搜索策略与合成药理学,还追求替代方法,依靠天然产品。特别是,它针对的是那些植物在民间医学与已知的历史或展示了潜在的积极影响对肝脏或其他器官的疾病27]。帮助这些努力,在这项研究中,我们研究了乙醇作为动力的潜力从植物中提取BR作为一个有前途的治疗治疗肝硬化代理。

在第二阶段的研究中,我们测试了BR提取物的毒性。我们的数据在图2和表1和2显示,高剂量的提取没有造成显著的肝脏和肾脏病理异常,和临床生物化学读数保持在正常范围内。这些结果与先前的报道是一致的安全消费BR提取(28]。

在第二组实验中,我们检查了BR提取的影响肝硬化发展的进程。肝硬化条件引起的长时间暴露于TAA。操纵的TAA剂量产生不同等级的肝损伤可能范围从肝脏实质细胞坏死和细胞增殖的生产pseudolobules和结节性肝硬化(29日]。在这项研究中,我们选择200毫克/公斤剂量为2个月,因为这个协议IP据报道,产生类似人类肝硬化病因在解剖学方面,结构,功能和架构组织特点以及常见的生化标记上的读数(30.]。相同的再次重申了共同的结节的定性体外可视化数据3和4,定量数据下半身肝硬化大鼠的权重表3在肝脏,生化失衡标记表4和5,改变脂质资料表6。因此,我们的实验大鼠肝硬化模型是适合测试任何应用临床治疗的疗效与临床翻译的焦点。

TAA的行动在肝硬化的发展被认为是多方面的,涉及多种机制(19]。例如,TAA干扰RNA从细胞核转移到胞浆通过其代谢物thioacetamide-S-oxide塔索(TASO) (₂)。的妥协有关肝细胞RNA转移导致肝细胞死亡通过细胞凋亡和坏死的过程31日]。定量组织病理学分析表明存在严重的肝细胞的百分比以来可行的细胞被大幅降低11%的肝硬化大鼠Group2超过94%在组1(图的法线5)。脂质过氧化反应也是一个公共事件的不良现象,导致细胞死亡的降解膜脂质(32]。通过另一种途径,TAA毒性导致的肝损伤刺激过多的活性氧的生产(33]。这种效应在数据记录6和7。数据表明,肝细胞受到氧化应激,脂质过氧化作用是普遍反映的更大的MDA读数,抗氧化防御机制是失败的暗示的减毒SOD读数。

肝硬化肝脏对与BR提取物在治疗剂量(250毫克/公斤和500毫克/公斤)和参考提取水飞蓟素剂量50毫克/公斤。每一个治疗方案明确了显著的进展在解剖,结构,功能,和建筑否则肝硬化肝脏的签名。保护肝脏的功效与BR剂量越高,然而略好,令人鼓舞的是非常接近的水飞蓟素。几乎相同的反应之间的高剂量BR和水飞蓟素治疗可以解释为这两个提取物的抗氧化能力,收紧断言的测量图1。

在治疗大鼠血清ALT水平的崛起,AST,美联社,LDH,胆红素与白蛋白的水平的下降和总蛋白被预防的。恢复平衡的趋势血清化学物质可能归因于BR提取的容量调节肝脏抗氧化状态或直接参与激进的扫气过程(34]。TAA的新陈代谢,抗氧化剂对氧化应激扫塔索(TASO)副产品₂的大小,从而减少对肝脏的影响。酚化合物是非常有效的抗氧化剂,并有很强的自由自由基清除能力(35]。多酚和类黄酮用于治疗许多疾病,包括肝硬化。类黄酮(槲皮素和山柰酚)存在于植物BR和因此可能负责膜稳定活动证明了观察到的降低血清肝酶。降低胆红素水平意味着更稳定的红细胞等离子体膜的存在。这个结果暗示BR膜提取稳定肝细胞,因此打断肝酶的释放进入血液(36]。BR提取物对脂质过氧化的抑制作用的高分子膜又可以归功于黄酮类含量的清除效果的植物37]。

5。结论

引起肝硬化的进展TAA的老鼠可以抑制使用乙醇作为动力BR提取。具体地说,这种自然提取有权保护肝脏,预防肝硬化的有害事件的级联。水飞蓟素的效果相媲美(50毫克/公斤)时,对应的每日剂量为500毫克/公斤。BR提取保护肝脏的功能现状的财产,结构和功能对毒素暴露是令人鼓舞的,需要进一步研究。药物潜在的成功的意义治疗肝硬化可以被映射的分子途径探索未来的行动。

确认

本文是由马来亚大学科研补助金pv042 - 2011 a和高影响科研补助金(hir - f000009 - 21001)。