出芽酵母“酿酒酵母“作为一种药物发现工具，用于鉴定具有抗增殖特性的植物源性天然产物

摘要

芽胞酵母酿酒酵母是研究细胞周期调控的一个有价值的系统，而细胞周期调控在癌细胞中是有缺陷的。由于酵母和人类之间的细胞周期机制高度保守，酵母研究与抗癌药物的发现直接相关。由于真菌基因的功能保守性，芽殖酵母也是鉴定和研究抗真菌化合物的一个极好的模型系统。此外，酵母研究也大大有助于我们了解生物活性化合物的生物靶点和作用模式。了解临床相关化合物的作用机制对于设计改良的第二代分子至关重要。在这里，我们描述了我们在酵母中筛选植物源性天然产物文库的方法，以便识别和表征具有抗增殖特性的新化合物。

1.介绍

尽管人们对癌症的认识和资源投入不断增加，但几十年来癌症发病率并未下降，事实上，在某些地区，癌症发病率正以惊人的速度上升。尽管投入了大量的研究经费，但新型抗癌药物的数量在过去二十年中保持不变。筛选潜在新药的天然产物是发现新的、廉价的和有效的治疗癌症药物的最佳途径[1.,2.]．

摩洛哥拥有丰富的药用植物，广泛应用于民间医学，用于预防或治疗多种疾病。摩洛哥独特的地理位置包括地中海地区的所有生物气候阶段，其中以~42 对摩洛哥治疗师使用的药用植物数量的估计表明，数百种含有数千种生物活性化合物的植物可用于治疗人类疾病[3.–8.]．然而，对这些具有生物活性的天然化合物进行鉴定和在细胞水平上研究其作用或作用机制往往是困难的。因此，要了解这些天然化合物的作用，就需要开发高分辨率、低成本的生物检测系统。

芽胞酵母酿酒酵母由于真菌基因的功能保守性，是鉴定和研究抗真菌化合物的极好模型系统。因此，为了加速发现具有抗真菌活性的生物活性化合物，Gassner等人[9]我们已经开发了一种自动化的酵母毒性筛选方法，称之为高通量（HT）酵母晕分析法。酵母研究也大大有助于我们了解生物活性化合物的生物靶点和作用模式[10–14].了解临床相关化合物的作用机制对于设计改良的第二代分子至关重要。基于酵母的功能基因组学技术是临床相关化合物机理研究的极好手段。由于酵母和人类之间的细胞周期机制具有高度保守性，芽殖酵母也是研究细胞周期调控的一个极好的模型系统[15–17]因此，酵母研究与抗癌药物的发现直接相关[10,18]．在这里，我们通过一个例子，展示了我们的程序，以鉴定和鉴定新的植物源天然产品的抗增殖特性，使用芽殖酵母作为药物发现工具。

2.生长抑制化合物的选择

为了识别具有潜在治疗价值的新分子，我们首先构建了一个由植物化学家提供的化学分子库。接下来，我们评估了这些分子在酵母中的生长抑制作用，以确定具有抗真菌活性的化合物。因此，从分析的40种植物提取物和14种纯化的植物源性天然分子中，我们鉴定出14种植物提取物和8种具有明显生长抑制作用的天然分子。我们在这里展示了Lyc的特性，Lyc是一种植物源性天然生物碱产品。为了评估Lyc对酵母生长的影响，对数期的酵母细胞在有或没有Lyc的情况下培养。如图所示1.，添加Lyc导致酵母细胞的生长速率显著降低，表明Lyc在酵母中表现出生物活性，从而抑制生长。利用该筛选，我们选择了一些生长抑制化合物，对其进行了进一步表征，以了解其作用方式。

3.的作用机制

3.1.细胞周期分析

细胞周期分析首先用于确定一种化合物是否会引起细胞周期紊乱酿酒酵母，通过使用荧光激活细胞分选（FACS）测量DNA含量，很容易监测细胞周期进程[18]．例如，在呈指数增长的培养物中，1C DNA含量的细胞异常积累通常表明细胞周期G1期存在缺陷。因此，为了进一步研究Lyc处理引起的生长缺陷，使用FACS分析评估细胞周期进展。对数生长培养物在Lyc存在或不存在时进行培养。在指定的时间固定样品，并用流式细胞仪测量每个样品中细胞的DNA含量(图)2.)。与无药物对照培养相比，观察到具有1C（或G1）DNA含量的细胞数量从2开始增加 在Lyc处理4小时和8小时后，DNA含量异常（1C和2C）的细胞积累明显。因此，这些结果表明Lyc干扰了细胞周期进程。

3.2.表型分析

酿酒酵母通过出芽分裂，并在细胞周期的不同阶段显示特定的细胞形态。细胞周期中，未出芽细胞处于G1期，小出芽细胞处于S期，大出芽细胞处于G2/M期(图)3（a）)因此，通过使用荧光显微镜和差分干涉对比显微镜简单地观察细胞，很容易监测细胞周期进程。因此，为了进一步研究Lyc对细胞周期进程的影响，对数期的酵母细胞在有或没有Lyc的情况下孵育，然后通过差分干涉对比显微镜观察trast（DIC）显微镜。我们发现，经Lyc处理的细胞表现出特征性的形态改变，大多数细胞要么未包埋，要么多芽异常（图1）3（a）)此外，细胞DNA的DAPI染色显示，处理过的细胞通常有一个碎裂的细胞核（图3（a））.大多数细胞都有两个或两个以上的dapi染色细胞核片段，表明Lyc破坏了细胞核的完整性，这与同一细胞样本FACS分析中观察到的DNA含量异常的细胞积累相一致(图)3（b）)此外，我们对有或无Lyc的未包涵体（G1）、小芽（S）、大芽（G2/M）和异常细胞的比例进行评分。如图所示3 (c)与无药物对照相比，Lyc处理的大部分细胞均出现异常(41%的大未芽细胞和22%的多芽细胞)，只有少数细胞处于细胞周期的S期或G2/M期。综上所述，这些数据表明，Lyc的治疗可能会损害正常的细胞周期进程，这可能是核分裂的结果。然而，为了更详细地分析Lyc对细胞周期进程的影响，细胞应该在细胞周期的特定阶段被阻滞，然后同步地释放到细胞周期中[19–21].为了检测G1或S期进展缺陷，可以使用交配信息素α因子将细胞阻滞在G1期，然后释放到含或不含Lyc的培养基中。相反，在G2期阻滞后，可以使用微管抑制剂诺可达唑检测有丝分裂缺陷，然后释放到含或不含Lyc的培养基中。

3.3.化学遗传图谱

基于酵母的功能基因组学技术是对具有抗真菌活性的化合物进行机理研究的极好手段。特别是，化学遗传图谱已被用于研究许多生长抑制化合物的作用模式。最近，在一份概念证明手稿中，我们证明了化学遗传图谱酵母对了解人体细胞中生物活性化合物的作用方式有很大贡献[10]简言之，在这些分析中，纯合子（或MATα单倍体）每个不同基因中的活缺失突变体首先在生长抑制化合物存在或不存在的情况下生长。然后，在生长后，通过杂交侧翼的独特DNA序列，识别在化合物存在的情况下代表性不足且因此敏感的缺失菌株在DNA微阵列上对其补体的每个缺失[10–14]．该系统识别一组对给定化合物高度敏感的缺失突变株，称为化学-遗传图谱。这些研究的结果通常决定了哪些途径对耐药是重要的，因此提供了对复合作用模式的见解。为了识别药物靶点，我们使用一套完整的杂合缺失菌株进行化学-遗传分析。在第二种概要分析中，称为haplo不足概要分析(HIP)，它是所有概要分析的池集合~6000个杂合缺失突变体，每个都在不同的基因中，可以在药物存在或不存在的情况下生长。然后，通过对每个菌株的pcr扩增条形码进行DNA芯片分析，确定菌株的适合度。对药物最敏感的杂合菌株携带编码可能药物靶标的基因缺失[11]．

因此，为了确定Lyc的作用模式，使用完整的条形码基因库进行化学遗传分析MATα单倍体可行缺失株。初步数据显示，对Lyc最敏感的突变体参与翻译调控，提示该化合物可能影响蛋白质的生物合成。需要进一步的研究来证实这一结果，并确定Lyc的精确靶标。

4.结论

芽胞酵母酿酒酵母是鉴定具有抗增殖特性的植物源性天然产物的极好模型系统。作为原理证明，我们表明，经Lyc处理的酵母细胞表现出细胞周期扰动、细胞核碎片和形态改变。具有这些特性的化合物是进一步研究的极好候选物，因为它们具有它是细胞周期调节机制的靶向成分，因此可能具有具有治疗价值的抗增殖特性。这类化合物可用于治疗癌症等增殖性疾病，或治疗真菌感染。

致谢

作者感谢Richelle Sopko对显微镜的帮助。M.Bellaoui感谢发展中国家科学院（TWAS）和“促进发展大学委员会（CUD，比利时）”的支持。

工具书类

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