文摘

亚细亚酸(AA)、五环三萜烯化合物的药用植物积雪草的评估antinociceptive和抗炎作用。治疗雄性ICR小鼠AA显著抑制醋酸段的数量倒在formalin-induced疼痛反应和晚期阶段。在抗炎测试中,AA减少第四和第五的爪子水肿h后λ卡拉胶(卡尔)管理和过氧化氢酶(CAT)的活动增加,超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)在肝脏组织。AA减少一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),interleukin-1β(il - 1β)水平对血清水平5 h后卡尔注入。西方墨点法表明AA减少Carr-induced诱导一氧化氮合酶(间接宾语),环氧合酶(cox - 2)和核因子-κB (NF -κB)表达式在水肿5 h爪子。腹腔内(i.p)注射治疗AA也减少中性粒细胞浸润到网站一样的炎症消炎痛(印度)。AA的抗炎机制可能与降低MDA的水平,进气阀打开,cox - 2和NF -κB在水肿爪子通过猫的活动增加,SOD、GPx肝脏。

1。介绍

三萜烯biosynthesized在植物角鲨烯的环化,并广泛分布在植物王国。此外,他们的生物活动吸引了太多的关注。很多常用药用显示有前途的影响当应用抗炎剂(1]。特别是,AA属于ursane-type常用药用和来源于药用植物积雪草的在热带地区,它是用作医学(2]。AA可以防止UVA-mediated光老化,抑制β-amyloid-induced和glutamate-induced神经毒性,具有抗溃疡的antihepatofibric活动(3]。此外,据报道表现出对肝细胞毒性作用,结肠癌,乳腺癌细胞(4)和神经在小鼠局灶性脑缺血模型(5]。

Carr-induced爪子水肿是一个有用的模型来评估血管变化与炎症有关。Subplantar注射卡尔在小鼠体内诱导的水肿是双向的。第一阶段的峰值在3 h,卡尔和延迟阶段的峰值在48 h后注入。在早期阶段,有弥漫性细胞浸润多形核白细胞(中性粒细胞)而延迟的渗透阶段是由巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞(6]。卡尔引起的炎症效应可能与自由基有关。自由基,前列腺素,没有将与卡尔时释放管理1 ~ 5 h。水肿的效果是提高到最大值第三h, MDA和它的生产是由于自由基攻击质膜(6]。因此,炎症效应将导致MDA的积累。因此,在本文中,我们研究了AA的镇痛效应对醋酸引起的痛觉过敏和福尔马林。我们也评估AA的抗炎效应在老鼠爪子水肿引起的卡尔,我们发现MDA的水平,不,TNF -α,进气阀打开,cox - 2在爪子水肿或血清。猫的活动,在肝脏SOD、GPx第五h后卡尔注入了理解之间的关系的抗炎机制AA和抗氧化酶。

2。方法

2.1。化学物质

积雪草酸(图1)、卡尔和消炎痛(印度)从σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。醋酸是从默克公司购买(达姆施塔特,德国)。福尔马林从日本购买Shiyaku产业(日本)。肿瘤坏死因子-α和il - 1β买来Biosource International Inc .(贝南、钙、美国)。Anti-iNOS、anti-COX-2 anti-NF -κB (p50)和反β肌动蛋白抗体(美国圣克鲁斯)和蛋白质分析工具包(Bio-Rad实验室有限公司,沃特福德,赫特福德郡,英国)得到显示。聚偏二氟乙烯膜(Immobilon-P)从微孔中获得公司(美国贝德福德,MA)。

2.2。动物

6 - 8周雄性ICR小鼠从BioLASCO获得台湾有限公司有机玻璃有限公司动物们被关在笼子里的恒温°C,相对湿度%的12小时的暗光周期前至少2周的实验。他们提供食物和水随意。所有试验程序进行根据美国国立卫生研究院指导实验室动物保健和使用的。所有测试的指导下进行国际疼痛研究协会(7]。

2周后适应时期,雄性ICR小鼠(g)年龄在18岁至25岁之间的被随机分配到五组()的动物在醋酸段扭动(1%,0.1毫升/ 10 g i.p。)和formalin-induced舔(5%,20μL / /老鼠i.p。)实验。这些包括病理模型组(收到醋酸或福尔马林),一个积极的控制(醋酸或福尔马林+印度),和AA-administered组(醋酸或福尔马林+ AA: 1、5和10毫克/公斤)。在Carr-induced水肿的实验,被随机分配到六组()的动物研究。对照组接受生理盐水(i.p)。其它五组包括Carr-treated、积极控制(卡尔+印度),和AA-administered团体(卡尔+ AA: 1、5、10毫克/公斤)。

2.3。醋酸段扭动响应

常描述的测试进行et al。8]。扭动被一个腹腔诱导(i.p)注入0.1毫升/ 10 g醋酸溶液(10毫升/公斤)。积极控制动物使用印度(10毫克/公斤,i.p。)醋酸前25分钟。每一个AA- - - - - -管理组使用1毫克/公斤,5毫克/公斤,或10毫克/公斤(羧甲基纤维素溶解在0.5%)i.p。醋酸前25分钟。五分钟后腹腔注射醋酸,扭动和伸展的数量被记录。

2.4。福尔马林测试

药物的antinociceptive活动决心使用福尔马林测试(8]。20毫升的5%福尔马林注入的背表面的后爪老鼠30分钟后ip管理AA(1、5、10毫克/公斤),或挪作他用。老鼠注射福尔马林观察30分钟后,和注射后时间舔爪子被记录。后的第一个5分钟注射福尔马林被称为早期阶段和时期15分钟和40分钟之间的后期阶段。所花费的总时间舔或咬受伤的爪子(疼痛行为)用秒表测量。活动被记录在5分钟的间隔。

2.5。λ-Carrageenin-Induced水肿

Carr-induced后爪水肿模型用于测定抗炎活动(8]。动物是ip处理AA(1、5、10毫克/公斤),挪作他用,或生理盐水,30分钟前注射1%的卡尔(50μL)在足底的后爪老鼠。爪子成交后立即测量卡尔注入和在1 - 2 -,3 -,4 - 5小时的时间间隔后,使用plethysmometer edematogenic代理的管理(型号7159,尤格Basile,瓦雷泽,意大利)。肿胀的程度评估了诱导率,在那里的体积是正确的后爪卡尔治疗后,然后呢的体积是正确的后爪卡尔治疗前。印度作为一个积极的控制。5小时后,动物牺牲;Carr-induced水肿的脚被解剖,储存在−80°C。此外,血液被撤回,保持在−80°C。样品的蛋白浓度是由布拉德福德染色法测定(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。

2.6。MDA测定

MDA从Carr-induced浮肿的脚被评估硫代巴比土酸反应物质(流泪)方法(8]。简而言之,MDA与硫代巴比土酸反应的酸性高温,并成立了一个red-complex TBARS。的吸光度TBARS决心在532海里。

2.7。测量一氧化氮/亚硝酸盐

没有生产间接评估通过测量血清由亚硝酸盐含量比色法的基础上,格里斯反应(8]。血清样本稀释四倍通过添加1/20体积的蒸馏水和脱去蛋白质的硫酸锌(300 g / L)的最终浓度15 g / L。在10000×g离心5分钟后在室温下,100μL上层清液应用于微升盘好,其次是100μL格里斯试剂(1%磺胺和0.1%N多磷酸1-naphthylethylenediamine盐酸盐在2.5%)。经过10分钟的颜色开发在室温下,吸光度测量在540 nm Micro-Reader(分子器件、奥尔良,桑尼维尔,美国)。通过使用亚硝酸钠生成标准曲线,亚硝酸盐的浓度是由吸光度测量在540海里。

2.8。测量血清TNF -α和il - 1β通过ELISA

血清肿瘤坏死因子水平α和il - 1β确定使用商用酶联免疫吸附试验(ELISA)工具包(Biosource International Inc .,打击士气、钙、美国)根据制造商的指示。肿瘤坏死因子-α和il - 1β从标准曲线测定。浓度被表示为pg / mL。

2.9。抗氧化酶活性的测量

以下生化参数分析检查AA的王亚南活动下面的方法。

总SOD活性的抑制细胞色素c还原(9]。细胞色素c的减少是由超氧化物阴离子生成黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统和监控在550海里。一个单位的草皮被定义为所需的酶,抑制细胞色素c的速度降低了50%。猫总活动是基于Aebi [10]。总之,减少10毫米H₂O₂20毫米的磷酸盐缓冲剂(pH值7.0)是通过测量吸光度监测在240海里。活动使用摩尔吸光系数计算,和消散的酶活性被定义为nmol过氧化氢/毫克蛋白/分钟。总GPx活性细胞溶质决心根据屋和情人节的方法(11]。酶的解决方案是添加到混合物中含有过氧化氢和谷胱甘肽在0.1毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH值7.2)和340海里测定的吸光度。活动评估从校准曲线,酶活性被定义为nmol每分钟每毫克NADPH氧化蛋白质。

2.10。免疫印迹分析,进气阀打开,cox - 2和NF -κB

软组织被从个人老鼠的爪子和均相溶液包含10毫米的家伙,1毫米phenylmethylsulphonyl氟化物(PMSF) 5μg / mL,抑肽酶,1μM抑肽素,10μ米亮抑酶肽。匀浆是离心机在12000 g 20分钟,30μg蛋白的上层清液然后分开10%钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶和转移到聚乙二烯二氟化物膜。转让后,膜被2 h与5%的脱脂牛奶在室温下Tris-buffered saline-Tween (TBST;20毫米三,500毫米氯化钠,pH值7.5,0.1%渐变20)。与鼠单克隆anti-iNOS膜被孵化,anti-COX-2或anti-NF -B (p50)抗体在TBST 5%脱脂牛奶在室温下2小时。膜在室温下与TBST洗了三次,然后孵化1:2000稀释antimouse免疫球蛋白二次抗体结合辣根过氧化物酶(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)在2.5%的脱脂牛奶在室温下TBST 1 h。膜清洗三次,增强化学发光免疫反应性的蛋白质进行检测(ECL)使用hyperfilm和ECL试剂(Amersham国际公司。英国白金汉郡)。免疫印迹分析的结果量化测量的相对强度比控制使用柯达分子成像软件(版本你,伊士曼柯达公司,罗切斯特,纽约,美国)和代表的相对强度。

2.11。组织学检查

组织学检查、活检的爪子被5 h后卡尔的星际注入。组织切片固定在(1.85%甲醛,1%乙酸)1周在室温下,分级乙醇脱水,嵌入在石蜡(舍伍德医学)。部分(厚度5μ米)与二甲苯和沾染了H & E deparaffinized污渍。所有样品和尼康显微镜观察和拍照。每3 ~ 5组织切片随机选择从卡尔,挪作他用,AA-treated(10毫克/公斤)组。组织学检查的组织切片显示过度炎症反应通过显微镜与大量中性粒细胞浸润。中性粒细胞的数量在每个计算之后(400 x)和他们的平均范围从5数范围的组织切片。

2.12。统计分析

数据表示为均值±S.E.M.统计学评价是由单向方差分析(方差分析其次是矫正的多个范围测试)。统计学意义是表示为*,* *和* * *。

3所示。结果

3.1。AA Acetic-Induced痛苦的反应的影响

腹部拉伸的累积量与醋酸的水平段疼痛(图2)。AA治疗(1毫克/公斤)相比显著地抑制扭动的数量与正常对照组()。AA(5或10毫克/公斤)进一步降低扭动的数量(或),以及AA(10毫克/公斤)演示了抑制比印度(10毫克/公斤)。

3.2。福尔马林测试

AA(1毫克/公斤)显著()抑制formalin-induced疼痛后期阶段(图3);然而,它没有任何抑制早期阶段。积极控制印度(5或10毫克/公斤)也显著(或)抑制formalin-induced痛苦晚期阶段。

3.3。AA的影响λ-Carrageenan-Induced老鼠爪子水肿

如图4,卡尔诱导爪子水肿。AA(5或10毫克/公斤)抑制(或)发展的爪子水肿引起卡尔4和5 h后治疗,明显。印度(10毫克/公斤)显著降低Carr-induced爪子水肿治疗4和5 h后()。

3.4。AA对MDA的影响水平

MDA水平显著增加水肿的爪子5 h后卡尔注入()。然而,MDA水平显著降低了治疗AA(5毫克/公斤;),以及10毫克/公斤挪作他用(图5)。

3.5。AA对没有水平的影响

在图6(一)血清NO水平显著增加,水肿5 h后卡尔注入()。AA(5或10毫克/公斤)显著降低血清没有级别(或)。抑制效果是类似于印度(10毫克/公斤)在第五h后归纳。

3.6。AA对肿瘤坏死因子的影响α和il - 1β水平

肿瘤坏死因子-α和il - 1β在血清水平显著增加第五h卡尔注射后()。然而,AA(5或10毫克/公斤)降低TNF -α和il - 1β在血清水平第五h卡尔注射后(或),以及10毫克/公斤挪作他用(图6 (b)和6 (c))。

3.7。抗氧化酶的AA对活动的影响

与生产相关的急性炎症反应是活性氧(ROS)如超氧化物阴离子、过氧化氢、过氧硝酸盐。在许多病理生理条件与炎症或氧化剂应激有关,这些ROS提出调解在肝脏细胞损伤(1]。在第五h卡尔intrapaw注入后,肝组织生化参数的分析如猫、SOD、GPx活动(表1)。猫,在肝组织SOD、GPx活动明显减少了卡尔。猫、SOD、GPx活性治疗后显著增加了10毫克/公斤AA和10毫克/公斤挪作他用;表1)。

3.8。AA的影响λ-Carrageenan-Induced伊诺,cox - 2和NF -κB蛋白表达小鼠爪子水肿

转录的促炎介质如伊诺,cox - 2, TNF -α,il - 1β是由激活的转录因子NF -κB (1AA在伊诺的作用,cox - 2和NF -κ免疫印迹B蛋白表达进行了研究。等量的蛋白质(30μg / lane)解决了sds - page,然后转移到硝酸纤维素和进气阀打开,cox - 2和NF -κB使用一个特定的抗体检测。结果表明,注入Carr-induced AA(10毫克/公斤)的爪子水肿5 h抑制伊诺,cox - 2和NF -κ(图B蛋白表达7(一))。的检测β肌动蛋白也执行相同的污点作为内部控制。蛋白质带的强度进行了分析使用柯达数量软件(分子成像软件系统,柯达)在三个独立的实验中,平均为77.6%,72.4%,进气阀打开,差别,62.8%的人对这些cox - 2和NF -κ治疗后B蛋白分别与AA 10毫克/公斤而Carr-induced一单独(图7 (b))。蛋白表达显示平均为43.6%,41.1%,进气阀打开,差别,36.4%的人对这些cox - 2和NF -κ治疗后B蛋白与印度相比10毫克/公斤Carr-induced一单独(图7 (b))。的差别,对这些伊诺,cox - 2和NF -κB AA(10毫克/公斤)的活性比印度(10毫克/公斤)。

3.9。组织学检查

Carr模型动物的爪子活检显示标志着结缔组织细胞浸润。胶原纤维之间的浸润积累,进入细胞间隙。爪子活检动物对待AA(10毫克/公斤)显示Carr-induced减少炎症反应。炎症细胞实际上是减少的数量和局限于血管附近的地区。细胞间的空间没有任何细胞的渗透。胶原纤维是常规的形状,减少细胞间的空间。此外,皮下组织结缔组织并未损坏(图8)。中性粒细胞与卡尔治疗明显增加)。印度和AA(10毫克/公斤)可以显著降低中性粒细胞数量比Carr-treated集团()(图8 (e))。

4所示。讨论

我们已经评估了假定的镇痛和抗炎活动AA澄清疼痛和炎症的缓解效果。两个不同的镇痛的客观测试方法被确定可能的外围和中心测试物质的影响。醋酸翻滚测试通常是用于研究外周镇痛药物的影响。尽管这个测试是特异性的(例如,抗胆碱能、抗组胺剂和其他代理也显示测试)的活动,它是广泛用于止痛剂筛选[12]。在我们的研究中,我们发现AA(1、5、10毫克/公斤)展出的antinociceptive效果乙酸段扭动响应(图2)。这种效应可能是由于抑制花生四烯酸代谢物的合成(13]。

的在活的有机体内模型的疼痛,formalin-induced爪子疼痛,被确立为一个有效的镇痛研究模型。众所周知,福尔马林试验会产生截然不同的两相的痛觉,第一阶段(持久的第一个5分钟)对应于急性神经源性疼痛,和第二个阶段(从15到30分钟之后持续注射福尔马林)对应于炎性疼痛反应(14]。因此,测试可以用来澄清的可能机制antinociceptive提议镇痛的效果。集中作用药物如阿片类药物抑制同样两个阶段,但外围地药物,如阿司匹林、挪作他用,地塞米松抑制后期阶段(15]。AA的抑制作用对疼痛的反应后期阶段的福尔马林试验表明,AA的anti-nociceptive效应可能是由于其外围行动(图3)。

卡尔的注射小鼠产生典型的两相的水肿与生产相关的多种炎症介质,如缓激肽、前列腺素、一氧化氮、细胞因子。卡尔测试对非甾体类抗炎药物高度敏感,并一直被认为是一个有用的炎工具为研究新的药物疗法(16]。肿胀的程度卡尔注入爪子是最大侧吹风h后注入。统计分析表明,AA(10毫克/公斤)和印度尼西亚显著抑制水肿的发展在四小时后治疗(;图4)。他们都有抗炎作用Carr-induced老鼠水肿爪子。众所周知,第三阶段的卡尔引起的水肿,水肿体积达到最高,特点是前列腺素的存在和其他化合物的缓慢反应(17),卡尔发现注射到老鼠的爪子诱发血管舒缓激肽的解放,后来诱发前列腺素的生物合成和其他内分泌物,负责炎性渗出液的形成。此外,antinociceptive药物的分类通常是基于他们的作用机制在中枢神经系统和周围神经系统(18]。

在Carr-induced爪子水肿没有起着重要的作用。伊诺表示在这个模型注射后4小时内卡尔。没有维护的后续生产水肿。在炎症的机制的研究,L-arginine-NO途径提出了Carr-induced炎症反应中起着重要的作用[19]。我们目前的结果也证实Carr-induced爪子水肿模型生产没有结果。没有合酶的诱导同种型的表达已被建议作为一个重要的调停人的炎症(20.]。在我们的研究中,水平没有显著降低了治疗1、5、10毫克/公斤AA。我们建议AA的抗炎机制可能通过AA以来L-arginine-NO通路显著抑制没有生产(图6(一))。

肿瘤坏死因子-α是一个主要的中介在炎症反应,诱导先天免疫反应激活T细胞和巨噬细胞和其他刺激分泌炎性细胞因子(21]。同时,肿瘤坏死因子-α是中介Carr-induced炎症无能力和能够诱导细胞分裂素的进一步释放和白细胞三烯,建议有一个重要的角色在维护持久的疼痛的反应。il - 1β在炎症反应的调节也很重要。此外,il - 1β增加了对内皮细胞粘附因子的表达,使轮回的白细胞和与痛觉过敏和发烧22]。在这项研究中,我们发现AA降低TNF -α和il - 1β水平在卡尔注射,治疗后血清1,5日和10毫克/公斤AA,显著(图6 (b)和6 (c))。

AA是最常见的一种三萜和有多种药理活性23]。尽管如此,信息几乎没有对底层AA的抗炎作用的分子机制。AA的抑制效应和asiaticoside LPS-induced促炎的分子,包括任何和前列腺素E2,发现比asiaticoside AA是一个更强有力的抑制剂。这些结果表明,AA的抗炎特性可能会抑制伊诺的结果,cox - 2,白细胞介素- 6 (il - 1β和肿瘤坏死因子-α表达的差别通过对这些核factor-kappa B通过压制我的激活κB激酶和增殖蛋白激酶(p38 ERK1/2,和物)磷酸化RAW264.7细胞(24]。

Carr-induced炎症反应与中性粒细胞浸润和neutrophils-derived自由基的生产以及其他neutrophils-derived介质的释放8]。一些研究表明,炎症效应引起的卡尔与自由基有关。时释放自由基,前列腺素,没有将管理与卡尔1 - 6 h。水肿的效果是在第三个小时提高到最大。MDA生产是由于自由基攻击质膜。因此,炎症效应将导致MDA的积累。谷胱甘肽是一种已知的精子的清道夫。谷胱甘肽含量的增加,有利于降低MDA的生产。内源性谷胱甘肽对Carr-induced局部炎症中起着重要的作用。在许多病理生理条件与炎症或氧化剂应激有关,这些ROS提出调解细胞损伤通过一系列独立的机制包括脂质过氧化反应的起始,各种抗氧化剂酶的失活,谷胱甘肽的耗竭。 Given the importance of the oxidative status in the formation of edema, the anti-inflammatory effect exhibited by the drug in this model might be related to its antioxidant properties [8]。在这项研究中,猫有显著增加,SOD、GPx活动与AA治疗(表1)。此外,有显著降低MDA水平AA治疗(图5)。我们假设抑制MDA生产可能是由于猫的增加,SOD、GPx活动。

在炎症过程中,大量的促炎介质,没有和铂族元素₂分别,是由诱导生成伊诺和cox - 2 (25]。进气阀打开,一般不出现在休眠细胞,但引起的各种刺激,其中包括细菌有限合伙人,TNF -α,il - 1β和干扰素-γ(26]。然而,cox - 2诱导的炎性刺激,包括有限合伙人和细胞因子在细胞在体外和发炎的网站体内。此外,cox - 2被认为是负责生产的同种型促炎前列腺素(后卫)各种炎症模型(27]。在这项研究中,有伊诺和cox - 2活动显著减少AA治疗(图7(一))。我们假设没有生产的抑制可能是由于减少伊诺和cox - 2的活动。炎症反应引起巨噬细胞和中性粒细胞分泌大量的介质(eicosinoids、氧化剂、细胞因子和裂解酶)负责启动、进展和持久性的急性或慢性炎症状态(28]。没有是最重要的在这些介质,在巨噬细胞cox - 2和进气阀打开,分别为(29日]。考克斯是参与花生四烯酸代谢酶促炎和影响生物反应组织修复和免疫反应等,所有这些都与炎症有关。COX-1和cox - 2病原反应酶的合成铂族元素₂。COX-1由表达和参与观察急性炎症反应而cox - 2表达在特定的细胞(即。、巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞)刺激后COX-2-dependent铂族元素₂是由炎症细胞和增加疾病(30.]。

NF -κB是一个主要的转录因子调节促炎酶和细胞因子的表达式,如进气阀打开,cox - 2, TNF -α(31日]。NF -κB亚基(p65和/或p50)通常隐藏在一个不活动的复杂的胞质结合抑制因子κB -α如果细胞。在刺激促炎的信号,包括有限合伙人,我κB -α磷酸化是我κB激酶(IKK)和灭活ubiquitin-mediated退化。结果免费NF -κB是易位到细胞核,作为转录因子。如图7(一),治疗与退化NF - AA块κB在Carr-induced爪子水肿。因此,这些结果表明,AA抑制伊诺和cox - 2的表达,并通过失活的NF -因此没有生产κB激活。

没有还负责血管舒张,血管通透性的增加和水肿形成的炎症(32]。没有和过氧化物()和产品的交互,也开始广泛的有毒的氧化反应引起组织损伤(33]。同样,中性粒细胞产生氧化剂和释放颗粒成分组成的裂解酶执行一个重要的角色在炎症损伤34]。在这项研究中,AA抑制在这些介质的释放是一个潜在的战略控制炎症和涉及的作用机制,如图9。

总之,这些结果表明,AA具有镇痛和抗炎作用。AA的抗炎机制可能与伊诺和相关的增加抗氧化酶的活动(猫、SOD、GPx)。AA可以用作药理代理人的预防或治疗疾病的自由基的形成是一个致病因素。

确认

作者要感谢国家科学委员会的财政支持(NSC 97 - 2313 - b - 039 - 001 - my3)和中国医科大学(CMU;cmu97 CMU95-PH-11 cmu96 - 113——232年,和CMU99-S-29)。作者要感谢博士杰弗里·康拉德对批判性阅读本文。c。赵和周宏儒。陈同样对本文亦有贡献。