文摘

化疗药物对癌症都是剧毒健康组织,因此替代医学途径被广泛研究。多数的最近的研究在替代医学建议Amoora rohituka拥有大量的抗癌和抗菌特性。在这工作,rohituka和chittagonga,分馏石油醚、二氯甲烷和乙醇,探索他们的抗癌潜力对两种乳腺癌(MCF-7和htb - 126)和三个胰腺癌(Panc-1, Mia-Paca2, Capan1)。人包皮成纤维细胞,Hs68,也包括在内。每个提取的细胞毒性进行了分析使用MTT测定和label-free光子晶体生物传感器测定。一系列浓度的提取进行六个细胞系。对于MCF-7癌细胞,chittagonga(Pet-Ether和CH₂Cl₂),rohituka(Pet-Ether)提取物诱导细胞毒性;的chittagonga(层)和rohituka(甲醇)提取不诱导细胞毒性。HTB126、Panc-1 Mia-Paca2, Capan-1癌细胞,只有chittagongaCH₂Cl₂提取显示明显的细胞毒性效应。提取没有细胞毒性正常成纤维细胞Hs68细胞,这可能是相关的特异性Amoora针对癌细胞中提取。基于这些结果,进一步检查潜在的抗癌特性Amoora物种和识别这些提取物的活性成分是十分必要的。

1。介绍

癌症是死亡的主要原因之一,在美国造成的无法控制的异常细胞的分裂。具体地说,乳腺癌是全球最常见的癌症之一,死亡率高,如果在后期诊断的。然而,如果在早期发现和适当的治疗,这些癌细胞可以完全删除(1,2]。胰腺癌死亡率高,常常不能被检测到在早期由于症状不出现,直到疾病拥有先进的显著(3,4]。典型的治疗方法包括针对肿瘤与电离辐射,手术切除肿瘤组织,和化疗。然而,这些目前的癌症治疗方法也引起严重的全身副作用。出于这个原因,最近的研究集中在寻找替代药物提取植物性来源。使用替代药物,特别是与传统癌症疗法一起使用时,可以减轻副作用(5),提高传统药物的吸收,,支持免疫系统对抗癌症。因为这些药物主要是天然植物提取物,其生物利用度不太可能引起严重的免疫反应。

几个种类的Amoora植物提取物在孟加拉国拥有许多地区大量的药用价值与炎症、癌症和肝脏疾病(6- - - - - -8]。最常见的一种,研究最多的Amoora物种,Amoora rohituka是一棵常青树,疯狂地生长在该地区,并在许多地区种植的孟加拉国(9]。这是传统上用作草药治疗癌症,肿瘤,肝、脾疾病。石油醚和甲醇提取的Amoora rohituka据报道,拥有好的泻药可以开发潜力和执行安全胃肠代理(10]。此外,Amoora rohituka提取物还具有抗菌活性(11(集成电路₅₀在360年~μg / mL)。植物三萜酸,amooranin,从树皮中提取的Amoora rohituka树木,据报道具有显著的抗癌潜力(7,12]。在早期的研究中,amooranin可以诱导细胞凋亡在乳腺癌细胞凋亡蛋白酶活动(13),是有效预防乳腺癌,结肠癌、宫颈癌、白血病细胞板(14]。除了抗癌活性,amooranin也是诱导多药耐药性的逆转人类白血病和结肠癌细胞行(15]。10的amooranin浓度μ米或更高版本已被证明导致细胞毒性反应。amooranin衍生品之一,amoorastatin,已经显示出显著的抑制活性对小鼠P388淋巴细胞白血病细胞系(16]。此外,色酮生物碱rohitukine主要化合物分离Amoora rohituka,表明抗癌作用非霍奇金淋巴瘤以及肾、前列腺癌、结肠癌、和胃癌症(17]。此外,rocaglamide衍生品的Amoora cucullata物种已报告对KB具有强力的抗肿瘤活性,公元前和NCI-H187癌症细胞系(18]。目前,对生物活性的Amoora chittagonga除了它存在于南东亚国家,如孟加拉国和泰国19,20.]。植物提取物的研究探索桃花心木家庭。的楝科,或者是桃花心木家庭,家庭是一种开花植物的树木和灌木(和一些草本植物)的顺序无患子目。

大多数报道的药用价值研究Amoora rohituka,但重要的是探索其他了物种的影响Amoora在各种癌症细胞系。在这个工作中,两个属的物种Amoora,rohituka和chittagonga,为他们的抗癌潜力进行了研究小组的五个人类癌症细胞系和一个人包皮成纤维细胞细胞系。这个小组由下列细胞系:MCF-7和htb - 126(乳腺癌),Panc-1, Mia-Paca2,和Capan1(胰腺癌)和Hs68(成纤维细胞)。

的Amoora chittagonga与pet-ether分馏(石油醚),CH₂Cl₂(二氯甲烷),层(乙醇)Amoora rohituka分馏pet-ether和甲醇(甲醇)。利用传统的MTT试验,5提取测试在每个细胞株在四个浓度从100年μ0.1 g / mLμg / mL和集成电路₅₀测定值。MTT测定的结果被证实使用label-free光子晶体生物传感器测定(PC)。电脑附件的细胞的生物传感器提供了一种图像传感器表面之前和之后的植物提取物的孵化,可以确定细胞毒性效应(11,21]。纳入这些生物传感器的底部96 - 384标准微型板块,使大规模筛选多个提取和癌细胞的同时行,并允许快速表征潜在的细胞毒性的化合物。

2。材料和方法

2.1。植物提取物

提取,Amoora chittagonga和Amoora rohituka,Chowdhury博士提供的来自孟加拉国的达卡大学。这两个Amoora rohituka和chittagonga树皮收集来自澳德,在吉大港,孟加拉国(澳德区22]。

植物被确定在孟加拉国家植物标本,在凭证标本已经沉积在加入数字dacb - 28927 (22]。脱水和干树皮粉(507.6 g)先后提取与光石油醚(40°-60°),二氯甲烷和甲醇在索氏仪器温度升高。所有三个提取新鲜过滤棉床。滤液蒸发减少压力在40°C使用Buchi旋转蒸发器橡皮糖集中的石油醚(6.6 g),二氯甲烷(4.3 g),和甲醇提取物(11.6 g)。

股票干提取的解决方案由溶解在乙醇浓度的25毫克/毫升或更高。他们直接在细胞培养基稀释浓度和测试在癌症细胞系的25日,50和100μ克/毫升。测试正常细胞系进行浓度的0.1,1,10,100μg / mL,为了测试没有在一个大范围的细胞毒性浓度。最终浓度的乙醇稀释不到1%。

2.2。细胞系

两个人类乳腺癌细胞系(MCF-7和HTB126),三个人类胰腺癌细胞(Panc-1、Mia-Paca2和Capan1),和一个人包皮成纤维细胞细胞系Hs68被用于这项研究。所有六个细胞系买来写明ATCC(罗克维尔市,医学博士,美国)。细胞培养和成长在37°C和5%的公司₂在无菌和10%胎牛血清的DMEM培养基(MCF-7, HTB126、Panc-1 Hs68),与10%胎牛血清和2.5%马血清DMEM (Mia-Paca2)和IMDM 20%胎牛血清(Capan1),添加谷氨酰胺和penicillin-streptomycin之后。细胞生长在标准组织培养瓶,并通过解决0.25% trypsin-EDTA到达80%的融合。

2.3。用MTT测定细胞毒性分析

细胞毒性的植物提取物细胞系决心使用MTT扩散分析工具从写明ATCC和西格玛奥德里奇。分析是基于转换的黄色四唑盐MTT紫色甲瓒晶体通过新陈代谢活跃的细胞。甲瓒的数量产生可行的细胞的数量成正比。细胞被播种在96 -平底组织培养板的密度大约1 - 1.2×10⁴细胞/好,允许附加24小时37°C。细胞与100年被孵化μ提取100 Lμg / mL为24小时。控制文化收到了100μL中等,没有细胞含有100和空白的井μL的媒介。药物暴露期后,细胞生长为额外的24小时extract-free新鲜培养基。10卷μL (MTT试剂被添加到每个好,板是孵化为4 h 37°C。然后用100一夜之间可溶性MTT晶体μL (MTT洗涤剂试剂。吸光度测量使用Biotek HT分光光度计在570海里。细胞毒性是表示为细胞生存的比例相对于未经处理的文化。所有MTT实验进行了一式三份,重复两次。

2.4。细胞毒性分析电脑分析

PC的传感器和仪器分析方法在[前面描述的23- - - - - -27]。生物传感器措施的改变反射光的波长或峰值波长值(采集)生化或手机绑定事件发生在表面上。沃本成像仪器(蒸发器生物系统,质量,美国)照明白光垂直入射的光子晶体,并采集每个像素成像的成像光谱仪(图的入口狭缝1)。

96 - PC生物传感器利用微型板块确认被细胞毒性的影响Amoora在乳腺癌细胞MCF-7提取出来的。最初的扫描与细胞培养媒体拍摄的背景图像。大约500 - 1000细胞被播种在生物传感器,和细胞附着和生长为24小时。第二次扫描于24小时后进行孵化。细胞培养与植物提取物在同一浓度的MTT测定另一个24小时后,最后一个扫描(图执行2)。最初的细胞计数孵化之前是作为参考;因此,可以确定增殖或细胞毒性效应。PC细胞试验之前已发表(11,21,28]。

2.5。统计分析

为了测试如果细胞毒性控制和植物提取物的区别是重要的,单向方差分析是用来比较不同治疗组其次是图基多重比较测试无论必要的。

3所示。结果

3.1。在体外用MTT测定反应

乳腺癌细胞的反应存在剂量依赖的相关性如图所示3。在治疗MCF-7癌细胞(图3(一个)),chittagonga物种是细胞毒性和显示集成电路₅₀值~ 42μg / mL, 48μg / mL Pet-Ether和CH₂Cl₂分别提取。在治疗的物种rohitukaPet-Ether提取显示一个集成电路₅₀~ 41μ克/毫升。然而,chittagonga层和rohituka甲醇提取物没有MCF-7癌细胞的细胞毒性。治疗HTB126癌细胞显示(图3 (b)只)chittagongaCH₂Cl₂提取细胞毒性,这里一个集成电路₅₀的价值~ 43μ观察g / mL。胰腺癌细胞的剂量反应曲线如图所示4。治疗Panc-1、Mia-Paca2 Capan-1癌细胞显示(图4 (a)4 (c)只)chittagongaCH₂Cl₂提取与集成电路显示明显的细胞毒性₅₀值~ 39μg / mL, 30岁μ克/毫升和65μ分别g / mL。正常成纤维细胞Hs68细胞没有表现出任何提取细胞毒性效应,表明潜在的特异性Amoora提取目标肿瘤细胞(图5)。

对于提取显示细胞毒性活动,控制和治疗组之间的差异是显著不同()。为提取不抑制细胞增殖,意味着相比没有显著差异控制(),因此统计确认这些Amoora提取并不是在任何上述细胞毒性剂量水平测试。

3.2。与电脑分析体外反应

试验采用光子晶体生物传感器系统,每个好扫描与药物治疗前后。因此,对于每个提取的分析,药物治疗后细胞计数与负控制的细胞计数(无药物暴露)。与使用MTT试验获得的结果一致,Pet-Ether和CH₂Cl₂分数的Amoora chittagonga和Pet-Ether分数Amoora rohituka显示集成电路₅₀值在40 ~μg / mL, 51μg / mL, 38μ分别为g / mL(图6)。其他两个提取物、chittagonga层与甲醇,并没有显示任何细胞毒性,而是显示癌细胞扩散到4倍,控制井(数据未显示)。

3.3。两种方法之间的相关性

光子晶体和MTT试验显示三个分数的相关性良好Amoora对MCF-7化合物是有效的。在图所示的相关情节7。细胞毒性的分数Amoora chittagongaPet-Ether, CH₂Cl₂,rohitukaPet-Ether MCF7细胞的相关系数是0.909,0.715,和0.922,分别。

4所示。讨论

从MTT和PC化验的结果Amoora提取诱发不同程度的细胞毒性在不同细胞系在同一类别。必须指出,对于每个物种,所有样品使用不同提取方法获得干和resuspended乙醇来消除不确定性可能带来不同的提取溶剂。这些股票的解决方案然后使用细胞培养基稀释剂量反应研究。乳腺癌细胞,提取的三个表现出高MCF-7细胞系细胞毒性效应,而只有一个提取是HTB126细胞的细胞毒性。我们假设MCF-7和HTB126之间的差异可能是由于他们的易感性Amoora植物提取物(29日,30.]。的chittagongaCH₂Cl₂提取高度两种乳腺癌细胞株的细胞毒性,还导致明显的所有三个胰腺癌细胞株的细胞毒性。所有其他的Amoora提取物诱导胰腺癌细胞最低级别的细胞毒性。

提取物对癌细胞的影响如表所示1。的Pet-etherAmoora chittagonga只有MCF-7(集成电路的影响₅₀~ 42μg / mL),有很少或没有影响其他癌症细胞系。的Amoora chittagongaCH₂Cl₂影响MCF-7 (~ 48μg / mL), HTB126 (~ 43μg / mL), Panc-1 (~ 39μMia-Paca2 (30 g / mL)μg / mL), Capan-1 (~ 65μg / mL)细胞系。虽然集成电路₅₀值在不同的有效提取Amoora chittagonga的细胞毒性,我们计算的意义MCF-7和显示两个分数没有明显的细胞毒性不同潜力()。乙酸乙酯(层)partitionateAmoora chittagonga并不影响任何癌症细胞系的增殖从MTT结果。乙酸乙酯的疗效partitionate明显不同于石油醚和CH₂Cl₂分数()。的rohituka反对MCF-7 Pet-Ether提取是有效的(符合前面的文献[31日]),但其他细胞系。两个独立的分数Amoora rohituka在它们的有效性显著不同(),其中石油醚提取物对癌细胞高细胞毒性和甲醇提取没有对细胞增殖的影响。从单一种类的不同结果Amoora植物表明,植物提取物的分区使用不同的溶剂可能有重大影响的生物活性产生的分数。只有chittagongaCH₂Cl₂在所有五个癌症细胞系诱导细胞毒性。我们假设的细胞毒性之间的区别rohituka和chittagonga可能是由于内amooranin提取的内容。大多数现有的研究涉及Amoora rohituka提取显示相当大的抗肿瘤效果,但似乎Amoora chittagonga也是一个有吸引力的提取,进一步深入探讨其抗癌特性。细胞毒性差异五个癌症细胞系和正常细胞系建议Amoora植物提取物可能影响特定癌症细胞系。

为了迅速检查一群癌症细胞系对植物提取物,图书馆有必要利用高通量筛选技术。提取的测试可以很容易地促进使用光子晶体传感器测定,感官附件可行的细胞,并产生一个信号,可以量化的细胞数量。如果细胞凋亡或坏死药物的浓度,他们失去依恋与传感器表面,这将导致弱或无信号点的附件。这种方法赋予的优势是巨大的化合物库可以同时测试,而不需要任何标记荧光标记物或其他比色测定。PC生物传感器测定用于验证的细胞毒性效应Amoora提取MTT试验确定。电脑分析的结果息息相关的MTT试验下进行类似的实验条件。此外,PC的生物传感器测定能够观察label-free图像的癌细胞的增殖和细胞毒性的Amoora植物提取物,而MTT试验只提供散装比色反应对于一个给定的。PC试验只进行MCF-7细胞系表现出植物提取物的能力检测细胞毒性效应与MTT试验相比。我们以前演示了使用电脑的方法准确的大规模筛选的植物提取物(图书馆28]。基于我们的研究结果,活性成分的研究Amoorachittagonga植物提取物负责癌症特异性细胞毒性效应是十分必要的。

5。结论

在这项工作中,我们进一步探索的治疗效果Amoora植物提取物对五个癌症细胞系。尽管许多研究都报道药用和治疗效果Amoora提取时,重要的是检查的影响报道Amoora物种对特定癌症细胞系,以确定初步人选替代癌症疗法。采用MTT测定,各种细胞毒性效应观察5的组合Amoora提取和五个癌症细胞系。有趣的是,当一个物种的样本Amoora植物提取使用不同的提取方法,我们发现这些原油提取显示不同程度的对癌细胞的细胞毒性。通过识别活动Amoora提取特定癌症细胞系,进一步的研究可以进行检查生化成分完全理解细胞毒性作用的机制。

利益冲突

b·t·坎宁安声明一个二元性的兴趣。本文中使用的光子晶体生物传感器是由一个公司,蒸发器生物系统,2000年6月,b·t·坎宁安共同创办。b·t·坎宁安目前蒸发器生物系统公司的首席技术官和自己的公司的股票。他的全职工作是伊利诺伊大学香槟分校的,他是一个副教授。

确认

这种材料是基于工作支持下由美国国家科学基金会资助。0427657。任何意见、发现和结论或建议用这种材料的作者(年代),不一定反映美国国家科学基金会的观点。作者要感谢大学的教授r . Chowdhury达卡,孟加拉国提供植物提取物。作者欣然承认蒸发器生物系统提供光子晶体生物传感器的微型板块。作者还扩展他们的感谢支持人员的微型和纳米技术实验室伊利诺伊大学香槟分校。