骨形态发生蛋白-7（BMP-7）在当归改善肾功能中的作用(当归)在1型糖尿病大鼠中

摘要

高血糖诱导的活性氧（ROS）生成被认为是导致糖尿病肾病（DN）的主要因素。当归(当归)与其他草药合用有肾保护作用。骨形态发生蛋白7 (BMP-7)对DN有保护作用。BMP-7在当归诱导的肾脏改善中的作用尚不清楚。本实验研究当归对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠和高糖暴露的大鼠系膜细胞(RMCs)肾功能、BMP-7表达和ROS水平的影响。治疗1周或4周后，当归可改善糖尿病大鼠肾功能，增加肾脏BMP-7表达。高糖处理可降低RMCs中BMP-7的表达，当归可逆转这一变化。此外，BMP-7 RNAi转染可使暴露于高糖环境的RMCs死亡，而scramble转染可使这些细胞存活。因此，我们使用常规rmc用RNAi敲除BMP-7，我们发现当归增加了这些rmc中BMP-7的表达。当归可以直接激活BMP-7的表达。DPPH、DHE染色和荧光素检测结果表明当归能抑制高糖诱导的RMCs ROS。 These results suggest that DangGui has an ability to improve renal functions in STZ-diabetic rats through increasing endogenous BMP-7 expression and decreasing oxidative stress in kidney. The present study suggest that DangGui could be applied to improve renal functions in diabetic disorders.

1.导言

许多糖尿病患者发展为肾病和/或终末期肾病（ESRD），近年来患病率逐渐增加[1.]高血糖被认为是诱发糖尿病肾病（DN）的主要因素。DN的临床策略包括血糖控制和血压调节[2.,3.]但治疗效果并不理想。

当归是陈皮的干燥根当归当归在中医中被广泛用于促进血液循环和补血，通常意味着增加血细胞数量并改善其功能。当归增加许多造血因子的分泌，如白细胞介素、EPO、TPO、GM-CSF、TNF-α和干扰素-γ来自细胞[4.,5.]当归可通过激活ERK1/2和P38 MAPK通路诱导小鼠骨髓单个核细胞增殖[6.]当归在肝星状细胞（HSC-T6）中也显示出抗增殖和促凋亡活性[7.].在中医方面，当归(当归)还有黄琦(黄芪)传统上，它们是一起使用的[8.]当归和黄芪的混合物被命名为当归补血汤（GQM），它可能通过降低血管紧张素II和TGF-β来减轻链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠DN的进展-β信使核糖核酸[9,10]在嘌呤霉素诱导的急性肾病动物模型中，GQM的抗纤维化作用与ACE抑制剂依那普利进行了比较。结果表明，GQM除了降低TGF的表达外，还能降低蛋白尿和BUN-β，III型和IV型胶原，层粘连蛋白和纤维连接蛋白[11]在本研究中，我们检测了当归是否具有肾脏保护作用。

骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)可减少肾小球和小管间质纤维化，预防糖尿病肾病的发病[12–16]．BMP-7改善糖尿病患者肾脏由高血糖诱导的氧化应激引起的肾损伤[13,14]我们还观察到，在1型糖尿病大鼠DN初期，控制高血糖可改善肾功能，逆转肾脏BMP-7的表达，但在DN晚期，这种情况不存在[12].高血糖引起肾细胞氧化应激，与DN的发生有关[17]内源性BMP-7可以通过抗氧化剂激活受体来保护肾脏免受高糖（HG）的损害[14]内源性BMP-7在DN保护中的作用似乎很重要。然而，BMP-7在当归改善肾脏功能中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨当归对STZ糖尿病大鼠肾功能和BMP-7表达的影响。我们还测定了当归对高血糖产生的活性氧（ROS）的影响．

2.方法

2.1.当归制剂

当归浓缩颗粒由98%的优质正宗中草药制成，由汉生制药有限公司（台湾屏东市）生产根据国际认证的良好生产规范指南。宏观和微观检查以及薄层色谱法和高效液相色谱法用于鉴定植物。参考样品存放在供应商的植物标本室。

2.2.糖尿病肾病的动物模型

六周龄雄性Wistar大鼠，180–200 体重g，取自成功大学医学院动物中心。STZ糖尿病大鼠通过静脉注射STZ（65 mg/kg）（美国密苏里州圣路易斯市Sigma-Aldrich公司）注入禁食大鼠体内，如前所述[18].如果动物的血糖浓度升高到350，则认为它们患有糖尿病 mg/dL。所有实验均在STZ-DN诱导后9周进行。STZ糖尿病大鼠被认为患有糖尿病肾病（DN）当他们的BUN和肌酐水平升高时。所有动物程序均按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南进行。STZ糖尿病大鼠用5 当归或1毫克/千克 雷米普利mg/kg，每日2次，连续1周或4周。STZ糖尿病大鼠分为4组()分别为：溶媒处理的正常大鼠；溶媒处理的STZ糖尿病大鼠；当归处理的STZ糖尿病大鼠；雷米普利处理的STZ糖尿病大鼠。

2.3. 血糖和肾功能测定

治疗前从大鼠股静脉采集血样，1 在最后一次治疗后h，评估血糖、尿素氮（BUN）和肌酐水平。在实验期间监测体重。在治疗结束时，处死动物，解剖肾脏，用盐水冲洗，称重分析，并在液氮中冷冻，然后储存在冰箱中−80℃用于进一步分析。12℃时对大鼠的血样进行离心 000 g代表3 我们用葡萄糖、尿素氮或肌酐试剂盒试剂（AppliedBio分析试剂盒；美国加利福尼亚州大力士）孵育样本。然后通过自动分析仪（美国印第安纳州埃尔克哈特市艾姆斯迈尔斯公司Quik实验室）对血糖、尿素氮和血清肌酐水平进行两次估计。

2.4.DPPH自由基清除试验

当归和抗坏血酸（维生素C）的抗氧化活性根据1,1-二苯基-2-吡啶酰肼（DPPH）（Sigma-Aldrich Inc.，St Louis，MO，USA）清除自由基的能力进行测定，并进行轻微修改。维生素C被用作参考化合物。维生素C的最高测试浓度被认为是100%的清除活性。将不同浓度的当归溶液置于比色皿中，1 23.7毫升 μ加入g/mL DPPH自由基甲醇溶液，然后培养30分钟 最小值：517处吸光度的降低 使用分光光度计测定nm。所有测定分三次进行。根据以下公式计算样品对DPPH自由基的抑制百分比： 哪里是对照品（无样品）的吸光度，以及样品的吸光度为T= 30 敏。

2.5. RMCs文化

该细胞系为大鼠系膜细胞(RMCs)，购自American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)。rmc在Dulbecco改良的Eagle’s培养基(DMEM;Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA)，含5 mmol/L葡萄糖，15%胎牛血清和抗生素，在37°C 95%的空气中，5% CO_2..我们加了25个 mmol/L葡萄糖（最终浓度30 mmol/L）转化为无血清DMEM，用于HG培养基。我们使用不含FBS和额外葡萄糖的DMEM作为对照培养基。在约60%的单层融合后，用对照培养基或不同处理的HG培养基取代培养基，然后培养24小时 h、 当归（200 μg/mL）和泰龙（10 mmol/L；4,5-二羟基-1,3-苯二磺酸；美国密苏里州圣路易斯市西格玛-奥尔德里奇公司）。

2.6.BMP-7转染的小干扰RNA

由Invitrogen公司(Carlsbad, CA, USA)合成大鼠BMP-7双链RNA寡核苷酸(Stealth RNAi TM)。根据制造商的协议，将RMCs与40 pmol/L bmp -7特异性小干扰RNA (siRNA)或Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)的scramble siRNA联合转染。BMP-7 Stealth RNAi (Bmp7-RSS340413)的序列为(sense strands, 5 ' -3 ') UGA UGUCAAAUACCAACCAGCCCU C和(反义strands, 5 ' -3 ') GAGGGCUGGUUGGUAUUUGACAUCA。在转染条件培养基中最大限度抑制靶基因培养12 h后，换用当归(200 mg/mL)常规培养基培养24 h，并进行分析。

2.7.细胞内活性氧检测

十 在12孔细胞培养板上接种1000个RMC 生长时，将RMC置于对照或HG培养基中，并用泰隆（10）处理 μ摩尔/升）或当归（200 μg） 进一步培养24小时，然后收获。用3.7%多聚甲醛固定RMC。细胞固定30分钟后，用PBS洗涤三次，5 μ添加mol/L二氢乙锭（DHE；Invitrogen）作为响应所述治疗产生的ROS的荧光指示剂。使用配备有奥林巴斯美国摄像头和MagnaFire 2.1软件的奥林巴斯IX70荧光显微镜收集图像。

2.8。超氧化物生成的测量

用荧光素法测定超氧化物的产生。在没有或存在上述各种处理的情况下，rmc在NG(对照)或HG培养基中培养24小时。离心收集胰蛋白酶解的RMCs，在含130 mmol、KCl (5 mmol)、MgCl的改良克雷布斯缓冲液中洗涤_2.(1 mmol），CaCl_2.(1.5 mmol），K_2.HPO_4.(1 mmol）和HEPES（20 mmol），pH 7.4。洗涤后，将RMCSs重新悬浮在Krebs缓冲液中，加入1 mg/mL BSA，并将细胞浓度调节至九百年 μL缓冲液。为了测量活性氧的产生，将细胞悬浮液转移到测量室中，并在化学发光分析仪（日本东北电子工业有限公司）中进行评估。通过注入100 μl-荧光素（最终浓度，更易/ L)。光子发射每10秒计数一次，持续10分钟。

2.9.肾脏和RMC的蛋白质印迹分析

通过westernblotting分析测定BMP-7在大鼠肾脏或RMCs中的表达。我们使用RIPA缓冲液提取总蛋白。对于western分析，蛋白质通过SDS-PAGE分离，转移并固定在硝化纤维素膜上。用含有0.1%吐温20（PBS-T）的磷酸盐缓冲盐水中的5%脱脂奶粉封闭膜，在室温下培养2小时。然后在PBS-T中洗涤膜，并与在PBS-T中稀释至适当浓度的初级抗体杂交16小时 HBMP-7的特异性抗体（美国加利福尼亚州圣克鲁斯市圣克鲁斯生物技术公司）（在1 : 200）及β-肌动蛋白（1稀释） : 使用ECL试剂盒（英国阿默森生物科学公司）进行二级抗体培养和抗原抗体复合物检测。使用激光密度计对获得的免疫印迹密度进行量化。

2.10.统计分析

结果以平均值±SE表示。采用方差分析和Newman-Keuls进行统计分析邮递临时的分析：如果P<0.05或P< 0.001.

3.结果

3.1.当归对STZ糖尿病大鼠肾功能的影响

Wistar大鼠注射STZ诱导1型糖尿病动物模型，9周后，STZ糖尿病大鼠的血糖、BUN、肌酐和肾重均显著高于正常大鼠(P<0.05）（图1.)我们治疗血管紧张素转换酶抑制剂雷米普利[19，以stz糖尿病大鼠为阳性对照。当归或雷米普利治疗7天后，stz糖尿病大鼠的血清BUN、肌酐水平和肾脏重量均得到有效逆转，但对葡萄糖的影响不明显(图)1（a）–1（d）).经4周载体治疗的STZ糖尿病大鼠的血清尿素氮和肌酐水平（图2（b）和2 (c))高于1周载体治疗的STZ糖尿病大鼠（图1（b）和1（c）).当归或雷米普利治疗四周可改善STZ糖尿病大鼠的肾功能并降低肾重量（图2（a）–2 (d)）.

3.2. 当归提取肾脏及RMCs中BMP-7的研究

使用western blot分析STZ糖尿病大鼠肾脏BMP-7表达的变化。STZ糖尿病大鼠肾脏BMP-7表达的降低与糖尿病诱导有关（与正常大鼠相比，9周STZ糖尿病大鼠减少35%，13周STZ糖尿病大鼠减少50%）（图3(一个)和3（b）)服用当归或雷米普利后，1周和4周治疗的STZ糖尿病大鼠肾脏BMP-7表达均增加（图3(一个)和3（b））.

然后，我们证实了当归对BMP-7表达的直接影响在体外．在前期实验中(数据未显示)，我们发现高糖培养24 h后，BMP-7在RMCs中的表达显著降低，而当归在12 h内不能提高BMP-7的表达。因此，我们研究当归对培养24小时后rmc中BMP-7表达的影响。BMP-7在高糖处理的RMCs中表达显著降低，当归处理24 h可逆转其表达(图)4.）.然后利用BMP-7小干扰RNA (small interference RNA of BMP-7, siBMP-7)和scramble RNAi鉴定BMP-7在当归这一作用中的作用。在正常培养基培养的RMCs中，转染siBMP-7后，BMP-7蛋白表达水平明显降低。但同样的siBMP-7转染导致高糖培养基培养的RMCs细胞死亡。因此，我们不得不放弃在高糖培养基中的研究。与scramble RNAi转染相比，转染12小时后，RMCs的BMP-7表达被抑制了75%以上(图)5.转染12小时后，我们将当归处理至这些RMC，并继续培养24小时 h、 结果表明，当归可增加经干扰RNAi转染的RMC中BMP-7的表达（图5.当归处理24小时后，siBMP-7转染降低的BMP-7蛋白可被逆转 h（图5.及第4巷)。

3.3.当归活性氧（ROS）降低

使用DPPH自由基清除试验评估当归的直接ROS清除作用。图6（a）结果表明，当归对自由基的清除作用与维生素C类似，具有浓度依赖性。

3.4.当归降低RMC中高糖诱导的ROS

在之前的研究中[14]，ROS在与HG培养基孵育的RMC中升高，这可通过rhBMP-7降低。通过DHE染色观察当归的抗氧化能力（图6（b）)并通过荧光素分析进行测量（图6（c）)我们观察到，当归以类似于替龙的方式显著抑制汞引起的RMC中ROS的增加。荧光素分析显示BMP-7可降低高糖诱导的RMC中的超氧物生成。

4.讨论

在本研究中，我们发现当归改善了STZ糖尿病大鼠的肾功能并增加了肾脏BMP-7的表达。当归可直接增加RMC中内源性BMP-7并减少汞诱导的ROS。我们使用STZ诱导1型糖尿病大鼠，如前所述[18]。糖尿病肾病的发展广泛表现为STZ诱导的糖尿病大鼠血浆肌酐和尿素氮水平升高。在我们的研究中，STZ诱导的糖尿病大鼠的肾功能表现出如前所述的糖尿病肾病的典型特征[20,21].继以前的报告之后[22]， 1周处理的stz诱导的糖尿病大鼠属于DN的初始阶段，4周处理的stz诱导的糖尿病大鼠定义为DN的建立期和/或晚期。当归治疗对两期DN均有改善。

BMP-7主要在成年哺乳动物肾脏中表达，以帮助维持肾脏结构和生理功能，而BMP-7在受损肾脏中表达降低[22]外源性BMP-7可改善糖尿病大鼠的肾功能和预防肾小球硬化[23,24]然而，BMP-7不能减轻蛋白超载诱导的肾间质纤维化[24]因此，肾脏中内源性BMP-7的储备对于预防损伤似乎至关重要。我们发现，1周或4周载体治疗的STZ糖尿病大鼠肾脏BMP-7表达均降低。治疗1周后，当归改善了1型糖尿病大鼠的肾功能，增加了BMP-7的表达。当归对治疗4周的糖尿病大鼠的这些作用比治疗1周的糖尿病大鼠更有效。为了了解糖尿病肾病大鼠肾脏中BMP-7的变化，我们采用培养的系膜细胞（RMC）模拟糖尿病肾病大鼠肾脏中BMP-7的表达体内变化。高血糖导致氧化应激，并导致转化生长因子水平升高-β(TGF -β)肾小球系膜细胞分泌的增加与糖尿病肾病（DN）的发生有关[16]．在体外研究表明，暴露于高糖浓度后，系膜细胞是自由基的主要来源[3.,25]因此，在高糖培养基中培养的大鼠系膜细胞可作为在体外本研究旨在探讨糖尿病肾病模型。在培养细胞中，24小时高糖暴露后RMC中内源性BMP-7降低。如前所述，当内源性BMP-7被siRNA减少时，RMC对汞生成的ROS失去抵抗力。然而，这种效应可以通过rhBMP-7治疗逆转[14]提示BMP-7具有抗氧化活性，如图所示4.然而，尽管在初步实验中，转染BMP-7 RNAi的RMCs在汞环境下仍然存活，但转染BMP-7 RNAi的RMCs在高糖培养基中均已过期。因此，BMP-7在汞环境下的RMCs生长中似乎是必不可少的。否则，我们敲除BMP-7 e在正常培养基中使用BMP-7 RNAi在RMC中成功表达（图5.).用scramble或BMP-7 RNAi转染12小时后，我们用含有当归的常规培养基替换转染条件培养基，继续培养24小时 H我们观察到当归增加了转染了scramble RNAi或siBMP-7的RMC中的BMP-7蛋白。当归在siBMP-7转染的RMC中增加BMP-7表达的可能原因之一可能与当归持续时间较长有关（24） h） 与siBMP-7相比（12 h） 。然而，可以考虑当归直接激活BMP-7表达。

此外，当归改善了STZ糖尿病大鼠的肾功能，并增加了BMP-7的表达，因为该剂量不能改变STZ糖尿病大鼠的血糖水平。有文献记载，葡萄糖刺激ROS的过度产生，导致DN[25]高糖诱导的ROS是STZ糖尿病大鼠和/或高糖暴露的RMC肾脏BMP-7表达降低的主要原因之一[25]据报道，当归是一种天然的自由基清除剂[26].目前尚无报道表明当归在糖尿病肾病中具有抗氧化应激作用。然而，一些研究表明当归通过清除自由基具有神经保护活性，例如当归的Z-藁本内酯对H_2.O_2.-通过增强抗氧化防御诱导PC12细胞和前脑I/R的细胞毒性[27,28]此外，阿魏酸松柏酯是当归精油中的主要抗氧化剂[29]阿魏酸能减轻自由基对神经元的损伤[30,31]．当归多糖对叔丁基过氧化氢诱导的巨噬细胞氧化损伤具有保护作用[32,33]这些报道表明当归可以保护组织免受氧化应激。我们发现当归对STZ糖尿病大鼠的作用似乎与ROS的减少有关。DPPH分析表明当归具有直接清除自由基的能力。DHE染色和荧光素分析也表明当归可以降低高浓度的氧化应激葡萄糖诱导ROS的方式与著名的ROS清除剂泰龙类似。综上所述，我们认为当归可以减少糖尿病大鼠肾脏或汞产生的系膜细胞中的ROS。如图所示7.我们总结了当归可以增加肾脏BMP-7，从而防止糖尿病疾病产生的氧化应激对肾脏的损害。

综上所述，当归可通过增加内源性BMP-7表达和直接降低ROS来预防肾功能损害。在中医药中长期使用当归具有安全性，可用于治疗糖尿病肾病。

致谢

我们感谢陈小姐的技术援助。本研究部分得到了中华民国国家科学委员会的资助（NSC-96-2320-B006-010，部分）。

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