KIOM-79，一种age - protein交联抑制剂，可预防Zucker糖尿病脂肪大鼠肾病进展

摘要

晚期糖基化终末产物(AGEs)与糖尿病并发症的发展有关，包括糖尿病肾病。以2型糖尿病动物模型Zucker糖尿病脂肪大鼠为实验对象，研究了从干葛根、生姜、甘草、大鼠中提取的80%乙醇提取物KIOM-79对肾脏疾病发展的影响。在体外采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测KIOM-79对AGEs交联的抑制作用。KIOM-79 (50 mg/kg/d)给予Zucker糖尿病脂肪大鼠13周。监测体、肾重量、血糖、糖化血红蛋白、尿白蛋白和肌酐排泄。肾脏组织病理学、胶原积累、纤维蛋白原和转化生长因子- 1 (TGF-β1)检测表达。KIOM-79可降低Zucker糖尿病脂肪大鼠的血糖、肾脏重量、组织学肾损伤和蛋白尿。KIOM-79可预防肾小球硬化、肾小管变性、胶原沉积和足细胞凋亡。在肾皮质，TGF-β1、KIOM-79处理后纤维连接蛋白mRNA和蛋白显著降低。KIOM-79减少AGEs的积累在活的有机体内、年龄蛋白交联和蛋白质氧化。KIOM-79可以通过减少肾小球中AGEs的沉积来预防2型糖尿病大鼠肾小球硬化的进展。

1.介绍

慢性高血糖是所有形式糖尿病的共同特征，它加速了还原糖和蛋白质自由活性氨基之间的美拉德反应中的非酶褐变。晚期糖基化/脂氧化终产物(AGEs/ALEs)的不可逆形成影响蛋白质和脂类，如血红蛋白、胶原蛋白和脂蛋白，并对肾脏、眼睛和血管造成损害[1，2］．糖尿病肾病是末期肾病的主要原因之一，其特征在于蛋白尿，肾小球细胞外基质（ECM）和肾小球粥样硬化的逐渐积累。据报道，氨基胍（Ag），吡啶胺，LR-90和ALT-711（AlerageBrium）等抑制剂或交联断路器如氨基胍（Ag），吡哆醇胺，LR-90和ALT-711（AlerageBrium）在实验动物中衰减肾脏内的糖尿病微血管疾病的各种功能和结构表现[3.- - - - - -5］．迄今为止，没有食物和药物管理局批准的年龄修改的特定指示，尽管这些合成和天然化合物在临床和临床前测试[2］．Zucker脂肪大鼠是一种被广泛研究的肥胖和胰岛素抵抗模型，表现出肾小球肥大、基底膜增厚和肾小球系膜基质弥漫性扩张，类似于一些在伴有蛋白尿的糖尿病肾病中看到的组织学改变[6，7］．

许多传统的药用草药已被广泛用于亚洲国家糖尿病和糖尿病并发症数百年，仍在目前使用[8，9］．在过去的5年里，我们实验室利用各种荧光和免疫学技术，从中药提取物或单个化合物中筛选出可能抑制或破坏AGEs的作用。KIOM-79由干葛根、生姜厚朴、甘草、大戟四种中药组成[10.］．前人研究表明，KIOM-79对AGEs的形成具有较强的抑制活性在体外比个体草药或AG。它还显示了非肥胖大鼠模型中糖尿病并发症的药理作用[11.，12.］．预防肾病的发生或延缓肾小球硬化的发展是开发肾脏疾病治疗药物的重要关键。本研究的目的是研究一种新的age蛋白交联抑制剂kiome -79对Zucker糖尿病脂肪大鼠糖尿病肾病进展的影响。通过肾脏功能和结构参数，包括TGF-， KIOM-79显示了保护作用β1、细胞外基质蛋白，如纤维连接蛋白、胶原蛋白。我们还发现KIOM-79在肾小球足细胞中有抗凋亡作用。

2.方法

2.1。材料

皮质的厚朴Rehd。会。，Radix of葛根Ohwi,基数乌拉尔甘草鱼和太子参大戟属pekinensis.鲁普雷希特是由植物学家J.H. Kim(韩国大田大学生命科学系)教授鉴定的。这些组成KIOM-79的草药如前所述制备[10.，11.］．KIOM-79的质量由HPLC控制[11.］．生化试剂来自Sigma (St. Louis, MO, USA)，抗体来自Cell Signaling或Santa Cruz，除非另有说明。所有其他化学物质都是分析级的。

2．2．年龄抑制/打破的体外试验

对于AGEs抑制试验，将AGE-BSA在有或没有KIOM-79或AG的96孔板中孵育[13.］．用兔抗bsa抗体、山葵过氧化物酶联山羊抗兔IgG抗体和H₂O₂含有ABTS显色原的底物。胶原- age - bsa交联的抑制表现为光密度(OD = 410 nm)的百分比下降。我们计算了IC₅₀浓度(μg/ml)对胶原- age - bsa交联有50%的抑制作用。对于断裂试验，将AGE-BSA在胶原涂层96孔板上预孵育24小时，胶原-AGE-BSA复合物在KIOM-79或ATL-711存在或不存在的情况下孵育[14.］．测量断裂水平，因为光密度的百分比减小（OD = 410nm）。ALT-711用作年龄交叉链路断路器的阳性控制。

2．3.动物与实验设计

雄性朱克脂(fa / faZF)和Zucker lean (fa / +或+/+，ZL)大鼠于6周龄从Charles River实验室(Wilmington, MA, USA)获得。实验动物分为4组:Zucker瘦大鼠(ZL，）;Zucker脂肪大鼠(ZF，）;Zucker脂肪大鼠给予AG (50 mg/kg体重，ZF + AG，）;KIOM-79 (50 mg/kg体重，ZF + KIOM-79，）．让大鼠自由获得水和食物13周，并以3周为间隔，测量它们24小时内的水和食物摄入量。所有涉及使用动物的动物护理实验协议均按照美国国立卫生研究院(NIH)指南进行，并得到本研究所动物护理委员会的批准。

2.4。代谢数据分析

当大鼠达到20周龄时，使用自动分析仪(Wako，日本)测量血糖、糖化血红蛋白(A1C)、血清肌酐、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和游离脂肪酸。禁食16小时后从尾静脉采集血样。将大鼠置于代谢笼中，收集24小时尿液，测定每日尿白蛋白排泄水平。

2．5．形态学研究

肾皮质用10%甲醛固定，石蜡包埋，4-μM厚切片。切片用周期性酸-希夫(PAS)试剂和苏木精作复染。使用NIH image J软件(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)对肾小球簇和系膜基质区域进行图像分析。对产生肾小球最大直径的横截面进行拍照并转换成数字图像。从每个大鼠肾脏中随机抽取40个肾小球。为测定肾脏中的胶原沉积，石蜡切片脱蜡，切片并用Masson三色染色。对AGEs免疫组织化学而言，脱脂切片经1% H水化处理₂O₂在甲醇。切片用抗ages抗体(1:100，转基因公司。(日本神户)在室温下用标准手动免疫过氧化物酶程序与链霉亲和素过氧化物酶(LSAB 2试剂盒，Dako, CA, USA)。TUNEL检测是根据制造商的说明书进行的(罗氏诊断，梅兰，法国)。采用synaptopodin(1,250)和Wilms肿瘤抗原-1 (wt - 1,1,250)免疫荧光染色的肾脏切片，采用Olympus BX51荧光显微镜(Olympus DP 70)观察。

2.6。RNA提取和RT-PCR

总RNA分离和RT-PCR如前所述[15.］．RT-PCR: 3μg RNA的RT-primix (Bioneer，韩国)。大鼠TGF-的上下游引物β1个mRNA分别为5 ' -CGA GGT GAC CTG GGC ACC ATC CAT GAC-3 '和5 ' -CTG CTC CAC CTT GGG CTT GCG ACC ACC -3 '，产生409 bp的产物。β-Actin作为内部控制，5 ' -CGT AAA GAC CTC TAT GCC AA-3 '和5 ' -AGC CAT GCC AAA TGT GTC AT-3 '，得到350-bp的产物。RT-PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳和DNA带强度分离，并用密度仪定量(las3000, Fuji photo, Tokyo, Japan)。

2.7。免疫印迹分析

Western blot采用前面描述的方法[15.］．肾皮质在含有250 mM蔗糖、1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)、0.1 mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和20 mM磷酸钾缓冲液的溶液中溶解，pH为7.6，均质器3000 rpm。等量的蛋白质(50μ将G / LANE）与所示抗体进行免疫印迹。使用的抗体是tgf-β1和纤维连接蛋白(1:1000,Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)。使用增强化学发光检测系统(iNtRON Biotechnology，韩国)检测结合的辣根过氧化物酶结合的二抗。利用图像分析仪(las3000, Fuji photo, Tokyo, Japan)分析硝基纤维素膜上捕获的信号，确定蛋白表达水平。

2.8。统计分析

数据表示为平均值±SD，并通过单向分析的差异（ANOVA）进行分析，然后是Tukey的多个比较测试或由未配对的学生t- 使用GraphPad.Prism 4.0软件（图垫，圣地亚哥，加州，美国）。具有价值的差异被认为具有统计学意义。

3.结果

３．１．KIOM-79体外抑制AGE-BSA及胶原交联作用

为了研究KIOM-79是否能抑制或破坏AGEs的交联，我们用KIOM-79在胶原涂层板上孵育或预孵育AGE-BSA。kiom - 79 ()对AGE-BSA与胶原结合的抑制活性明显强于AG ()，一种著名的糖基化抑制剂(图1(一)和1 (b)）．然而，KIOM-79并不影响AGEs在AGE-BSA和胶原结合上的断裂(图)1 (c)）．数字1 (d)显示ALT-711 ()，一个AGEs交联断路器。

3.2。体重、肾脏体重和血液代谢参数

20周龄时，ZF大鼠的体重较ZL大鼠增加，而与未接受AG或KIOM-79治疗的大鼠相比，体重没有变化。ZF组大鼠肾脏重量增加，KIOM-79组大鼠肾脏重量降低1）．ZF大鼠血糖、LDL、HDL、TG、总胆固醇和HbA1c水平显著升高(与对照组）。与未处理的ZF大鼠相比，用Ag或Kiom-79处理的ZF大鼠显示出血糖，LDL，TG和HBA1C的显着降低（图2(一个)和表格2）．然而，在治疗和未治疗的ZF大鼠之间，肝酶，如天门冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)水平没有差异。

通过检测KIOM-79的抗氧化活性和丙二醛(MDA)水平，测定其抗氧化作用。在ZF大鼠中，抗氧化水平显著降低()和MDA水平增加(图2 (b)和2 (c)）．KIOM-79治疗显着增加了降低的抗氧化酶活性并降低了升高的MDA水平。

３．３．形态与肾功能

肾小球系膜基质扩张被认为是糖尿病肾病的标志。数字3(一个)显示ZF大鼠系膜基质加速扩张(箭头)。通过计算机辅助图像分析确定平均肾小球体积。与ZL大鼠相比，ZF大鼠肾小球体积增加了32.7%以上。AG或KIOM-79治疗显著减少肾小球体积(图)3 (b)）．18周龄时，与年龄匹配的ZL大鼠相比，ZF大鼠表现出局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)、肾小管间质损伤、蛋白尿和肾脏重量增加[7］．与未处理的ZF大鼠相比，AG和KIOM-79治疗改善了肾小球硬化、蛋白尿和肌酐清除(图)3 (d)和3 (e)）．

3．4．胶原蛋白、纤维连接蛋白、TGF-的表达β1

探讨KIOM-79对细胞外基质蛋白和mRNA表达的影响，我们测量胶原蛋白，纤连蛋白和TGF-β肾组织1例，免疫分析和RT-PCR检测。糖尿病ZF大鼠肾小球和肾小管间质胶原蛋白表达增加(图)4(一)和4(b),）．在用Ag和Kiom-79处理的糖尿病ZF大鼠中比在糖尿病ZF大鼠中的糖尿病ZF大鼠中更加突出，胶原蛋白在糖尿病ZF大鼠（,图4(b))。特别地，在AG和KIOM-79治疗的糖尿病ZF大鼠中，细胞外基质分子，如ⅲ型胶原和纤连蛋白mRNA的表达显著降低(图)4（c）和4(f))。TGF -β1，这些细胞外基质基因的关键调控因子，已被认为与糖尿病肾病的发病机制有关[16.］．表达式的TGF -β用AG和KIOM-79处理的糖尿病ZF大鼠中减少1 mRNA和蛋白（图4(g)和4(h))。

3．5．定量的时代

免疫组化染色显示，与ZL组相比，ZF组大鼠肾小球和肾小管间质中AGEs含量明显增加。AG和KIOM-79均可减弱(图)5(一个)和5 (b)）．

3.6。KIOM-79对ZF大鼠肾足细胞凋亡的抑制作用

采用TUNEL法检测KIOM-79的抗凋亡作用。在ZF大鼠中，与ZL大鼠相比，13周龄时每节肾小球切片tunel阳性细胞显著增加(图)6（a）和6（b））．AG和KIOM-79治疗可有效降低糖尿病ZF大鼠的凋亡。通过计数细胞和测量两种足细胞标志物(如synaptopodin和WT-1)阳性标记的区域，测定每个肾小球切片的平均足细胞数量[17.，18.］．与年龄匹配的ZL大鼠相比，20周龄的ZF大鼠突触拓扑素(synaptopodin)和WT-1阳性细胞计数有下降趋势。AG和KIOM-79治疗明显增加了肾小球中的阳性细胞和区域(图)6（a），6（c）,6 (d)）．

4.讨论

KIOM-79是由干葛根、生姜厚朴、甘草、大戟四种中草药80%乙醇提取而成。这些中药在韩国和其他国家的传统医学中经常用于治疗糖尿病或糖尿病并发症[8，9］．我们之前的研究表明，KIOM-79具有抗糖尿病作用，如保护β细胞，降低非肥胖2型糖尿病大鼠血糖，抑制AGEs的形成在体外以及抗炎作用[10.，11.，19.］．本研究结果显示，age -胶原交联抑制剂kiome -79可降低2型糖尿病动物模型Zucker糖尿病脂肪大鼠糖尿病肾病的发生。基于免疫组化检测，目前的研究证实，KIOM-79可预防糖尿病肾脏中AGEs的积聚，降低高血糖、足细胞凋亡和肾皮质氧化。此外，kiom -79治疗的糖尿病大鼠在蛋白尿和肌酐清除等肾功能方面均有显著改善。我们已经证明，这些作用与Zucker糖尿病脂肪大鼠肾脏病理的几个关键方面的预防有关。

大量研究表明，高血糖通过增加蛋白质糖化和组织特别是肾脏中AGEs的逐渐形成，在糖尿病并发症的发病机制中发挥重要作用。由于ages -蛋白交联形成或断裂的抑制化合物的治疗潜力，人们对它们有相当大的兴趣[2，20.］．一些天然和合成化合物已经被提出和测试作为AGEs形成的抑制剂。AGEs抑制剂如AG、吡氧胺、ALT-946和LR-90已被报道在糖尿病肾病动物模型中可减弱系膜扩张和蛋白尿[4，20.- - - - - -26］．此外，黄酮类化合物，如oxerutin和disomin已经证明有能力减少AGEs在肾脏的积聚，并防止糖尿病肾病肾小球细胞凋亡[24.，27］．类黄酮诱导的糖基化减少与抗氧化成分的增加有关[24.］．

在这项研究中，KIOM-79，一种天然产物，在低8倍浓度下抑制了AGE-BSA和胶原交联(IC₅₀）比AG。然而，它对Age-BSA和胶原交联的破坏没有影响。与未处理的ZF大鼠相比，KIOM-79处理的ZF大鼠在血清中具有抗氧化活性和低血糖。ALT-711是一种时代的交叉链路断路器，通过减少全身年龄的池并促进年龄的尿精排泄，延迟了DB / DB小鼠中的已建立的糖尿病肾病。5］．kiom -79处理的ZF大鼠肾小球切片AGEs水平明显降低。KIOM-79可显著改善ZF大鼠肾重与体重之比。肾脏重量/体重在糖尿病肾病中表达为体重、肾小球肥大和蛋白尿的函数。KIOM-79对TGF-的表达有抑制作用β1、肾皮质纤维连接蛋白与足细胞凋亡的关系。我们之前发现，KIOM-79清除细胞内活性氧(ROS)，从而防止DNA损伤。此外，它通过清除自由基和激活抗氧化酶来抑制链脲佐菌素暴露于β细胞的凋亡[19.］．高糖诱导的ROS促进足细胞凋亡，AGEs通过激活FOXO4转录因子加速足细胞损伤[28］．抗氧化疗法可防止足细胞凋亡[2］．我们最近的研究表明，KIOM-79通过抑制醛糖还原酶和还原性谷胱甘肽(GSH)来防止木糖诱导的晶状体混浊[29］．此外，在2型糖尿病动物模型中，KIOM-79可预防白内障、视网膜神经元细胞凋亡和改善糖尿病视网膜病变的发展[30.］．

年龄抑制剂是设计用于捕获反应性羰基或二羰基中间体的亲核化合物，其在形成并具有有效的螯合活性，使得难以描述抗氧化作用[25］．KIOM-79的作用机制在活的有机体内目前尚不清楚。然而，KIOM-79是由天然产物组成的，已经被广泛用于糖尿病的治疗。基于我们的发现，KIOM-79抑制肾内AGEs交联和抗足细胞凋亡的作用可能改善糖尿病肾病，防止终末期肾衰竭的进展。此外，这些数据支持KIOM-79对抑制肾脏中AGEs积累的糖尿病并发症有效的前提。

综上所述，本研究表明，KIOM-79比之前使用的合成化合物(如AG)更能抑制age蛋白的交联，并调节2型糖尿病大鼠age蛋白的毒性作用。我们推测，KIOM-79通过直接或间接与AGEs蛋白交联作用抑制了AGEs在肾皮质的积累。KIOM-79可有效治疗糖尿病肾病及其他并发症。

资金

韩国韩医学研究所的补助金[L08010]。

承认

金英淑(Young Sook Kim，音)和金贞贤(Junghyun Kim，音)对该作品做出了同样的贡献。

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