生物功能型别藻蓝素的生物合成与固定化

抽象的

holo-allophycocyanin -α在n端结合了Strep-II-tag和His-tag进行生物合成大肠杆菌．由Strep II-tag产生的streptavidin结合能力通过Western blot得到证实。此外，His-tag的金属螯合能力不仅有利于其通过固定金属离子亲和层析纯化，而且有利于其在Zn (II)修饰的二氧化硅包覆磁性纳米颗粒上的固定。holo-allophycocyanin -α由此与链霉蛋白结合能力的亚基固定在磁性纳米粒子上。磁性纳米颗粒是有前途的用于靶向和定位在肿瘤上的药物递送载体。因此，基于基于遗传工程和纳米技术，我们提供了促进药理学蛋白的生物弥补和靶向递送的潜在策略。

1.介绍

联素胶质素（APC）是位于蓝绿藻和红藻中的植物霉菌核心中的Biliprotein [1- - - - - -4]．这种biliprotein由两个不同的亚基组成，α和β，每个亚单位有一个藻胆蛋白（PCB[5，6])作为一种生物活性蛋白，APC的药物特性已经得到证实[7]首先，生色团是一种有效的过氧自由基清除剂，被认为是其抗肿瘤活性的主要原因[8，9]然而，最近关于载脂蛋白精确活性的研究证实了其在APC生物活性中的重要作用[10，11].通过重组DNA技术的发展，全别藻蓝蛋白亚基已被工程化并大量生产[12，13]这些亚单位显示出比载脂蛋白和天然APC更强的自由基清除能力[13，提出了生物合成生产药用蛋白的可行性。

在遗传工程过程中，已经利用了许多抗体表位标签以赋予重组蛋白的目标鉴定能力。最近，STREP-II-TAG，提供具有链霉抗生物素蛋白结合能力的蛋白质的短肽序列，相对于它可能避免对生物活性蛋白的抗体的缀合的可能性，已经增加了越来越大的关注[14- - - - - -16]．此外，较短的His-tag是最常用的标签，可以很容易地与蛋白质融合而不损害其功能，并赋予其金属螯合能力[17]．因此，通过固定金属离子亲和层析(IMAC;［18- - - - - -20.])此外，有可能在金属阳离子修饰的固体表面上特异性地固定His标记的蛋白质[21- - - - - -23]因此，重组DNA技术使工程和生产具有生物亲和力和目标识别能力的药物蛋白质成为可能。

与此同时，纳米技术的现代发展已经产生了靶向药物输送的新型载体[24，25]，尤其是磁性纳米颗粒，可以简单地用外部磁场操纵[25]．在这些磁性药物传递平台中，二氧化硅涂层通常用于减少磁芯的随机波动和生物降解，部分原因是其耐热性和生物分子结合能力。此外，新材料的开发已经导致了由金属阳离子修饰的硅包覆磁性纳米颗粒的产生[26- - - - - -29]．因此，利用磁性纳米粒子固定化和递送his标记蛋白是可能的。

在这项工作中，基于基因工程和纳米技术，我们开发了一种促进生物修饰和靶向递送药理蛋白质的潜在策略。制备了Zn（II）修饰的二氧化硅包覆磁性纳米颗粒（ZnSiMNPs），并将其表征为蛋白质载体，而蓝藻别藻蓝蛋白（APC），一种具有多种药理用途的独特且廉价的色素蛋白，被选为模型蛋白。这种蛋白质是由His标签和Strep II标签在蛋白质的N末端生物合成的大肠杆菌最后，通过在ZnSiMNPs上的His标记将蛋白质固定化，并确认其与链霉亲和素的结合能力。

2.材料和方法

2.1.表达载体的构建

通常，标准程序用于DNA操纵。所有Holo-APC的生物合成基因α用PCR方法扩增了该亚基SyneChocystis.sp。PCC6803具有特定引物。用于放大的引物链球菌基因是5'AGGATCCGAGTAACTGNTCACACCCCACAATTCGAGAAAATGAGTATCGTCACGAA3'和5'GCGAGCTCCTAGCTCATTTTTCCGAT3'。其他引物与先前描述的那些相似[3.].如图中的方案所示1，S.trepII-apcA基因融合到his标签上，记为his-strepII-apcAapo-APC -α在n末端使用他的strep-II标签。这ho1和pcyA将多氯联苯生物合成基因连接到pCDFDeut-1载体（Novagen）中，并将CPC和cpcu.将PCB附着到载脂蛋白的基因连接到pRSFDeut-1载体（Novagen）中。对最终的质粒结构进行测序以检查其准确性。

２.２.重组蛋白的表达和纯化

pCDFDuet-his-strepII-apcA-ho1-pcyA和pRSFDeut-cpcs-cpcu.将表达载体共转化到大肠杆菌中大肠杆菌BL21。转化体选择50μG / ml北霉素和50个 μg/mL卡那霉素。转化基因的单个菌落大肠杆菌将Bl21在37℃下在5ml LB培养基中培养过夜。然后将细菌培养物转移到400ml LB中并在37℃下培养。当od.₆₀₀达到0.6~0.8时，用0.5诱导培养 mM异丙基β-D-硫代酰酰亚胺醇在28°C。在8小时诱导后收获细菌并在使用前储存在-20℃。

将超声处理过的细菌上清通过镍溶液获得重组蛋白^2＋-NTA亲和柱(GE Healthcare Bio-Sciences)。用50 mM磷酸钠和300 mM咪唑(pH 7.4)洗脱柱上残留蛋白。将混合洗脱液置于Sephadex G-25大小排斥柱上，以消除咪唑。对蛋白质组分进行收集、浓缩，并进行紫外-可见光谱和荧光光谱分析。

2.3. 蛋白质印迹分析

用链霉抗生物素蛋白衍生的辣根过氧化物酶进行西方杂交，以检测Holo-APC-的生物和α与标签。将分子量标记物、全细菌培养液和纯化的蛋白溶液并排置于凝胶上。在跑步后，凝胶被切成两半。一半用考马斯亮蓝染色，另一半按照试剂盒制造商的说明转移到硝基纤维素。然后在TBS (25 mM Tris-HCl, 138 mM NaCl, 2.68 mM KCl, pH 7.4) + 0.05%聚氧乙烯轨道月桂树酯(吐温20)和3% BSA中室温孵育1小时。用不含BSA的相同缓冲液短暂冲洗后，将印迹与链霉亲素衍生的辣根过氧化物酶结合物在TBS/0.05% Tween-20/3% BSA中室温孵育1小时。然后用TBS/0.05% Tween 20洗涤三次，用TBS洗涤一次。最后，加入HRP底物，印迹培养约3min。

2.4.ZnSiMnP的制备和表征

硅包覆磁性纳米粒子(SiMNPs)首先是用先前描述的油包水微乳液方法制备的[30，31]．然后,1.0 wt。% SiMNPs悬浮在5.0 mM的ZnSO中₄解决方案。超声均质10 min后，置25℃搅拌过夜。磁性纳米颗粒(ZnSiMNPs)被磁捕获并多次洗涤。使用前将ZnSiMNPs悬浮在水中。通过透射电镜(TEM)分析了纳米粒子的形貌。

2.5。Holo-APC的固定和成像α在磁性纳米颗粒

将ZnSiMNPs或SiMNPs添加到0.5 mL全息APC-α如上所述制备的溶液。在室温下轻轻搅拌混合物30分钟 用磁性支架将纳米颗粒从剩余溶液中分离出来。将纳米颗粒清洗并悬浮在50%的溶液中 mM磷酸钠，pH 7.4。为了测试负载在纳米颗粒上的蛋白质的生物亲和性，10 μ第1页，共1页 在悬浮液中加入mg/mL链霉亲和素FITC。培养30天后 分钟后，收集、洗涤并悬浮在50%溶液中的负载纳米颗粒 mM磷酸钠，pH 7.4，然后用荧光显微镜分析。

3.结果

3.1.重组蛋白的生物亲和性

经过8 h的诱导，发酵液中的细菌颜色变为青色。收集细胞并超声破坏，用镍纯化氰基上清液^2＋-nta亲和列。来自该塔的洗脱溶液显然是蓝色的。SDS-PAGE和蛋白质印迹分析的结果为整个细菌细胞提取物和纯化蛋白质2，显示在整个细菌提取物中有许多蛋白质条带。一个接近22 kDa的单蛋白带蛋白，对应于holo-APC-的计算分子量α用他的标签和strep-II标签，由Ni纯化的蛋白质样品产生^2＋-NTA亲和柱。Ni对该重组蛋白的选择性纯化^2＋-NTA亲和柱证实含有活性His标签。Western blot分析显示，整个细菌细胞提取物和纯化蛋白在SDS-PAGE结果相似的位置有一条带，表明存在链球菌II标签，并确认其生物亲和力。

3.2。重组蛋白的光谱

纯化蛋白溶液的最大吸附量为615 在643 nm处出现最大荧光发射 纳米（图3.).holo APC的吸收光谱和荧光光谱-α带有His标签和Strep II标签的重组蛋白与报道的天然蛋白一致[12]，表明PCB对甲状腺素上的正确附着。

3.3.ZnSiMnP的表征

SiMNPs和ZnSiMNPs的TEM图像如图所示4．这两种球形纳米颗粒大小相似，接近100纳米。SiMNPs表面光滑，而ZnSiMNPs表面有明显的3 ~ 5 nm纳米颗粒修饰，呈半壳状。这种半壳外观类似于纳米镍在二氧化硅微球上的装饰[27]因此，涂层很可能是由锌在二氧化硅上的沉积引起的。

3.4。在ZnSImnps上的蛋白质固定和生物亲和性

经His-Strep-II-holo-APC-孵育后α，纳米颗粒用磁铁分离。ZnSiMNPs颜色从棕色变为蓝色，而SiMNPs保持棕色。这一可见差异表明锌装饰在His Strep II holo APC表面固定化中起着关键作用-α在纳米颗粒上。为了进一步验证固定在ZnSiMNPs上的蛋白质的生物亲和性，使用了链霉亲和素FITC。如图所示5， ZnSiMNPs表现出荧光信号，代表holo-APC-α或FITC，分别在绿光或蓝光激发下，表明holo-APC-的表面固定α作为对照，SiMNPs在绿光或蓝光激发下均未显示荧光。

4.讨论

基于基因工程和纳米技术，本研究展示了一种促进生物修饰和药理学蛋白质靶向传递的潜在策略。该策略如图所示6蓝藻别藻蓝蛋白是一种独特且廉价的色素蛋白，具有多种药理作用，被选为模型蛋白。本研究首次报道了holo-APC的重组构建-α使用他的标签和strep-II标签。该重组蛋白质对天然Holo-APC具有相似的光谱性能α并且由于Strep-II标签的融合而显示出链霉抗生物素蛋白结合能力。此外，衍生自HIS-标签的金属螯合能力不仅促进其纯化，而且还促进了其对ZnSIMnPS的固定化。与电泳，蛋白质印迹和光谱分析的结果一起，我们得出结论：Holo-APC-α用His-tag和Strep-II-tag成功进行生物合成。该重组蛋白可以在ZnSiMNPs上固定，并用链霉亲和素修饰，无需化学处理。此外，利用磁性纳米粒子作为药物传递载体，将药物定向传递到肿瘤部位具有广阔的前景。

致谢

国家高技术研究发展计划项目(no . 2009AA10Z106);山东省优秀中青年科研人员科研推进基金项目(no . 2010BSB02009);国家重点基础研究发展计划项目(no . 2011CB200902);海洋公共科技研究基金项目(200905021-3)。

参考文献

1. R.MACCOLL，“蓝藻植物霉菌，”结构生物学杂志号，第124卷。2-3，页311-334,1998。查看在：出版商网站|谷歌学者
2. W.A.Samsonoff和R.MacColl，“极端生境中蓝藻和红藻的胆蛋白和藻胆体，”微生物学档案第176期6、页400-405,2001。查看在：出版商网站|谷歌学者
3. 刘丽娜，陈晓林，张永志，周伯春，“蓝藻和红藻藻胆体中连接体多肽的特性、结构和功能:综述，”生物化学与生物物理学，第1708卷，第2期2，页133-142,2005。查看在：出版商网站|谷歌学者
4. N.Tandeau de Marsac，“藻胆蛋白和藻胆体：早期观察，”光合作用研究，第76卷，第1-3号，第197-205页，2003年。查看在：谷歌学者
5. A. McGregor, M. Klartag, L. David，和N. Adir，“别藻蓝素三聚体的稳定性和功能主要是由于藻蓝素结合囊的极性增强的疏水性。”分子生物学杂志，卷。384，没有。2，pp。406-421,2008。查看在：出版商网站|谷歌学者
6. R.MacColl，“别藻蓝蛋白和能量转移，”生物化学与生物物理学，第1657卷，no. 12-3，页73 - 81,2004。查看在：出版商网站|谷歌学者
7. 施世荣、蔡国新、李玉生、觉中杰、陈怡聪，“蓝绿藻分离的别藻蓝蛋白对肠病毒71型诱导的细胞凋亡的抑制作用螺旋藻platensis.，“医学病毒学杂志，第70卷，第2期1，页119-125,2003。查看在：出版商网站|谷歌学者
8. E. A. Lissi, M. Pizarro, A. Aspee, C. Romay，“过氧自由基破坏藻青胆管素的动力学”，自由基生物学和药物，第28卷，第7期，第1051-10552000页。查看在：出版商网站|谷歌学者
9. Bhat和K. M. Madyastha，“用藻青素和藻青素清除过氧亚硝酸盐螺旋藻platensis.：防止DNA氧化损伤，“生物化学与生物物理研究通讯，第285卷，第2期，第262-266页，2001年。查看在：出版商网站|谷歌学者
10. B. GE，Z.唐，F. Zhao，Y.Ren，Y. Yang，以及S. Qin，“发酵和纯化的重组联合粘蛋白的发酵和纯化”大肠杆菌，“过程生化，第40卷，第10期，第3190-31952005页。查看在：出版商网站|谷歌学者
11. 张文杰，张晓伟等，“荧光重组蛋白的抗氧化性能研究α螺旋藻藻青蛋白”,应用微生物学杂志，第106卷，第4期，第1093-1100页，2009年。查看在：出版商网站|谷歌学者
12. I. C. Hu，T.R.Le，H.F.F.Lin，C.C.C.C.Chiueh和P.C.Lyu，“荧光联合粘蛋白的生物合成”α-亚基的自催化bilin连接，”生物化学，第45卷，第23期，第7092-7099页，2006年。查看在：出版商网站|谷歌学者
13. W. Zhang，X. Guan，Y. Yang等人，“荧光联合蛋白的生物合成α-亚单位的自催化作用大肠杆菌，“生物技术与应用生物化学号，第52卷。2, pp. 135-140, 2009。查看在：出版商网站|谷歌学者
14. T. G. M. Schmidt，J.Koepke，R. Frank和A.Skerra，“术术后肽与其同源目标，链霉抗生物素蛋白的分子相互作用”分子生物学杂志，第255卷，第5期，第753-766页，1996年。查看在：出版商网站|谷歌学者
15. A.D.Keefe、D.S.Wilson、B.Seelig和J.W.Szostak，“使用纳摩尔亲和链霉亲和素结合肽（SBP标签）一步纯化重组蛋白质，”蛋白质表达和纯化，第23卷，第3期，第440-4462001页。查看在：出版商网站|谷歌学者
16. Y.A.Cai，J.T.Murphy，G. J.Wedemayer和A. N.Gycobiliprotiens：重组植物植物：重组C-植物苷蛋白，配备亲和力标签，寡聚化和生物特异性识别域，“分析生物化学，卷。290，没有。2，pp。186-204,2001。查看在：出版商网站|谷歌学者
17. R.Janknecht、G.de Martynoff、J.Lou、R.A.Hipskind、A.Nordheim和H.G.Stunnenberg，“重组痘苗病毒表达的天然组氨酸标记蛋白的快速高效纯化，”美国国家科学院院刊第88期20，第8972-8976页，1991。查看在：谷歌学者
18. K. L. M. C. Franken, H. S. Hiemstra, K. E. van Meijgaarden等，“通过固定螯合亲和层析纯化his标记蛋白:使用有机溶剂的好处，”蛋白质表达和纯化，卷。18，不。1，pp。95-99,2000。查看在：出版商网站|谷歌学者
19. K. Ye, S. Jin, M. M. Ataai, J. S. Schultz, J. Ibeh，“用金属结合肽标记逆转录病毒载体和通过固定金属亲和层析一步纯化”，病毒学杂志第78期18, pp. 9820-9827, 2004。查看在：出版商网站|谷歌学者
20. E.K.M.Ueda、P.W.Gout和L.Morganti，“金属离子-蛋白质结合的当前和未来应用，”色谱学报A，卷。988，没有。1，pp。1-23,2003。查看在：出版商网站|谷歌学者
21. D. Kröger, M. Liley, W. Schiweck, A. Skerra，和H. Vogel，“用螯合物硫代烷烃将组氨酸标记的蛋白质固定在金表面”，生物传感器和生物电子学第14卷第2期2，pp。155-161,999。查看在：出版商网站|谷歌学者
22. C.H.Ho、L.Limberis、K.D.Caldwell和R.J.Stewart，“用于在界面固定组氨酸标记蛋白质的金属螯合pluronic：将萤火虫荧光素酶固定在聚苯乙烯珠上，”朗缪尔第14卷第2期14、1998年。查看在：谷歌学者
23. C.Mateo、G.Fernández Lorente、E.Cortés、J.L.Garcia、R.Fernández Lafuente和J.M.Guisan，“一步纯化、共价固定和使用新型杂功能螯合环氧树脂载体额外稳定多聚his标记蛋白质，”生物技术与生物工程，第76卷，第76期3，页269-276,2001。查看在：出版商网站|谷歌学者
24. S.Paul、S.S.Bhattacharyya、N.Boujedaini和A.R.Khuda Bukhsh，“远志根提取物及其PLGA纳米粒胶囊形式的抗癌潜力，”循证补充和替代医学，第2011卷，文章编号517204，13页，2011年。查看在：出版商网站|谷歌学者
25. M.Arruebo、R.Fernández Pacheco、M.R.Ibarra和J.Santamaría，“用于药物输送的磁性纳米颗粒，”今天的纳米，第2卷，第3期，第22-32页，2007年。查看在：出版商网站|谷歌学者
26. 廖耀尧、郑耀尧和李清清，“氮基三乙酸/Co的制备^2＋用于纯化6 ×组氨酸标记蛋白的二氧化硅/硼包覆磁性纳米颗粒，”色谱学报A，第1143卷，第1期。1-2，页65-71,2007。查看在：出版商网站|谷歌学者
27. S.Ramesh，Y.Koltypin，R.Prozorov和A.Gedanken，“二氧化硅微球上纳米非晶镍的声化学沉积和表征，”材料化学，第9卷，第2期，第546-551页，1997年。查看在：谷歌学者
28. M.Bele，G.Hribar，S.Čampelj等人，“用于蛋白质结合和控制释放的锌修饰二氧化硅包覆磁性纳米颗粒，”色谱学报B第867卷，第867号1，页160-164,2008。查看在：出版商网站|谷歌学者
29. Ma Z.， Guan Y.， Liu H.，“固定化金属亲和配体对蛋白质吸附的超顺磁性纳米二氧化硅颗粒”，磁性和磁性材料杂志CHINESE第301卷第1期2，第469-477页，2006。查看在：出版商网站|谷歌学者
30. 何X，霍H，王K，谭W，龚P，和葛J，“使用氨基二氧化硅包裹的磁性纳米颗粒（ASMNPs）分离质粒DNA，”塔兰塔，卷。73，没有。4，pp。764-769,2007。查看在：出版商网站|谷歌学者
31. 何X，陈Y，王K，吴P，龚P和霍H，“用pH依赖性磁性纳米吸附剂选择性分离蛋白质，”纳米技术，第18卷，第36号，第365604条，2007年。查看在：出版商网站|谷歌学者

版权

版权所有©2011陈英杰等人。这是根据知识共享署名许可协议如果正确引用了原始工作，则允许在任何媒体中的不受限制使用，分发和再现。