抗氧化和抗癌潜力感冒emodi根茎提取物

文摘

本研究的目的是确定methanolic和水提取物的抗氧化和细胞毒性功效感冒emodi墙。Meissn交货。粉末。2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)和氢氧自由基清除活性,抑制脂质过氧化作用的影响和铁^{3 +}减少抗氧化剂属性被用来研究提取物的抗氧化性能。提取的细胞毒性测试mda - mb - 435 s和Hep3B细胞株。两种提取物显示广泛的细胞株的细胞毒性测试。研究了提取DNA的能力保护pBR322紫外线诱导的影响光解的H₂O₂。水提物,虽然不如methanolic提取物的抗氧化潜力表现出保护DNA的效率,而methanolic未能保护DNA提取。总多酚提取的数量被分光光度法测量。methanolic提取物中含有的多酚含量高于水提物。观察到显著的正相关性(P< . 05)酚醛含量估算的结果与抗氧化剂的化验。因此,高效液相色谱法分析来确定一些主要的酚类化合物,可能负责这些治疗属性。这些结果表明,粉末r . emodi具有抗氧化和细胞毒性的活动,因此有治疗潜力。

1。介绍

癌症化学预防被定义为使用自然、合成或生物化学药剂逆转,抑制或阻止致癌进展(1]。已经有越来越多的安全担忧合成chemopreventive疗法。常用的合成抗氧化剂叔丁基羟基茴香醚(BHA)和叔丁基羟基hydroxyltoluene(二叔丁基对甲酚)限制因其毒性和DNA损伤诱导潜在(2,3]。相反,花卉资源得到了相当大的关注,包括抗氧化剂来源的生物活性物质,开发anti-mutagens和抗癌药物(4]。

感冒emodi墙。Meissn交货。(蓼科)是一种多叶的多年生草本植物分布在海拔从2800年到3800年的温带和亚热带地区喜马拉雅山脉从克什米尔在印度锡金5]。的根r . emodi据报道,抗菌和抗真菌的活动6- - - - - -10]。除了其他泻药等生物活性,利尿在活的有机体内抑制作用对P388白血病小鼠也报道(11- - - - - -13]。

本研究的目的是确定methanolic和水提取物的抗氧化和抗癌潜力r . emodi粉末通过各种方法包括2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)和^•哦,自由基清除,铁^{3 +}减少和抑制脂质过氧化能力在体外很少报道。细胞毒性的提取测定mda - mb - 435 s(人类乳房癌)和Hep3B(肝癌)细胞系。的保护活动的提取物是由紫外线诱导光解评估H₂O₂导致pBR322 DNA损伤。总酚含量估计执行,和一些酚类化合物可能负责提取物的抗氧化性质被确定高效液相色谱法(HPLC)。

2。方法

2.1。化学品和其他试剂

DPPH,硫代巴比土酸(稍后通知),乙二胺四乙酸(EDTA)、抗坏血酸、三氯乙酸(TCA),吩嗪methosulfate (PMS)(也称为N-methylphenazonium methosulfate)、二甲亚砜(DMSO), l - 15(单曲)细胞培养基l谷氨酰胺),MEM(最小基本培养基)细胞培养基(与厄尔的盐、NEAA和l谷氨酰胺)和2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ)从Himedia购买实验室pvt Ltd .(印度)。XTT2,3 -国际清算银行(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) 5 - [(phenylamino)羰基]2 h-tetrazolium氢氧根得到从西格玛化工有限公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。Folin-Ciocalteau试剂采购从Sisco研究实验室(印度)。剩下的化学品和溶剂使用的标准分析品位和高效液相色谱级,分别。从Medox pBR322购买生物技术印度经纪有限公司(印度)。mda - mb - 435 s(人类乳房癌)和Hep3B(人类肝脏癌)细胞系来自国立细胞科学中心(浦那(印度)。

2.2。植物材料

感冒emodi根状茎收集从他们的天然栖息地在喜马拉雅山脉Garhwal Chamoli (30°24′N, 79°21′E), Uttaranchal, 2007年6月,印度。收集标本shade-dried,粉和用于溶剂萃取。凭证标本保存备查(加入没有在我们的实验室。:维特/ CCL SBCBE / / 07/6/04;日期:6月11日,2007)。

2.3。提取

粉末粉是连续用甲醇和水使用索氏提取器的比例1:6(粉(克):溶剂(毫升)]。提取得到蒸发干燥在40°C下减压(甲醇:337 mbar,水:72 mbar旋转蒸发器(BUchi、瑞士)。50克的粉末粉产生24.81克(干重的百分比提取收益率:49.62%)的原油methanolic提取和3.86克(干重的百分比提取收益率:7.72%)的原油水提物。样本存储在室温下真空干燥器,直到进一步使用。

2.3.1。DPPH自由基清除活性

提取物的自由基清除能力通过DPPH自由基清除实验来测试(DRSA)所描述的布洛瓦(14]。一笔20、40、60、80和100年μg的提取物在试管和0.5毫升与相应的溶剂。一个数量的3毫升0.1毫米DPPH^•在乙醇添加到每个管和孵化在黑暗在室温下30分钟。吸光度是读50 517海里使用卡里紫外可见分光光度计(瓦里安公司,澳大利亚)。DPPH自由基清除活性百分比(% DRSA)是使用公式来计算的, 在哪里控制和吸光度的吗一个提取液的吸光度。

2.3.2。氢氧自由基清除活性

^•哦自由基清除活性(HRSA)的提取方法估计的克莱因et al。15]。一个50,100年、150年和200年μg提取的试管。数量1毫升iron-EDTA溶液(0.13%硫酸亚铁铵和0.26% EDTA), 0.5毫升的0.018% EDTA和1毫升的0.85% (v / v) DMSO(在0.1 M磷酸盐缓冲剂,pH值7.4)被添加之后,0.5毫升的0.22% (w / v)抗坏血酸。管受限紧密和孵化在85°C水浴,持续15分钟。Post-incubation,试管被无上限,冰冷的三氯乙酸17.5% (w / v)在每个立即添加。一个数量的3毫升纳什试剂(7.5 g的醋酸铵,300μl冰醋酸和200年l乙酰丙酮混合,由100毫升蒸馏水)被添加到所有的管子和孵化在室温下15分钟。吸光度测量在412海里。

氢氧自由基清除活性百分比(% HRSA)是由以下公式计算: 在哪里控制和吸光度的吗一个提取液的吸光度。

2.3.3。铁减少的抗氧化特性

铁减少抗氧化剂财产(收紧)试验是根据协议Benzie和应变的16)做了一些调整。股票的解决方案是300毫米醋酸缓冲(16毫升C₂H₄O₂;pH值3.6),TPTZ解决方案(10毫米TPTZ盐酸40毫米)和20毫米FeCl₃h·6₂O的解决方案。收紧的解决方案准备工作刚通过混合乙酸25毫升的缓冲区,2.5和2.5毫升FeCl毫升TPTZ解决方案₃h·6₂O的解决方案,然后加热到37°C之前使用。数量150μl个人提取解决方案(包含25、50、100和200μ克提取物、职责)被允许与2.85毫升的收紧反应30分钟在黑暗的解决方案。吸光度是阅读在593海里。铁比例^{3 +}减少(铁^{2 +}FeSO)计算₄标准的校准曲线。扫气比例也评估抗坏血酸等价(AAE)(微克)。

2.3.4。硫代巴比土酸测定

描述的试验进行了哈利维尔和Gutteridge [17),脂质过氧化的程度估计的丙二醛(MDA)浓度、硫代巴比土酸活性物质(TBARS),这是由于脂质过氧化作用。6周大女纯种白鼠称重~150克是牺牲在飘渺的麻醉,肝切除。10% (w / v)肝匀浆制备杜尔贝科的磷酸缓冲盐(PBS) (Ca^{2 +}/毫克^{2 +}无)(pH值7.4)和离心机在503克15分钟获得一个清晰的浮层。50、100、150、200和250μg的提取是在试管中,蒸发干燥在80°C。数量1毫升0.15米氯化钾是添加到管其次是0.5毫升的大鼠肝匀浆在PBS 10% (w / v)。过氧化反应是由新增的100年μl 2毫米氯化铁。孵化后30分钟的管37°C,过氧化反应停止通过添加2毫升的冰冷的盐酸(0.25 N)包含15%柠檬酸和0.38%稍后通知。管是保持在80°C 1 h,冷却和离心机3144 g。上层清液的吸光度,包含TBA-MDA复杂的阅读在532海里。脂质过氧化的抑制百分比(% LPI)是使用公式来计算的, 在哪里控制和吸光度的吗一个提取液的吸光度。

这个实验是根据指导方针的执行“欧洲公约保护脊椎动物用于实验和其他科学”(及其附录)机构动物伦理委员会的批准(PSGIMSR / 27.02.2008)。

2.3.5。XTT化验

XTT试验进行mda - mb - 435 (l - 15中生长)和Hep3B(生长在MEM培养基)细胞系被Weislow et al。18]。总共6×10³细胞被播种在96孔板和补充了200人μl各自文化的媒体一段24 h。媒体在200年被取代μl新鲜的媒体含有不同浓度的提取(15.625,31.25,62.5,125μg / ml)。板块在37°C孵化24 h后,媒体被和新鲜的媒体报道。一个数量的50μl XTT试剂准备各自的媒体包含25(0.6毫克/毫升)μM PMS被添加到所有的井,在黑暗潮湿的环境和盘子被孵化37°C 4 h。孵化后,橙色颜色复杂的形成是在450 nm使用丹尼克斯先生Opsys标仪(美国弗吉尼亚州丹尼克斯技术)与630 nm引用过滤器。井包含细胞没有提取治疗作为对照组。井只包含培养基,XTT试剂为空白。比例提取的细胞毒性是通过使用公式计算: 在哪里控制和吸光度的吗一个样品的吸光度。

2.4。DNA损伤抑制效率

潜在的DNA损伤抑制的r . emodi提取测试由photolysing H₂O₂紫外线辐射的存在pBR322质粒DNA和执行与辐照DNA琼脂糖凝胶电泳(19]。共有1μl整除pBR322 (200μg / ml)在紫外线抗药聚乙烯微型离心机管。一个量50μg的每个提取物分别添加到两个管子。剩下的管不及时治疗是辐照控制()。一个数量的4μl 3%的H₂O₂被添加到所有管然后直接放置于表面的紫外线透照器(300海里)。样品在室温下辐照了10分钟。辐照后,4μl跟踪染料(0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯苯胺FF和30%甘油)是补充道。所有管子的样品被分析了凝胶电泳在此种1%琼脂糖凝胶缓冲区(pH值8)。治疗non-irradiated pBR322质粒(C)是随着extract-treated紫外线照射过的样品(methanolic提取物治疗=和水提物治疗=)和未经处理的紫外线照射过的()质粒DNA。这种凝胶在溴化乙锭染色(1μg / ml;30分钟)和拍到Lourmat凝胶成像系统(Vilbar、法国)。

2.4.1。估计的总酚含量

总酚含量测定的方法描述了李斯特和威尔逊[20.]。50、100、150、200和250年的提取是0.5毫升蒸馏水。量2.5毫升Folin-Ciocalteau试剂(1:10稀释)和2毫升的碳酸钠添加了7.5% (w / v)和管孵化45°C,持续15分钟。吸光度是读50 765海里使用卡里紫外可见分光光度计(美国瓦里安,Inc . CA)。结果表达的没食子酸等价(GAE)在微克。

2.4.2。高效液相色谱法分析酚类化合物

高效液相色谱法分析使用水域2487高效液相色谱系统组成的双λ探测器和水域1525二元泵,配备了水域对称C18柱(5米,4.6×150毫米)水域哨兵普遍保护(5列μ米,4.6×20毫米)(水公司,米尔福德,妈,美国)。酚类化合物在水溶液和methanolic提取的r . emodi分析了使用图书馆对酚类化合物标准(21作为一个参考。梯度洗脱了35°C与解决方案(50毫米磷酸钠10%甲醇;pH值3.3)和解决方案B(70%甲醇)在接下来的梯度洗脱程序:0-15 min - 100%的解决方案;15-45 min - 70%的解决方案;45 - 65分钟——65%的解决方案;65 - 70 min - 60%的解决方案;70 - 95 min - 50%的解决方案;95 - 100 min - a .流量0%的解决方案是1毫升/分钟和注入量是20μl。检测监控在不同波长(约为各种酚类化合物),对安息香酸250海里,异黄酮和最蒽醌类;280海里对一些黄酮、黄烷酮类儿茶素、茶黄素和一些蒽醌类;320纳米的肉桂酸,大多数黄酮类化合物;黄酮醇370海里;花青素的510海里。

2.5。统计分析

所有分析都在一式三份。数据被当作平均数±标准差。统计分析是由单向方差分析。组确定之间的显著差异P< . 05。评估实验参数之间的关系,结果相关性和回归分析,检测学生的意义t以及(P< . 05)。MATLAB版本。7.0(美国纳蒂克,MA), GraphPad Prism 5.0(美国圣地亚哥,CA)和Microsoft Excel 2007(美国IL洛神葵)被用于统计和图形评估。

3所示。结果

3.1。DRSA

两种提取物显示浓度依赖DPPH的清除^•激进分子。Methanolic提取被发现比水提物活性游离基清除剂。结果绘制% DRSA和也表示为AAE在微克(图1)。

3.2。HRSA

淬火的提取的能力^•哦,自由基可以防止脂质过氧化作用有关,它似乎是一个不错的清道夫的活性氧物种,从而减少连锁反应的速率。图2显示% HRSA提取。氢氧自由基自由基病理学牵扯极具破坏力,能够破坏几乎每个分子中发现活细胞(22]。提取物的抑制是剂量依赖性增加^•哦,激进分子。

3.3。收紧

菲^{3 +}减少活动的两个提取物被收紧试验确定。methanolic提取显示较高的还原能力相比,水提物对所有测试剂量。图3显示%菲^{3 +}减少由提取连同AAE微克。

3.4。稍后通知试验

两种提取物能够防止MDA是剂量依赖性的方式的形成。methanolic提取被观察到一个明显更好的脂质过氧化(抑制剂P< . 05)与水提物对所有测试剂量。图4显示% LPI等值问题与相应的二叔丁基对甲酚(微克)。

显著的相关性(P< . 05)之间的观察:% LPI和% DRSA(我),(2)% LPI和% HRSA和% LPI和%铁(iii)^{3 +}减少(图5)methanolic和水提取物剂量。这个推断,提取不同抑制脂质过氧化反应由于其不同程度的自由基淬的潜力。

3.5。XTT化验

同时提取了相当大的细胞株的细胞毒性,从而表明抗癌代谢物的存在。表1介绍了集成电路₅₀值的水和methanolic提取物r . emodi在mda - mb - 435年代和Hep3B细胞系。

3.6。DNA损伤抑制效率

图6显示pBR322 DNA UV-photolysis后的电泳模式H₂O₂缺席(C和控件(样品)和存在和)的提取物。控制pBR322 (C)显示两个乐队在琼脂糖凝胶电泳。移动越快乐队代表了原生形式的超螺旋环状DNA DNA (SC)和移动较慢,微弱的乐队与开放的循环形式(OC DNA) [19]。显示的水提物大大保护活动相比methanolic提取并没有表现出任何保护活动。UV-photolysis H₂O₂在整个DNA损坏(没有乐队可见)。没有显示SC DNA带;相反,它开发了一种新的模糊的中间带线性DNA DNA(林)由于自由基损害SC DNA。另一方面,methanolic提取没有任何保护的活动。结果推断UV-photolysed H₂O₂(3%)治疗整个DNA (pBR322消失),而50μ克水提物对部分保护DNA损伤。

然而,这是一个有趣的观察,尽管是相同的^•哦,彻底清除潜在的提取物,methanolic提取失败的全面遇到UV-photolysed H的影响₂O₂派生的^•哦,自由基,导致DNA氧化损伤。这种失望可能是由于可能能损伤dna methanolic提取本身的属性。methanolic提取的细胞毒性,已经观察到在这项研究中,大约是三到四倍的水提物(表1)。如此广泛的细胞毒性methanolic提取可能的假设是一个可能的函数能损伤dna的能力。

3.6.1。估计的总酚含量

表2显示了methanolic总酚含量和水提取物表示为GAE(微克)。获得的结果在所有抗氧化剂化验显示显著统计学差异methanolic和水提取物P< . 05。相关和回归分析检查中的多酚提取物是否对这些活动负责。总酚含量的提取显示重要的和有很强的正相关关系(P与自由基(DPPH < . 05)^•和^•哦)扫气效率,% LPI和%铁^{3 +}减少(图7)。这些结果表明可能派拉蒙,提取的多酚成分可能发挥作用在中和自由基和抑制脂质过氧化作用。

操作。高效液相色谱分析

由于天然酚类化合物的多样性和复杂性,很难描述每个化合物粗提物中阐明其结构(23]。酚类化合物的主要类型是两个提取的决定r . emodi通过高效液相色谱分析。一个库的分析特征(、保留时间确定,斜率和限制校准)100多酚标准建立了神et al。21)被用作参考化合物鉴定。表3显示了酚类化合物中标识methanolic提取的r . emodi粉末连同相应的保留时间(R_t)。水和methanolic提取物还含有未知化合物明显从液相色谱数据的特征是在前景。

4所示。讨论

水和methanolic提取物r . emodi显示所有的有前途的抗氧化活性实验模型使用。提取被发现都是剂量依赖性增加抗氧化电位和不同程度的效率。微分提取物的清除活动上可以归因于不同机制的彻底清除这些化验。提取观察好食腐动物的氢氧自由基,这是参与DNA交联链断裂,并被认为是一个快速发起者的脂质过氧化作用[24]。提取的能力直接淬火羟基自由基可能与脂质过氧化反应的预防。可以推断出,提取可能防止活性自由基破坏生物分子如脂蛋白、多不饱和脂肪酸,DNA、蛋白质、氨基酸和糖在生物系统25]。

两种提取物显示浓度时细胞毒性测试的两个癌症细胞系。根据美国国家癌症研究所,IC₅₀值考虑粗提取液有前途的抗癌药物的发展(s)低于30的极限阈值克/毫升(26]。提取物可以作为抗癌化合物的潜在来源。水提物,另一方面,虽然有较低的潜在细胞毒素,显示了相当程度的DNA氧化损伤防护,而其methanolic对应整体缺乏这个属性。这些差异可以归因于差动保护存在的代谢物中筛选了两种溶剂,也由于立体选择性和/或溶解度等因素的两个提取物(27]。提取物都因此发现承诺向发展潜力的药物可能用于目标肿瘤化学预防化疗/检查肿瘤生长和恶性肿瘤。

一个重要的(P< . 05)之间正相关外推的结果来估计总酚含量的测定和调查其它治疗参数。针对这一点,高效液相色谱法分析识别的一些主要提取酚类化合物。然而,我们在识别完成主要只在methanolic提取多酚类物质。

抗氧化,细胞毒性和DNA提取使他们适合的保护能力被认为是一个源的发展抗癌药物(图8)。在肿瘤细胞ROS产生广泛,从而增加水平的某些生长因子和酶如金属蛋白酶(mmp),促进血管生成,并提升二次肿瘤的转移和发展的风险(28]。提取物的抗氧化性能可能因此防止癌症的进展;而细胞毒性的潜力,另一方面,可能是用来对付癌细胞,从而引导他们对细胞凋亡和细胞死亡。DNA保护抑制房地产可能持有好进步的肿瘤组织的二次变异。

5。结论

粉末的r . emodi可能是一个潜在来源为抗癌代谢物,可以召集的发展有效的抗癌药物。隔离和表征化合物的r . emodi粉末中提取前景。

确认

作者欣然承认Lazar马修教授,主任,维特大学,生物科学与技术学院Vellore,泰米尔纳德邦,印度为他对成功的支持和指导本研究的成就。维特大学(内部融资)。

引用

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