乙醇提取物瓜萎通过K562细胞中p38 MAPK激活和ERK失活促进胎儿血红蛋白的生成

摘要

药物刺激胎儿血红蛋白(HbF)表达可能是一种有希望的治疗-地中海贫血的方法。在这项研究中瓜萎(FT)检测人红白血病K562细胞γ -球蛋白mRNA和hbf诱导活性。研究了细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase, ERK)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mito原activated protein kinase, MAPK)信号通路的作用。通过实时反转录聚合酶链反应和酶联免疫吸附法测定，发现FT乙醇提取物显著提高γ -globin mRNA和HbF水平，且呈剂量和时间依赖性。总Hb (THb)水平在无细胞毒性的浓度也升高(<80μ克毫升⁻¹)．p38 MAPK抑制剂SB203580预处理可阻断FT提取物的总刺激作用和HbF诱导作用。相比之下，当使用ERK抑制剂PD98059治疗时，HbF没有变化。此外，FT乙醇提取物激活了K562细胞中的p38 MAPK并抑制了ERK信号通路，这在western blotting分析中得到了证实。此外，当细胞被FT处理时，SB203580显著地消除了p38 MAPK的激活。综上所述，FT的乙醇提取物被发现是K562细胞中HbF合成的有效诱导物。目前的数据描述了ERK和p38 MAPK信号通路在FT治疗后作为药物刺激HbF产生的分子靶点的作用。

1.介绍

-地中海贫血是一种常染色体隐性遗传病，常见于地中海、东南亚和中国南部[1，2]它是由染色体11p15.5上的β-珠蛋白基因突变引起的。患者的发病率和死亡率都很高，包括伴有铁超载的输血依赖性贫血、肝脾肿大和无效的红细胞生成[3.］．胎儿血红蛋白(HbF)的增加可以弥补成人血红蛋白(HbA)合成的不足-地中海贫血患者[4］．一些化疗药物，如羟脲(HU)和5-氮杂胞苷已被用于提高HbF的产生[5，6]，但骨髓毒性、对长期致癌的恐惧以及对治疗的温和反应限制了这些药物的临床用途[7，8］．针对目前缺乏良好的治疗药物，我们以人红白血病细胞系K562为筛选平台，建立了合理的策略，寻找新的干预手段来激活中草药中HbF的产生。我们的初步研究表明，乙醇提取物瓜萎（FT）可诱导HbF的产生在体外．

FT的成果瓜蒌MAXIM，是最常用的中草药之一。根据中医理论，FT可用于治疗痰热咳嗽和寒痰积[9］．此外，FT还被用于糖尿病、支气管疾病、乳腺癌、白血病和埃利希氏腹水癌的各种民间疗法。然而，关于其生物活动的科学证据非常有限。只有一项研究证明，FT的二氯甲烷组分能抑制人白血病U937细胞的增殖并诱导细胞凋亡在体外［10］．人红白血病细胞系K562以前已被证明为费城染色体阳性。暴露于血红素后，胚胎Hb (Hb Gower和Hb Portland)和HbF的表达水平显著升高[11］．该细胞系似乎沿着胚胎-胎儿红细胞分化途径，并独立于最终分化产生Hb [12］．因此，它被广泛用作研究人珠蛋白基因调控和hbf诱导剂筛选的模型系统[13］．

为了确定FT对hpf的诱导作用，本实验旨在研究FT对K562红细胞分化的影响。我们发现FT乙醇提取物促进γ -珠蛋白(-K562细胞培养中珠蛋白mRNA的表达和HbF的产生。诱导作用可能是由于p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的激活和细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号通路的失活。

2.方法

2．1．植物提取

FT原料由香港草药制药公司购买，并按照中国药典认证。14］．参比药材购自国家药品与生物制品控制研究所。经鉴定的凭证标本保存于香港中文大学中医研究所。乙醇提取物制备:用2 l 95%乙醇在60℃下提取500g干燥FT, 24 h。这个提取步骤重复了两次。收集的乙醇溶液经简单渗滤后，在65℃下旋转蒸发，直至内部物质变为粘稠的半固态。加入2.5体积40%乙醇，沉淀出提取物的黏性含量，丢弃。然后通过旋转蒸发去除溶液中的乙醇含量，用冷冻干燥机冻干。粉状的提取物在室温下保存在干燥器中直到使用。

2．2.K562细胞培养及治疗方案

人红细胞白血病K562细胞取自美国型培养物。K562细胞在rmi -1640培养基中(添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素)，在5% CO的湿化气氛下培养₂在37°C。细胞在110⁴细胞毫升⁻¹当它们达到半汇流时。

将FT乙醇(FT- etoh)提取液在二甲基亚砜(DMSO)中重组进行细胞培养。调整DMSO浓度培养基最终浓度的0.1%，对细胞无细胞毒性作用。细胞用不同浓度的FT-EtOH提取物和已知阳性对照HU处理。在细胞毒性研究中，K562细胞在4℃下接种在96孔板中10^3.在37°C下药物处理48小时。对于总Hb (THb)和HbF的测定，细胞于410^3.在治疗6天期间，每天进行测量。为了阐明潜在的信号通路，抑制ERK-PD98059 (25和p38 MAPK-SB203580 (10M) -在FT处理前在K562培养物上添加，然后进行THb和HbF定量，以及western blotting分析。FT-EtOH提取液的最佳浓度为20克毫升⁻¹在我们的初步实验中进行机理研究。

2．3.细胞毒性试验

采用1-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-(3,5)-二苯甲醛(MTT)比色法测定FT提取物的细胞毒性作用。总之，药物治疗48 h后，MTT溶液(5 mg mL⁻¹在磷酸盐缓冲盐水中）添加到每个孔中，并在37℃下孵育3小时 h、 将由活细胞降低MTT产生的蓝色formazan晶体溶解在DMSO中，并在540处测量吸光度 细胞存活率以治疗组与未经药物治疗的对照组中活细胞的百分比来确定。

２.４.有分析

用3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)法测定K562细胞的相对THb产量，TMB法是基于血红素部分的过氧化物酶活性。每隔一段时间，用5% TMB (w/v)溶液在37℃黑暗下反应10 min，加入2m H终止反应₂所以₄．倒置显微镜下计数染色(蓝色)和未染色(淡黄色)细胞数。THb相对产量表示为(染色细胞数/总细胞数)100%。用血浆Hb试剂盒(Sigma)按厂家说明定量测定Hb。

2．5．住宅化验

采用市售酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(Bethyl)定量测定K562细胞HbF水平。每隔一段时间，将稀释后的细胞裂解液(50 mM Tris-Cl/1% BSA)转移到96孔板上，预涂抗hbf，室温孵育1 h。二抗(马萝卜过氧化物酶)与一抗结合1 h，加入10% TMB溶液。加入2m H后，反应终止₂所以₄在450nm处测定吸光度。HbF浓度参照标准曲线确定，以HbF /总蛋白表达。

2.6。定量实时聚合酶链反应-及球蛋白mRNA

以1的密度将细胞接种到6孔板上10⁴细胞毫升⁻¹与相应的FT-EtOH提取物在不同浓度和HU下37℃孵育6天。治疗6 d后，按厂家说明书(Qiagen)使用RNeasy mini kit从各实验组培养物中分离总RNA。采用QuantiFast SYBR Green RT-PCR试剂盒(Qiagen)和ABI 7500 Fast real-time PCR System进行一步实时反转录聚合酶链反应(RT-PCR)。- - --珠蛋白基因特异性引物由制造商设计定制并验证(Hs_HBA1_2_SG, QT01671215;Hs_HBG2_1_SG QT00040068;QuantiTect底漆化验;试剂盒)。每个反应混合物含有以下物质:80 ng RNA, I每个引物的M, 12.5L 2定量SYBR green RT-PCR master mix, 0.25L定量逆转录酶混合和无核酸酶H₂O到25L.采用以下热循环条件:反转录，在50℃下10 min;PCR初始激活步骤，95℃5分钟;放大:95°C 15 s, 55°C 30 s, 45个循环。对RT-PCR产物进行熔化曲线分析，以验证PCR产物的特异性和同一性。对每个样品进行实时RT-PCR分析，内参基因(甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因，GAPDH)作为内参基因。

相对基因表达量为,在那里= Ct_目标   计算机断层扫描_GAPDHCt值为周期阈值。SD由三次独立实验确定值。上下误差定义为和,分别。将治疗组的Fold change定义为相对表达量，与未治疗对照组比较，计算为,在那里 Ct_治疗＝Ct_治疗- - - - - -Ct_控制．

2.7。免疫印迹分析

处理后的K562细胞裂解200L冰冷裂解缓冲液(50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF, 0.2 mM钒酸钠，1% SDS, 1 mM苯甲基磺酰氟，1克毫升⁻¹抑肽酶和1克毫升⁻¹白细胞介素)和蛋白浓度的测定采用双氰菊酯酸法。胞质提取物(20g)用10%聚丙烯酰胺凝胶进行sds -聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到聚偏二氯乙烯fluoride膜(Biorad)。用含0.1% Tween-20和10%奶粉的tris缓冲盐水封膜1小时，然后用稀释的一抗(抗erk1 /2磷酸化，抗erk1 /2总，抗应激激活蛋白激酶/c-Jun NH)在室温下孵育过夜₂-末端激酶（SAPK）磷酸化、抗SAPK总抗体、抗p38磷酸化抗体和抗p38总抗体；Calbiochem）。培养后，用TBS-T清洗膜，然后培养1小时 二级抗体结合过氧化辣根在1 : 根据制造商的说明（Biorad），化学发光蛋白检测系统可使感兴趣的蛋白质可视化。

2.8.统计分析

所有数据均表示为平均值标准偏差(SD)。所有统计分析均使用SigmaStat 3.5版软件(SPSS Science software GmbH, Erkrath, Germany)进行。采用单因素方差分析比较各处理组与对照组之间的差异有统计学意义因果Dunnett测试。值和被认为具有统计学意义。采用非线性回归剂量-效应曲线测定IC50和EC50值。

3.结果

３．１．细胞毒性试验

FT-EtOH提取物对K562细胞的细胞毒性作用如图所示1．FT-EtOH提取物有剂量依赖性的抑制作用。细胞毒性作用显著80年克毫升⁻¹提取。FT-EtOH提取物的IC50为108.6克毫升⁻¹．

３.２．有分析

我们的结果表明FT-EtOH提取物诱导THb形成的范围内没有细胞毒性作用。40岁克毫升⁻¹提取物对THb产生的影响最大，为78.0%  4.2%(图1)．超过这个浓度，Hb的诱导程度降低，可能是由于MTT试验中发现的细胞毒性作用增加。

ft - ettoh提取物thb诱导效应的时间响应如图所示2．从第3天到第6天，与第1天各自的基础值相比，所有试验浓度的FT提取物均显著增加了tmb阳性细胞百分比。实验结果表明，该提取物的最佳用量为40克毫升⁻¹在25℃时，与阳性对照HU具有相似的时间依赖性hb诱导效应克毫升⁻¹．在对照组中，tmb阳性细胞的百分比略有增加(15%)。表明K562细胞在延长培养过程中具有自分化能力。

3．3.住宅化验

HbF在所有测试浓度(20-80克毫升⁻¹)，与未处理细胞对照比较[图3(一个))．FT-EtOH提取物的剂量依赖性反应范围为20-40克毫升⁻¹．最大反应在40时观察到克毫升⁻¹．超过这个剂量，FT诱导hbf的作用减弱，可能是由于其在较高剂量时的细胞毒性作用。FT-EtOH提取物的时间依赖性效应也在6天的孵育期间得到证实(数据未显示)。HU中也显示了类似的hbf诱导效应(25克毫升⁻¹)组，培养6 d后HbF浓度显著升高。在实验过程中，从第4天到第6天，未处理的对照细胞中发现了K562细胞的自分化(数据未显示)。然而，增加的程度小于治疗组和阳性对照组。

为了研究ft - eth提取物对HbF刺激的特异性，我们测定了HbF与THb的比值。FT-EtOH提取物增加了HbF相对于K562细胞总数的比例。40岁克毫升⁻¹与未经处理的对照细胞相比，FT-EtOH提取物使HbF比率增加2.6倍，其HbF诱导作用与阳性对照细胞相似。

3．4．实时荧光定量PCR- - -球蛋白mRNA

经过6天的治疗，-珠蛋白mRNA水平在所有调查浓度显著增加(20-80克毫升⁻¹)，与未处理细胞对照(图4)．这种提取物对-珠蛋白mRNA的诱导范围为20-40克毫升⁻¹．40岁克毫升⁻¹的mRNA水平-珠蛋白增加4.8  与未经处理的对照细胞相比增加了0.5倍。FT-EtOH提取物对细胞的诱导作用-珠蛋白mRNA表达在高浓度时降低。HU也有类似的反应(25克毫升⁻¹)组显示为5.20.6成倍增加。mRNA的表达-珠蛋白也增加，但程度较轻。40岁克毫升⁻¹的mRNA水平-珠蛋白增加了3倍。我们的数据表明FT-EtOH提取液对-珠蛋白mRNA的表达，由蛋白数据提示。

3.5. 特异性MAPK抑制剂对FT处理培养物的抑制作用

为了确定MAPK介导的信号通路是否参与FT驱动的HbF诱导，我们检测了ERK抑制剂PD98059和p38抑制剂SB203580在FT处理的K562培养物中的作用。如图所示5(一个)， SB203580对ft诱导的Hb产生的抑制率为48%，而PD98059对ft处理的培养没有任何显著影响。同样，p38抑制剂SB203580也显著降低了ft诱导的HbF合成(图)5 (b))．第6天，FT + SB组HbF/总蛋白比例为17.20.7，明显低于FT组50%。另一方面，ERK抑制剂PD98059没有显著改变HbF的产生()，与FT组比较。

3.6。Western Blotting分析信号通路

p38、ERK和SAPK通路被认为参与了HbF的激活。我们测试了FT是否影响K562细胞的这些通路。如图所示6(一)，发现p-ERK和p-SAPK的基础水平明显，因为这两种蛋白都积极参与细胞增殖和未分化状态下的生存[15，16］．对于p38，添加FT-EtOH提取物10分钟后，其基本磷酸化，并在整个观察期间持续这种磷酸化。相反，在FT处理后，ERK以时间依赖性的方式去磷酸化。而SAPK蛋白的磷酸化没有明显变化。此外，p38抑制剂SB203580的处理下调了ft诱导的p38磷酸化(图)6（b）)这些结果表明p38的激活对于FTI诱导的HbF产生至关重要。

4.讨论

到目前为止，越来越多的人使用药用植物的提取物作生物医学用途，以治疗各种疾病，例如糖尿病[17，心血管疾病[18]及骨骼疾病[19］．然而，对于-血红蛋白病，只有少数例子可用。例如，Niprisan (Nix-0699)，一种从尼日利亚本土植物中提取的乙醇/水提取物，显示出显著的抗镰状病效果在体外和在活的有机体内［20，21］．最近，佛手柑果提取物被报道为一种很好的-珠蛋白基因在K562和人祖细胞中的表达诱导剂[22］．阿育吠陀药草的提取物，埃格尔马梅洛斯酒店也发现与K562人红白血病细胞中红细胞分化和HbF诱导的激活有关[23］．此外，在K562或人红细胞祖细胞中，植物化学物质(如当归素和白藜芦醇)被证明是红细胞分化和γ -珠蛋白基因表达的有效诱导剂[24，25］．

在本研究中，我们发现FT的乙醇提取物与HU一样，显著增加了K562细胞中HbF的生成。这是由HbF蛋白水平的增加和-珠蛋白mRNA的合成，在FT提取物处理后。THb水平也升高。我们发现HbF合成的激活涉及ERK的抑制和p38 MAPK信号通路的激活，如western-blotting分析所示。SB203580对p38信号的特异性抑制抑制了ft - etoh介导的Hb产生。数字7显示了总结实验结果的示意图。

我们的结果表明，FT-EtOH提取物能够有效地提高-珠蛋白mRNA的合成和HbF的产生而不杀死细胞。FT长期以来被认为是无毒的，因为它在中国使用了数千年，没有严重的副作用。与hbf诱导的化疗药物相比，该提取物对长期治疗相对安全。此外，近年来有报道称，红系祖细胞加速凋亡-地中海贫血是确定治疗的主要障碍，因为大多数hbf诱导剂是细胞毒性的，可抑制细胞增殖并导致细胞生长停滞[26］．因此，这些药物对珠蛋白链平衡的有益作用可能不会在凋亡细胞中诱导。因此，低细胞毒性的药物，如FT-EtOH提取物，可以减少细胞凋亡-地中海贫血红细胞，为有效的红细胞生成提供更有利的条件。

我们研究了与红细胞分化相关的三个信号级联反应，包括p38 MAPK、ERK和SAPK。有报道称，HU通过抑制ERK和激活p38 MAPK信号转导途径介导红细胞分化和HbF生成[27］．我们的结果与上述报道一致，说明FT-EtOH提取物对K562细胞红细胞分化的影响有一些相似之处。在K562细胞中，ERK信号的激活导致巨核细胞的分化，而抑制ERK信号通路则增强了红细胞的表型-珠蛋白mRNA表达[28］．另外，据报道ERK途径抑制剂U0126可诱导人红系祖细胞-珠蛋白表达和HbF形成[29].最近，Mabaeraet al。提示p38 MAPK在HbF再激活中起核心作用[30］．p38 MAPK信号通路可被各种环境胁迫激活，并在细胞凋亡、细胞生长和红细胞分化中发挥重要作用。从K562细胞和人红细胞祖细胞中积累的证据表明p38 MAPK上调参与hbf诱导过程[31，32］．此外，p38 MAPK信号通路参与了几种hbf诱导剂的作用，包括丁酸[33], apicidin [34]曲古抑素A[35］．我们目前的研究表明，FT-EtOH提取物通过抑制ERK和激活p38 MAPK信号转导来诱导红细胞分化和HbF的产生。但MAPKs激活或失活的作用机制尚不清楚。有人提出，包括DNA损伤、氧化应激、热休克、渗透休克、一氧化氮和蛋白质合成抑制在内的多个上游信号会激活下游激酶和转录因子，从而产生HbF [30］．

最近，关于SAPK参与红细胞分化的报道相互矛盾[27，32，33，36］．SAPK的活化被证明是促红细胞生成素诱导的小鼠红白血病细胞的红细胞分化所必需的[32］．然而，当HU处理K562细胞时发现SAPK有显著的抑制作用[27］．除此之外，短链脂肪酸衍生物(SCFAD)，如丁酸盐和丙戊酸盐，对K562细胞中的SAPK通路没有任何影响[33，36］．因此，SAPK在HbF诱导中的作用尚不明确。在我们的研究中，FT-EtOH提取物并没有引起SAPK磷酸化，并且被发现诱导了与SCFAD相似的MAPK调制模式，这表明两者具有相同的胞内信号通路。

我们研究的主要局限是FT-EtOH提取物含有大量的化合物。它们各自的药代动力学和生物转化性质在活的有机体内不明确的。这些活性化合物在对红系祖细胞产生直接作用之前可能已经被代谢，特别是对于那些口服治疗药物。此外，FT-EtOH提取物可能含有其他干扰活性成分生物作用的物质在活的有机体内．因此,发展-地中海贫血动物模型对准确预测治疗效果具有重要意义在活的有机体内．

综上所述，我们的结果首次证明了FT乙醇提取物对K562细胞的hbf诱导作用-珠蛋白mRNA表达和HbF水平。FT-EtOH提取物的诱导作用可能是通过直接刺激p38 MAPK和抑制ERK信号通路介导的。我们的观察结果将作为进一步研究的基础。为了在国际科学界发展ft - ettoh萃取物作为一种治疗此外，FT-EtOH提取物对正常供体或正常供体的原代前体细胞的影响还有待进一步研究-thalassaemic病人。此外，还需要进行急性和慢性毒性试验在活的有机体内以确保该提取物在人体临床使用时是安全的。最后，将对提取物的疗效进行临床评价。预计ft -乙醇提取物是一种有前途的替代和补充剂管理地中海贫血。

资金

明莱基金会和香港创新科技基金UIM／168。

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