大肠抗炎活性Baccharis dracunculifolia在三硝基苯磺酸大鼠结肠炎模型中的应用

摘要

Baccharis dracunculifoliaDC(菊科)是一种巴西药用植物，因其抗溃疡和抗炎的特性而被广泛使用。这种植物是巴西绿色蜂胶的主要植物来源，这是一种天然产品，可用于食品和饮料，以改善健康。本研究旨在研究其化学成分和肠道抗炎活性b . dracunculifolia三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的实验性溃疡性结肠炎提取物。通过评估谷胱甘肽含量、髓过氧化物酶（MPO）和碱性磷酸酶活性，从宏观和生化角度评估结肠损伤。补充在体外本实验旨在通过抑制大鼠脑膜脂质过氧化来检测其抗氧化活性。采用高效液相色谱法进行植物化学分析。给予植物提取物(5和50毫克公斤)⁻¹)显著减轻TNBS引起的结肠损伤，这在宏观和生物化学上都得到了证实。这种有益的作用可能与改善结肠氧化状态有关，因为植物提取物可以防止谷胱甘肽消耗，抑制脂质过氧化和降低MPO活性。咖啡酸,p香豆酸,aromadendrin-4 -O甲基醚、3-prenyl -p-香豆酸，3,5-二丙烯基-p-香豆酸和芽孢杆菌素在植物提取物中检测到。

1.介绍

炎症性肠病（IBD）本质上是指两种不同但密切相关的疾病，克罗恩病和溃疡性结肠炎。虽然IBD的病因尚不清楚，但有证据表明它涉及免疫、遗传和环境因素，这些因素反过来又与结肠炎的发生和发展有关[1，2]IBD与对其他无害刺激的异常加剧的免疫反应有关，该反应未被通常下调粘膜对管腔因子反应的反馈系统正确消除[3.］．因此，慢性炎症区域炎症细胞数量增加，导致多种促炎介质过度生产，包括二十烷类、血小板激活因子、细胞因子和活性氧和氮代谢物[1- - - - - -4］．氧化应激通过活性氧的过度释放已经被假设在IBD发病机制中发挥了关键作用[5，6］．事实上，抗氧化活性可能是5-氨基水杨酸盐在人类IBD中显示的有益作用的原因[7]，以及在实验模型中从不同的天然化合物中获得的益处，主要是类黄酮等酚类化合物[8]，坦普尔[9),异香豆素10和香豆素衍生物[11］．

Baccharis dracunculifoliaDC(菊科)是一种巴西药用灌木，通常被称为“Alecrim do Campo”，用于治疗溃疡、炎症和肝脏疾病[12，13］．这种药用植物被发现是巴西蜂胶的树脂和化学成分的主要植物来源，巴西蜂胶被称为绿色蜂胶，最近被纳入食品和饮料，以改善健康和预防几种疾病[14- - - - - -16］．

近年来，人们对巴西绿色蜂胶及其主要植物来源的化学特征和生物活性的研究越来越感兴趣，b . dracunculifolia．几项研究表明b . dracunculifolia作为抗锥虫活性化合物的重要来源[17,抗溃疡的18),抗菌19,抗诱变剂的20.),免疫调节21,抗炎22]及自由基清除[23)活动。虽然绿色蜂胶的组成比以前认为的更复杂和不可预测[24]，很明显，绿色蜂胶的药理潜力与以前被称为植物成分的物质有关，主要来自B．dracunculifolia［14，16，24- - - - - -26］．

因此，本研究旨在评价地物乙酸乙酯提取物的肠道抗炎活性b . dracunculifolia三硝基苯磺酸(TNBS)酸对大鼠结肠炎的影响。为此目的，我们测定了b . dracunculifolia在两种不同的实验条件下，即结肠黏膜完整时和粘膜在初次损伤后愈合时，TNBS诱导的炎症反应的预防。因此，目前的工作也试图确定的化学成分b . dracunculifolia乙酸乙酯提取物经高效液相色谱分析。

2.方法

2．1．植物提取物的制备

地面部分b . dracunculifoliaDC是2005年12月在巴西São Paulo州Cajuru市收集的。该植物材料经Jimi N. Nakagima鉴定，一份凭证标本(SPFR 06143)保存在São Paulo大学生物学系的植物标本室(FFCLRP)，位于Ribeirão Preto, State of São Paulo, Brazil。新鲜植物材料在风干C浸泡48小时。干燥的叶子在搅拌器中磨成粉末，在室温下在乙酸乙酯中浸泡24小时。这种溶剂由于其多酚含量而被使用。溶剂经过真空蒸发后乙酸乙酯提取物b . dracunculifolia获得了。

2．2.实验设计

从São Paulo State University (UNESP)实验室动物服务中心取雄性Wistar大鼠(200±20 g)，随机分为实验组。这项研究是根据São Paulo State University动物实验委员会(协议编号042/04-CEEA-IB)发布的“实验动物护理和使用指南”进行的。动物被安置在makrolon笼中，并在有12小时光照-黑暗循环和空气过滤的空调环境中饲养，并为它们提供免费的自来水和食物。结肠炎是由最初描述的方法引起的[27］．动物被禁食一夜，并用氟烷麻醉。在麻醉下，将10 mg TNBS溶于0.25 ml 50%乙醇(v/v)，通过特氟隆插管插入肛门8cm。非结肠组大鼠给予0.25 ml生理盐水。

2.2.1。急性结肠炎

大鼠分别给予5、10、25、50、100、200 mg kg⁻¹每天b . dracunculifolia分别在诱导结肠炎前72、48、24、2 h及诱导结肠炎后24 h提取。植物提取物悬浮在1% (v/v) Tween 80中，通过食管导管给药。非结肠结肠炎组大鼠口服生理盐水，非结肠结肠炎(tnbs对照组)大鼠口服佐剂(1%吐温80)。所有组别的动物(n= 6)在结肠炎诱导48 h后处死。

2.2.2.慢性结肠炎

在该方案中，如前所述，用10mg TNBS在50%乙醇中诱导结肠炎。这些动物被分为三组;两组患者分别给予5、50 mg kg口服⁻¹另一组则服用25毫克公斤的植物提取物⁻¹磺胺吡啶悬浮在同一载具中。第一次给药2 h后开始治疗，一直持续到处死前一天。另外纳入两组作为参考:一组为非结肠组，一组为结肠组，后者仅给予TNBS第一剂(TNBS对照组)。这些组的动物被给予车辆(5毫升公斤⁻¹1% Tween 80)口服。每组动物在结肠炎诱导后1 ~ 2周处死。

2.2.3。结肠损害评估

记录动物体重、腹泻发生率和邻近器官的粘附情况。这些动物被过量的氟烷安乐死，剖腹手术后获得结肠段。结肠被放置在冰冷的盘子上，清除脂肪和肠系膜，在滤纸上涂抹，在恒定负载(2 g)下称重并测量其长度。两名不知道治疗的观察人员根据所描述的标准，纵向切开结肠，对宏观可见损伤进行0-10级评分。28)表1．然后将结肠纵向分成不同的部分用于生化检测:总谷胱甘肽(GSH)含量[29，髓过氧化物酶(MPO)活性[30.]和碱性磷酸酶(AP)活性[31］．

额外的在体外通过不同浓度乙酸乙酯的抗氧化活性试验，研究了不同浓度乙酸乙酯的抗氧化活性b . dracunculifolia-1600 (12.5μ克毫升⁻¹）.这些是通过测定大鼠脑膜脂质过氧化程度来评估的。32］．简单地说，从4个月大的雄性Wistar大鼠获得大鼠脑样本。所有样品在含mmol l的缓冲液中稀释至1:10 (w/v)⁻¹Tris 50.0, NaCl 100, KCl 0.5, CaCl₂0.5, MgSO₄1.0，KH₂阿宝₄0.55和蔗糖(pH 7.4)制备膜富集组分。用20 mol l的缓冲液将膜浓度稀释至1:4 v/v⁻¹三。然后，加入缓冲液(在没有抑制剂的试验中)或不同浓度的植物提取物。经非酶途径诱导脂质过氧化μm ol l⁻¹硫酸亚铁和抗坏血酸孵化后C反应45分钟后，停止反应，用0.5%硫代巴比妥酸和20%三氯乙酸分析丙二醛(MDA)。搅拌、孵育后丙二醛的含量C离心15分钟，1000 g离心15分钟C，通过测量上清液在532 nm处的分光光度法吸光度来测定。以槲皮素为参比，在同一检测体系中进行检测。

2．3.统计分析

所有结果均表示为平均值±SEM。采用单因素方差分析(ANOVA)检验均值之间的差异是否具有统计学意义事后至少有意义的测试。非参数数据(得分)以中位数(范围)表示，并采用Kruskal-Wallis检验进行分析。统计显著性设为P< . 05。

2.4.通过HPLC对植物提取物进行植物化学分析

地上部分的乙酸乙酯萃取物b . dracunculifolia采用岛津高效液相色谱仪(SCL-10A副总裁系统控制器，三台LC-10AD泵，SPD-M10A副总裁光电二极管阵列探测器和岛津Class-VP 5.02软件)。CLC-ODS (M)色谱柱(4.6 mm i.d. × 250 mm, 5μ固定相为CLC G-ODS保护柱。流动相的组成如下：a-B:25-100%（B）60% min，A:93.9%水，0.8%醋酸，0.3%醋酸铵，5.0%甲醇；B:乙腈；检测波长：280nm，流速：1 最小毫升⁻¹．通过与现有的标准品进行比较，比较紫外光谱，并考虑使用两个波长(A280/320)获得的最大λ和相对面积，确定检测到的化合物。乙酸乙酯提取物溶于甲醇(HPLC级)，浓度为1 mg ml⁻¹．分析前，所有样品以1300转/分离心，并通过45μm过滤器。

3.结果

给药TNBS/乙醇导致结肠炎症，表现为黏膜坏死沿结肠延伸，伴肠壁增厚、充血和与邻近器官的局灶性粘连(见表)2）.这一炎症过程与结肠重量/长度比的增加和80%的结肠动物出现腹泻症状有关(见表)2）.与非结肠大鼠相比，结肠MPO和AP活性分别增加了8倍和2倍，而谷胱甘肽水平降低了56%(表)3.）.

口服该植物提取物，剂量分别为5和50毫克公斤⁻¹显著减轻TNBS/乙醇大鼠结肠炎模型肉眼黏膜损伤2）.给药5 mg kg⁻¹的b . dracunculifolia大肠氧化损伤引起的结肠谷胱甘肽耗竭(见表)3.）.在5、50、100和200 mg kg剂量组，对照组和治疗组大鼠的结肠组织MPO活性显著不同⁻¹(表3.）.50 mg kg处理的大鼠AP活性也降低⁻¹植物提取物。植物提取物的效果与磺胺吡啶相似(见表)2和3.）.这些结果促使我们选择两种剂量(5和50毫克公斤)⁻¹)用于慢性方案测试。

在慢性结肠炎中，由10 mg TNBS在50%乙醇(v/v)中结肠内灌注引起的炎症过程随着时间的推移而进展，其特征与以前报道的相似[10，11］．确实，由于67%的大鼠出现腹泻症状，结肠吸收功能发生了改变(见表)4）.

给药5和50 mg kg⁻¹的b . dracunculifolia1周后，结肠损伤评分、病变扩展、腹泻症状和结肠与邻近器官的粘附性降低(表1)4）.因此，两种剂量的b . dracunculifolia在第一周结束时，提取物能够抵消谷胱甘肽的含量，降低MPO和AP的活性(表1)5）.2周后，两种剂量的植物提取物均能有效抑制谷胱甘肽含量，降低AP活性(见表2)5）.

的在体外进行的实验表明，植物提取物对大鼠脑膜诱导的脂质过氧化具有抑制作用，具有IC₅₀值为26.33μ克毫升⁻¹.相应的IC₅₀槲皮素值为1.51μM对应0.46μ克毫升⁻¹．

乙酸乙酯提取物的高效液相色谱分析b . dracunculifolia只允许识别下列化合物:咖啡酸p香豆酸,aromadendrin-4 -O甲基醚、3-prenyl -p-香豆酸，3,5-二丙烯基-p-香豆酸和baccharin(图1和2）.

4.讨论

氧和氮的活性代谢物在IBD病理生理学中的作用已经作为结肠炎的实验模型在人类中被广泛报道[6，10，33，34]。肠内的炎症过程可能源于炎症肠内长期存在大量活化的含MPO的吞噬细胞。这些吞噬细胞是活性氧物种过度产生的原因，这些活性氧物种压倒了抗氧化防御，如谷胱甘肽及其相关酶，这些酶通常会分解保护结肠组织免受氧化损伤。事实上，据报道，溃疡性结肠炎和克罗恩病患者结肠活检标本中活性氧的产生与正常对照粘膜相比显著增加，与炎症性肠病活动呈正相关这种现象似乎是中性粒细胞来源的[35］．因此，抗氧化治疗可以成为一种有趣的方法来下调这种炎症条件。在这种作用的背景下，5-氨基水杨酸衍生物所发挥的有益保护作用被归因于其抗氧化和清除自由基的特性[7］．因此，含有类黄酮和其他酚类化合物等抗氧化化合物的植物提取物可能是人们最感兴趣的[36］．

本研究表明，乙酸乙酯提取物具有一定的预防作用b . dracunculifolia对改善大鼠结肠内给药后结肠损伤的作用。该植物提取物(5和50 mg kg)的预防肠道抗炎活性⁻¹)在TNBS诱导的炎症过程的急性期，通过降低病变的损伤评分，从宏观上证明了这一点。口服25%葡萄糖也产生了类似的效果 镁 公斤⁻¹磺胺吡啶是治疗IBD的首选药物。这两个b . dracunculifolia提取物和柳氮磺胺吡啶未能降低结肠重量/长度比率。对该比率的影响不足可以解释为TNBS/乙醇引起的严重和广泛的结肠损伤，正如先前所建议的，这很难通过药物治疗来克服[37］．在结肠炎症过程的急性期，保护作用b . dracunculifolia提取物没有剂量依赖性，因为较高剂量的植物提取物会导致活性的丧失。黄酮类化合物如diosmin和橙皮苷已被描述为具有双重作用[38]，槲皮素[33]和水飞蓟素[39]、异香豆素巴甲素[10]以及香豆素和4-羟基香豆素[11，这可能与这些化合物在大鼠结肠中低剂量时作为抗氧化剂和高剂量时作为促氧化剂的已知能力有关。另一方面，炎症是一个多组分系统，涉及细胞串扰和控制网络。然而，产生的抗炎作用b . dracunculifolia可能与这些化合物作用于不同炎症介质的不同机制有关。

MPO活性已被广泛用于检测和监测肠道炎症，因此这种酶活性的降低可以解释为给定化合物的抗炎特性的表现[36，40］．同样，AP活性也可以被认为是肠道炎症的敏感标志，因为这种酶的活性在实验条件下总是增加的[32，41］．这些机制之一可能是抗氧化特性b . dracunculifolia提取。鉴于强烈的氧化损伤是人类IBD的常见特征，这种特性可能在植物提取物的肠道抗炎作用中发挥关键作用[42，43]，以及大鼠结肠炎的不同实验模型，包括TNBS [32，44，45］．在这方面，在本研究中，b . dracunculifolia在两种实验治疗方案中，TNBS大鼠结肠内谷胱甘肽水平的降低都能抵消对照组结肠内谷胱甘肽水平的降低。产生的影响b . dracunculifolia在保护结肠黏膜免受氧化损伤的过程中，可以协同减少中性粒细胞的浸润，这是对TNBS的反应。自由基的产生被认为在IBD发病机制中起着重要的早期作用[6]，可促进炎症的结肠黏膜内初始中性粒细胞浸润。这些细胞的招募和激活导致自由基产生的增加，这超过了组织的抗氧化保护机制，导致氧化应激的情况，最终使结肠炎症永久存在[42］．因此，快速抑制自由基生成有助于降低白细胞渗入炎症组织的水平，从而防止结肠组织炎症。抗氧化性能由此而来b . dracunculifolia与治疗IBD的其他著名药物类似，如5-氨基水杨酸衍生物[46]，从而支持了旨在评估该植物提取物在治疗人类IBD中的应用的进一步研究。

在第二组实验中b . dracunculifolia在炎症过程诱导后进行评估。结果表明，口服给药b . dracunculifolia提取物(5和50毫克公斤⁻¹)结肠炎诱导后，与相应的TNBS对照组相比，第一周后结肠宏观损伤评分和病变扩展显著降低。此外，这些化合物能够改变TNBS给药后1周中性粒细胞浸润结肠的程度，这是通过组织MPO活性测定的炎症减少。中性粒细胞浸润的减少似乎是结肠溃疡加速愈合的结果，从而有助于消除发炎结肠中的中性粒细胞积聚。与急性实验环境类似，由b . dracunculifolia提取物的剂量分别为5和50毫克公斤⁻¹与抗谷胱甘肽耗竭和抑制AP活性有关。

乙酸乙酯提取物的高效液相色谱分析b . dracunculifolia允许鉴定肉桂酸的衍生物，如咖啡酸，p-香豆酸，3-戊烯基-p香豆(drupanin) 3 5-diprenyl -p-香豆素(artepillin C)和3-戊基-4-二氢肉桂油氧肉桂酸(baccharin)，以及类黄酮芳香腺苷-4-O甲基醚(图2）.检测到青蒿素C为主要成分b . dracunculifolia．这种化合物也是巴西绿色蜂胶的主要成分，也是一种有效的自由基清除剂[21］．Artepillin C是一种有效的抗炎化合物，可在腹膜炎期间减少中性粒细胞的数量，并减少前列腺素E₂水平，一氧化氮产量和NF-κB活动(22］．此外，artepillin C还能抑制azoxymethane诱导的小鼠结肠中异常隐窝灶的形成[47］．含肉桂酸衍生物的酚类化合物b . dracunculifolia提取物已被鉴定为具有抗溃疡作用[18),免疫调节21], antitumoural [48，49]、神经保护及抗氧化剂[23，50)活动。高等植物中的多酚化合物是非常好的在体外而大量研究表明，从饮食中摄入植物酚可能对氧化应激相关疾病产生积极影响[51］．的化合物b . dracunculifolia具有与绿色蜂胶相似的自由基清除活性，酚类化合物在两种蜂胶中均有丰富的发现[52］．

综上所述，本研究表明b . dracunculifolia预防TNBS对急性或慢性结肠炎大鼠结肠损伤。这种抗炎作用可能与改善肠道氧化应激有关(图)3.)，主要是由于MPO活性降低，增强了炎症结肠内的内源性抗氧化防御，如谷胱甘肽含量和抑制脂质过氧化。这种肠道抗炎活性与植物提取物中存在的酚类化合物有关，主要是青蒿素cb . dracunculifolia，巴西绿色蜂胶活性化合物的主要来源，作为膳食产品，可作为治疗和预防人类IBD的重要补充。

资金

巴西科技部;CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior，巴西教育部);和FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo)。

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