文摘

睡莲属假丝酵母一般是维吾尔族传统医学用于治疗头痛、咳嗽、肝炎在中国的新疆和高血压。在本文中,提取的n .假丝酵母抗氧化活性测定,使用1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DPPH自由基清除实验和还原能力测定,并与那些积极控制的丁羟甲苯(二叔丁基对甲酚)和没食子酸(GA)。活性提取物进一步纯化的液-液分配负担四个分数,乙的acetate-soluble (EA)分数(指标)与集成电路表现出最强的抗氧化能力₅₀值为12.6对DPPH g / mL。十三个酚类化合物分离得到这个分数,他们都表现出显著的抗氧化活动在DPPH模型系统。此外,指标显示与IC强有力的抗氧化能力₅₀值为59.3224.48 g / mL,和86.85克/毫升g / mL,,·哦和H₂O₂分别激进分子。此外,一旦在BCG + LPS-induced免疫肝损伤评估使用主要培养大鼠肝细胞。一旦产生显著王亚南效果就是明证浮在表面的酶活性下降(AST-aspartate转氨酶,P< . 01;alt谷丙转移酶,P< . 01)和一氧化氮(不,P< . 01)生产。这些结果揭示了在体外抗氧化剂和王亚南活动对免疫性肝损伤的指标。进一步的调查是必要的,以验证这些活动在活的有机体内。

1。介绍

肝脏被认为是一个关键器官新陈代谢,分泌,存储和身体排毒功能和肝损害与扭曲这些函数(1]。肝脏疾病主要是由于有毒化学物质,过量食用酒精、感染和自身免疫性疾病。肝脏产生大量的氧自由基(活性氧(ROS)的排毒异型生物质和有毒物质和氧化应激引起的活性氧已被证明是与肝脏疾病有关,如肝毒性、肝脏和其他病理条件(2,3]。免疫肝毒性的主要培养大鼠肝细胞可以诱导卡介苗(BCG)联合脂多糖(LPS)治疗在体外,该模型涉及的参与各种细胞因子的释放和活性自由基4,5]。因此,免疫机制和氧化应激引起的肝损伤中发挥重要作用BCG + LPS [6]。目前,这个模型经常被用作测试有用的实验手段和开发新药物(7- - - - - -9]。

睡莲属假丝酵母Presl(或雪白的睡莲)是一种草本水生植物原产于中国新疆南部,和鲜花n .假丝酵母已被用来作为民间医药治疗头痛、感冒、咳嗽、肝炎和高血压10]。有35种睡莲属属,广泛分布于热带、亚热带温度区域(11]。多酚化合物的主要特征睡莲属属(12),这些化合物丰富了乙酸乙酯提取的方法(13]。近年来,n stellata来自印度的民间anti-hepatitis医学,集中关注其对碳tetrachloride-induced王亚南在白化大鼠肝损伤(14),和13个酚类化合物分离从这种植物15]。然而,没有进行科学研究关于抗氧化剂和王亚南的影响n .假丝酵母。因此,本研究旨在探讨自由基清除和王亚南乙酸乙酯提取物(指标)的活动n .假丝酵母花在主要培养大鼠肝细胞对免疫损伤在体外。一旦被选为研究基于高酚含量和我们的初步筛查提取物的抗氧化活性。中提取测试,指标显示活性显著高于其他提取物n .假丝酵母(数据1和2)。

图1

提取物的还原能力n .假丝酵母在不同的浓度,和二叔丁基对甲酚。每个值代表平均数±标准差()。

图2

DPPH自由基清除活性提取物的n .念珠菌遗传算法在不同浓度和二叔丁基对甲酚。每个值代表的意思是SD ()。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH),丁羟甲苯(二叔丁基对甲酚),胶原酶(IV型)、脂多糖(LPS),大肠杆菌0555:B5)和3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetra-zolium溴化(MTT)从西格玛化工有限公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。Dulbcco Modifed鹰媒介(DMEM)从Gibco有限公司购买(美国卡尔斯巴德)。卡介苗(生产批号2007030502,截止日期2008年5月6日)是购自上海生物制品研究所(上海,中国)。甘草甜素(Grz)从贾大专业制药有限公司试验设备为天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)是由中升科技提供。(中国,北京)。商业工具用于确定一氧化氮(NO)的活动得到建成生物技术研究所(中国南京)。其他化学物质和有机溶剂均为分析纯,购自当地试剂零售商。

2.2。动物

Sprague-Dawley老鼠(男g, SPF级,证书没有SYXK(鑫)2003 - 0001年,新疆医科大学实验动物中心)被用于这项研究。动物喂养一个标准实验室饮食和安置在有空调的房间,并将其保持在22 C, 55%5%的湿度与12小时光/暗周期。

2.3。植物材料

的花朵n .假丝酵母收集从和田,新疆维吾尔自治区,中国,2005年8月。研究员发现的植物材料严复,研究所的药物学的新疆。凭证标本(没有。20050810)是研究所的沉积药物学在中国新疆。

2.4。酚类化合物的制备,隔离

花儿是shade-dried和粉。一公斤的鲜花粉提取与乙醇回流2小时,和溶剂蒸发真空买得起乙醇提取(NCA)。NCA悬浮在水中,然后先后处理石油、乙酸乙酯n丁醇。蒸发负担石油溶剂,乙酸乙酯,n丁醇(NCB)和水渣(NCW)分数分别的乙酸乙酯部分(指标)8.6% (w / w)的起始物料和被指定用于实验。此外,一旦(40克)在聚酰胺色谱(500 g, 30 - 60目)MeOH-H梯度溶剂体系₂O (0:1-1:0)。收集一百二十年分数组合后TLC指导和反复柱层析法对交联葡聚糖LH-20(甲醇)。最后,13个化合物提供:1(210毫克),2(38毫克),3(61毫克),4(19毫克),5(毫克)21日,6(11毫克),7(8毫克),8(19毫克),9(10毫克),10(20毫克),11(10毫克),12(5毫克)13(分别为9毫克)。

2.5。酚类内容

提取物中总酚含量测定使用过程描述方法(16)与轻微的修改。一毫升的提取物添加到2.0毫升的0.3%十二烷基硫酸钠和1.0毫升的混合铁氰化物氯化铁为0.6% - 0.9% (1:0.9)。混合物被允许站5分钟和0.1毫升的0.1 M盐酸酸添加校准,并放置20分钟在黑暗。吸光度测量在720 nm的分光光度计。定量是基于的没食子酸标准曲线(0 - 1.0毫克/毫升),溶解在甲醇/水(60:40 v / v;0.3%盐酸)。酚醛含量计算以没食子酸为标准和没食子酸当量表示为mg (GAE)(表1)。

2.6。评价抗氧化活动

2.6.1。还原能力

一旦确定了方法的还原能力日圆et al。(17]。不错,没食子酸和二叔丁基对甲酚(0.02 - -0.5毫克,职责。)1.0毫升的甲醇混合磷酸盐缓冲剂(2.5毫升,0.2 M, pH值6.6)和铁氰化钾(K₃铁(CN)₆)(2.5毫升,10 g / L;混合物在50°C孵化20分钟。部分(2.5毫升)的三氯乙酸(100 g / L是添加到混合物中,当时在3000转离心10分钟。解决方案的上层(2.5毫升)与蒸馏水混合(2.5毫升)和FeCl₃(0.5毫升,1.0 g / L)和吸光度测量在700海里。增加反应混合物的吸光度表示增加还原能力。没食子酸(GA)和二叔丁基对甲酚作为积极的控制。

2.6.2。DPPH自由基清除活性测定

DPPH自由基清除活性测定按前面描述的程序(18)与轻微修改的基础上布洛瓦的方法(19]。不同浓度的乙醇稀释样本与2.0波动率的混合M DPPH的解决方案。最终的解决方案是完全混合后在517 nm和吸光度测量保持管在黑暗的30分钟。清除活动决心通过比较含有相同量的DPPH吸光度与控制解决方案和乙醇。自由基清除活性是通过以下方程:

的集成电路₅₀被定义为(浓度在吗g / mL)的提取需要耗尽DPPH自由基量的50%。GA和二叔丁基对甲酚作为积极的控制。

2.6.3。超氧化物阴离子自由基()清除活动分析

不错的超氧化物阴离子自由基清除效果评估spectrophotometrically先前报道(20.]。反应系统包括0.75毫升的吩嗪methosulphate (PMS, 120米),NADH (936M)和氮蓝四唑(电视台,300年米)在磷酸缓冲(0.1 M, pH值7.4)分别0.3毫升蒸馏水提取解决方案是随后补充说。的混合是在25°C的环境中5分钟,吸光度是阅读在560 nm空白样品。GA和二叔丁基对甲酚作为积极的控制。超氧化物阴离子生成的抑制百分比由下列公式计算: 的集成电路₅₀被定义为(浓度在吗g / mL)的提取所需消耗的量了50%。

2.6.4。羟基自由基(·哦)清除活动分析

清除的·哦,是由钟的方法等。21]。哦,激进分子被孵化生成以下试剂在最后一卷5.0毫升20M KH₂阿宝₄koh缓冲区(pH值7.4)在37°C为60分钟:0.15毫升H₂O₂(10毫米),0.15毫升Fe (NH₄)₂(所以₄)₂edta(10毫米)和0.15毫升脱氧核糖(10毫米),4.0毫升去离子水和0.1毫升提取解决方案。脱氧核糖退化引起的糖·哦,是由添加0.75毫升稍后通知(1% w / w)和0.75毫升柠檬酸(2.8% w / w)和加热15分钟的100°C。粉色的发色体形成是由测量其吸光度在536海里。氢氧自由基清除活动表示为:

的集成电路₅₀被定义为(浓度在吗g / mL)的提取所需消耗的量·哦,激进的50%。GA和二叔丁基对甲酚作为积极的控制。

2.6.5。过氧化氢自由基(H₂O₂)清除活动分析

过氧化氢清除活性指标和标准化验了赵的方法等。22]。H₂O₂(1.0毫升,0.1毫米)和1.0毫升的不同浓度提取喜忧参半,紧随其后的是100L 3%的钼酸铵,10毫升H₂所以₄(2米)和7.0毫升KI(1.8米)。混合解决方案与钠滴定₂年代₂O₃(5毫米),直到黄色消失了。扫气效果计算百分比 在哪里是Na的体积₂年代₂O₃解决方案用于滴定控制样品在过氧化氢的存在(没有提取),Na的体积吗₂年代₂O₃解决方案中使用的存在。的集成电路₅₀被定义为(浓度在吗g / mL)的提取需要消耗大量的H₂O₂激进的50%。GA和二叔丁基对甲酚作为积极的控制。

2.7。评价Hetapoprotective活动

2.7.1。原发性肝细胞隔离和文化

六大鼠随机分为两组,有或没有BCG治疗。从这些大鼠肝细胞分别孤立的原位两步胶原酶灌注技术(23,24]。孤立的肝细胞被血细胞计数器计数。细胞的生存能力是衡量台盼蓝排斥法(25]。细胞只在开始时使用的可行性实验的95%以上。

2.7.2。细胞毒性试验

细胞毒性试验是由比色MTT测定如Mosmann所述26]。肝细胞在DMEM培养,和100年L细胞悬浮液在96孔微量滴定板镀。16小时后37°C下5%的孵化有限公司₂允许细胞附着,细胞治疗与不同浓度的测试标本(5 - 200g / mL Grz和出版社)在DMEM (200左)和在相同条件下培养96小时。经过4个小时的MTT、中被删除,蓝色甲瓒晶体,形成于150年解散L二甲亚砜。甲瓒来自麻省理工的光学密度为490 nm使用ELISA板阅读器和50%抑制浓度(TC₅₀)在细胞被MTT分析计算。

2.7.3。BCG + LPS-Induced肝细胞损伤

根据krao等方法。24),肝细胞中孵化24-well板密度为2.5×10⁵细胞/条件下95% O₂有5%的公司₂16个小时后,镀介质取代新鲜dexamethasone-free介质,然后处理有限合伙人10 mg / L与卡介苗引起肝细胞进行预处理的损伤在活的有机体内。同时,Grz 5, 10年,20年g / mL 5出版社,80分别g / mL co-incubated有肝细胞。后3、6、12和24小时,上层清液收集测量生化指标。

第2.7.4。生化检测

生化参数,如活动的天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转移酶(ALT)的上层清液测定spectrophotometrically用贝克曼700自动分析器率模式。上层清液中一氧化氮(NO)的含量测定用亚硝酸钠标准曲线校准格里斯反应(27]。

2.8。统计分析

数据表示为的意思SD,使用SPSS 12.0版软件。方差分析是由方差分析和程序被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。总酚含量

对四个分数,最大数量的酚类化合物被发现在EA分数(指标)的值25.72.1克/ 100克总酚表示为高卢上市等效(GAE的GAE g / 100克)。酚类化合物的最低数量是衡量水渣,只表现为0.381 g / 100 g的GAE。

3.2。酚类化合物的指标

个隔离结构的阐明为没食子酸(1)、没食子酸甲酯(2),p-digalloyl酸和米-digalloyl酸(3)、槲皮素(4)、山柰酚(5)、槲皮素3 -甲基醚(6),tricin 7-methyl醚(7),黄芪甙(8)、槲皮素3 -甲基醚3′-O木糖甙(9)、槲皮素3′-O木糖甙(10)、异槲皮苷(11)、芸香苷(12)和kaempferol-3 -O-rutinoside (13),分别对光谱数据的解释(UV, IR, MS和NMR)以及报告数据的比较。

3.3。还原能力的指标

图1显示了减少剂量反应曲线的权力的摘录n .假丝酵母花。所有的提取物的浓度显示更高的活动比控制和这些差异具有统计学意义()。减少指标从0.077上升的力量0.006在201.42 g / mL0.029在500克/毫升。在500年用量g / mL,还原能力明显高于二叔丁基对甲酚(1.33±0.02),几乎等于GA (1.500.013g / mL)。各种提取物的还原能力和标准化合物后顺序:GA不错的二叔丁基对甲酚NCBNCA作战飞机。

3.4。DPPH自由基清除活性

DPPH实验是一个初步的测试对提取物的抗氧化潜力进行调查。图2显示了DPPH自由基清除活性的剂量反应曲线的提取n .假丝酵母。所有提取浓度的方式清除DPPH自由基的能力。最高的百分比DPPH自由基清除活动观察EA分数(指标),而其他的样品,包括乙醇提取,n丁醇分数和水渣,显示低清除活动。在一个浓度范围10 - 50g / mL,抑制百分比和集成电路₅₀指标分别为39%和12.60 -93%分别g / mL。二叔丁基对甲酚为参照药品回收DPPH自由基30 - 84%的禁忌和集成电路₅₀值为15.49克/毫升。GA (IC的清除能力₅₀,1.78g / mL)是比这两个前。这个结果表明,指标是一个相当好的对DPPH自由基清除剂。表213显示了DPPH自由基清除活性化合物与EA分数,和集成电路₅₀这些化合物被显示在表的价值2分别的化合物1- - - - - -7和11显示更高的活动比指标本身。

3.5。,·哦和H₂O₂自由基清除活性

指标显著和剂量依赖性扫气和它的集成电路₅₀值为59.32克/毫升。超氧化物自由基清除活性的指标是比二叔丁基对甲酚和弱比GA(表3)。还不错的回收·哦,自由基显著(表3)。的·哦,激进分子被Fenton-type生成反应和衡量的能力降低脱氧核糖的片段与硫代巴比土酸反应形成一个粉红色的发色体。在一个集中的50g / mL,可清除59.02%的出版社·哦,激进分子,集成电路₅₀为24.28克/毫升。不错的清除能力H₂O₂决心,一旦被发现剂量依赖性清除H₂O₂(集成电路₅₀86.45g / mL)(表3)。

3.6。保护作用的指标BCG + LPS-Induced肝细胞损伤

的细胞毒性,对新生儿Grz鼠原发性肝细胞进行了测试。结果表明,一旦5 - 200的浓度g / mL几乎无毒的细胞我值393.65克/毫升(表4)。

在对照组中,上层清液AST和ALT活动在24小时内没有明显的变化。然而,在BCG LPS结合治疗组,上层清液AST和ALT活动时间的方式提升(与最大值),12小时。上层清液AST和ALT活动诱发的增强BCG LPS处理都是由Grz预防和指标在不同时间,分别为()(表5和6)。在对照组,没有生产在24小时内被发现3mo1 / L。BCG LPS结合治疗组显示更高的生产没有(> 5mol / L),所达到的最高价值观在12 h。没有一代卡介苗引起LPS结合治疗是预防Grz在24小时内()。不错的治疗后,没有显示生成与Grz相似的结果,在所有的课程都显著降低()(表7)。

4所示。讨论

一旦被发现特别富含茶多酚和表现出较高的还原能力,和两个参数表示提取具有强力的抗氧化活性。不错的成分相似n stellata已经证明王亚南,等都有较高含量酚酸没食子酸和没食子酸甲酯(14,15]。本研究测试指标提供清除各种自由基的能力。自DPPH被抽象不稳定氢和清除DPPH自由基能力与脂质过氧化的抑制作用,它被用来屏幕各种化合物的抗氧化作用[28,29日]。一旦有说服力地回收DPPH自由基及其清除活动几乎是相当于二叔丁基对甲酚。此外,一旦表现出清除能力给超氧化物阴离子,羟基自由基和过氧化氢。一氧化氮是一种无机活性氮物种(RNS)在肝脏合成不同没有合酶(NOS)亚型,目前视为基本细胞间和细胞内信号分子,对维持体内平衡至关重要30.),作为一个cytoprotective中介或作为细胞凋亡的诱导物(31日,32]。在目前的研究中,没有不同的明显没有对照组在不同时间的作品,但这些在模型组显著增加。内容没有指标组明显低于模型组。ROS, RNS和他们的交互是高活性的产品能够调节各种细胞的结构和功能组件(33]。因此,指标,以其强大的自由基淬灭能力,将抑制氧化损伤生物分子。

孤立的肝细胞有能力保留许多基本属性的完整的组织,包括类似的渗透性特征。变得重要,因为这个实验模型的方法已经被证明是一个有价值的工具,用于此类研究[34]。王亚南活动指标的调查之前,主要确定培养大鼠肝细胞的细胞毒性。相应的TC₅₀的值,对肝细胞都Grz80年g / mL,因此研究样本视为non-cytotoxic细胞系。BCG激活,T淋巴细胞处于敏感状态,特别是敏化巨噬细胞细胞和枯否细胞。注射LPS后,巨噬细胞细胞进一步激活,并释放各种细胞因子使肝脏损伤,如没有,自由基和肿瘤坏死因子(35- - - - - -37]。因此,BCG + LPS可以引起敏感的免疫反应,这将导致肝细胞的泄漏。大量的ALT和AST释放到上清液是肝细胞的信号泄漏。主要培养大鼠肝细胞免疫损伤,ALT和AST水平指标组(20 - 80克/毫升剂量)明显低于模型组。一旦80剂量的影响g / mL相当与Grz 20克/毫升。指标可能降低ALT和AST的数量在上层清液通过抑制免疫反应和降低肝细胞的泄漏。因此,它可能会得出结论,一旦有保护活动免疫损伤在体外。

总之,我们目前的调查验证王亚南和抗氧化指标的影响在体外。活动彻底的清除可能保护的主要机制之一,一旦对BCG + LPS-induced主要培养大鼠肝细胞细胞毒性。这些证据的民俗的用途提供了一个科学的解释n .假丝酵母治疗肝炎,进一步的实验在活的有机体内将其有效机制进行了研究。

资金

这项工作是经济开放基金新疆维吾尔医学重点实验室研发(xjys0207 - 2005 - 01)。

承认

研究了根据国际、国家和机构规则考虑动物实验。