海参库维氏管黏附分泌物的分离及特性研究Holothuria forskali(棘皮类:海参类)

摘要

海参Holothuria forskali拥有一个称为Cuvierian小管的特殊系统。在机械刺激过程中，白色细丝（小管）被排出，并在与任何物体接触时变得粘稠。我们从来自中国的Cuvierian小管的蛋白质提取物中分离出一种具有粘附性的蛋白质H.Forskåli.这种蛋白质是通过位于贻贝贝体丝中的抗重组前胶原D的抗体鉴定出来的黄花贻贝．为了找出提取和纯化的最佳过程，通过几种方法分离所鉴定的蛋白质，包括电胶，与玻璃珠，免疫沉淀和凝胶过滤结合。用抗蛋白质升高的抗体用于Cuvierian小管中的粘合剂蛋白的定位。免疫染色和免疫电解电子显微镜研究揭示了间皮中最强的免疫反应性;该组织层参与粘合性。在各种材料的表面上测量uvierian小管提取物的粘附性。提取的蛋白显示于Teflon表面的最强粘附性。在钾和EDTA存在下观察到增加的粘附性，而镉导致粘附性降低。添加抗体和胰蛋白酶消除了提取物的粘合性能。

1.介绍

粘附在许多无脊椎动物中起着重要作用，具有多种不同的功能。一些种类的海参类棘皮动物（海参）具有一种涉及粘附的特殊防御系统，其基础是分泌能缠住捕食者的高度粘附的细丝。这种称为Cuvierian小管的系统主要在动物受到机械刺激时被激活，但也可能受到热刺激。因此，海参会释放白色细丝、小管，这些细丝、小管在受到刺激时变得粘稠与任何物体接触[1-5.]．

在寻找潜在的技术应用时，了解Cuvierian小管分泌的粘合剂的化学性质非常重要。应用可能包括设计防水粘合剂、密封剂和生物医学涂层，以及开发新的防污策略[6.那7.]．

Müller等人研究了库维叶小管丝惊人的黏附性[8.]，Zahn等人[9.]和flammang等人。[2]，即用各种物质处理小管，并测量其与不同表面的粘附力。然而，尚未对Cuvierian小管的蛋白质提取物的粘附特性进行研究。早在1868年，许多研究人员就研究了库维埃里管的组织化学（Semper）[10]，后跟Jourdan [11], Herouard [12]，以及后来的Müller等人[13])。

VandenSpiegel和Jangoux研究了Cuvierian小管的精细结构[14]．静止的库维叶小管由外间皮、内上皮和它们之间的厚结缔组织层组成，其中包括肌肉纤维。DeMoor等人的生化研究[5.]研究表明，库维管由60%的蛋白质和40%的碳水化合物组成，它们是高度不溶性的。

针对小管脱离后残留在基质上的物质产生的抗体已用于检测和定位小管蛋白[5.]．

此外，还对贻贝的粘附性进行了彻底的研究。分离出第一个粘附蛋白Mepf-1后，Mepf-1含有多巴（3,4-二羟基-l-苯丙氨酸），已分离出另外十种蛋白质[7.]．其中一种是前胶原蛋白D，它有一个中央胶原结构域，两侧有两个丝素样结构域，其序列与蜘蛛丝素相似。这种蛋白质存在于蜘蛛的拖丝中[15]还有蚕丝森博美[16]．在海胆中也发现了类似的蛋白质[17].使用从贻贝中提取的抗重组前胶原D的抗体黄花贻贝，我们在海参库维叶小管提取物中鉴定出一种具有粘附性的蛋白。

2.材料和方法

2．1．海参

海参Holothuria forskali在罗维尼（克罗地亚伊斯特里亚）附近的亚得里亚海海岸，用拉网在20米深的地方收集到 2007年8月，对标本麻醉1小时 h在饱和的氨基甲酸乙酯溶液（德国Taufkirchen的Sigma-Aldrich）中，然后在移除Cuvierian小管之前，在4°C下用甲醇运输至实验室。

2.2.Cuvierian小管的提取

库维氏小管通过冻干和在含液氮的砂浆中研磨。干燥材料(2g)与50ml缓冲液(4m尿素，0.5 M Tris-HCl, pH 7.5)在4°C下搅拌过夜。匀浆在14000 ×g离心15分钟。收集上清液，用2-μm过滤器(离心过滤器设备Microcon, Millipore, Schwalbach，德国)，透析过夜与5升蒸馏水，每3小时更换一次。为浓缩样品，透析液使用离心浓缩器(Amicon, Millipore, Schwalbach, Germany)在浓缩管(50 mL)中离心(4.000 ×g)，直到获得1 mL提取液。

２．３．SDS-PAGE和Western Blot分析

Cuverian小管提取物用Ready Prep 2d cleanup Kit (Bio-Rad, Munich, Germany)浓缩。浓缩蛋白溶解在加载缓冲液(Roti-Load, Roth, Karlsruhe, Germany)中，煮沸5分钟，然后在含有0.1%十二烷基硫酸钠的12%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳(SDS-PAGE)。蛋白分离后，用蒸馏水洗涤凝胶15分钟，然后用gel Code Blue Reagent (Pierce, Bonn, Germany)染色。

对于Western blot分析，使用Trans-Blot SD系统(Bio-Rad, Munich, Germany)将蛋白从凝胶转移到PVDF膜(Millipore, Schwalbach, Germany)。用阻断试剂(Roche, Mannheim, Germany)阻断细胞膜，然后用TBS-T (20 mM Tris-HCl pH 7.6, 137 mM NaCl, 0.1% Tween-20)冲洗，并与取自贻贝的D前胶原的多克隆抗体(兔)孵育1小时m . galloprovincialis(PoAb-pCD)。抗血清的稀释倍数为1:10 00。用TBS-T洗涤膜三次，然后用抗兔IgG(全分子)碱性磷酸酶(Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany)孵育1 h。洗涤后，用5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐对蛋白质进行可视化p-甲苯胺盐和p-氯化硝基四氮唑蓝（NBT）（德国卡尔斯鲁厄罗斯）。

2.4. 电洗脱分离黏附蛋白

从电泳凝胶中分离出与抗前胶原D抗体反应的蛋白带，并用422型电洗脱器(Bio-Rad，慕尼黑，德国)电洗脱。获得的蛋白通过SDS-PAGE和Western blot检测纯度，通过2d Quant试剂盒(Amersham Biosciences, Freiburg, Germany)测定浓度。

2.5.抗体产生

多克隆抗体(PoAb)针对通过免疫母兔(新西兰白兔)电洗脱获得的蛋白，如前所述[18].三次增强后，收集血清，并通过常规ELISA分析和Western印迹进行筛选。

2.6。粘附蛋白的收集

用4m尿素缓冲液(含0.5 M Tris-HCl, pH 7.5)清洗尺寸为2毫米的玻璃珠(1克)(德国Elring-Klinger Kunststofftechnik GmbH Grossostheim-Ringheim)，并将其加入到含有相同数量蛋白质(500μg)，但不同浓度的尿素(1 M, 2 M, 3 M)。装有玻璃微珠的试管在摇瓶中孵育2 h，每10 min旋转一次。然后丢弃上清液，用0.05 M Tris-HCl pH 7.5 (1 mL)摇动和漩涡洗涤小球。洗涤步骤重复了三次。然后取出缓冲液，50μL样品缓冲液(4倍浓缩;100 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 5% ß-巯基乙醇，15%甘油，0.006%溴酚蓝)。然后将玻璃珠在95°C的搅拌机中煮沸和摇匀15分钟。收集上清液40μL分别装入两种12% SDS PAGE凝胶上。其中一种凝胶用凝胶代码蓝色试剂染色，用水去污，然后用奥德赛扫描仪使用奥德赛v.1.2软件进行扫描，以量化蛋白质条带。将第二种凝胶的蛋白转移到PVDF膜上，与粘附蛋白抗体孵育，用抗兔IgG(全分子)碱性磷酸酶培养，用NBT和BCIP观察。

2.7。免疫沉淀反应

免疫沉淀粘附蛋白使用Seize × immunoprecipitation Kit (Pierce, Bonn, Germany);50μ抗Cuvierian小管粘附蛋白（PoAb Ctub）多克隆抗体L和250 μ取库维叶小管提取物L。结果经SDS - PAGE和Western blotting检测。

2.8.凝胶过滤

采用Sephadex G50 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)制备凝胶过滤柱(1 cm × 15 cm)。使用牛血清白蛋白(BSA)、丝素蛋白和碳酸酐酶的混合物进行色谱柱的校准。记录每个样品的保留时间。每个馏分中是否存在这种蛋白质都用布拉德福德试验法进行了检验[19]．

在装载提取液之前，用4m尿素缓冲液对柱进行洗涤。将1毫升库维氏小管的4 M尿素提取物装入柱中。蛋白用4m尿素洗脱。40 500 -μ收集L组分。使用Bradford分析法测定每个组分中的蛋白质浓度。将含蛋白质的组分加载到12%SDS-PAGE凝胶上。用凝胶编码蓝色试剂染色凝胶，用水脱色，并用Odyssey扫描仪扫描。

2.9.组织学

2.9.1。组织切片制备

将Cuvierian小管组织在PBS pH 7.4中固定在2％多聚甲醛中过夜。在4℃下含有6.8％蔗糖的PBS缓冲剂（pH7.4）洗涤过夜后，在100％丙酮中进行脱水。在前5分钟内，丙酮的重新更新了几次。丙酮的最后一部分留在一夜。根据制造商的说明，使用Technocit 8100（Heraeus Kulzer，Hanau）进行样品渗透。硬化后，3-10 μM厚切片采用旋转切片机。切片置于硅烷涂层切片(Sigma, Taufkirchen, Germany)上进行组织学和免疫组化。

2.9.2。苏木精和曙红染色

PBS和蒸馏水冲洗后，切片上的组织切片用苏木精溶液染色5分钟。染色后用自来水冲洗25分钟，蒸馏水冲洗5分钟。切片用伊红染色1分钟。在蒸馏水中洗涤后，用异丙醇浓度增加(75-100%)使各切片脱水1分钟。安装前，载玻片用Roti Clear洗涤剂清洗(罗斯，卡尔斯鲁埃，德国)。载玻片安装在DPX (Sigma, Taufkirchen, Germany)上，用盖玻片覆盖，并用指甲油密封。

2.9.3。Cason的三色的

切片在PBS中洗涤5分钟，然后放入染色液(1%橙G, 1.5%酸性品红，0.5%苯胺蓝，1%磷钨酸)中5分钟。染色后的切片在水中洗涤5分钟，在乙醇浓度增加的溶液中脱水，在洗涤剂(Roti Clear)中清除，用DPX固定，用指甲油密封。

2.9.4。亚甲基蓝色和蔚蓝b

使用1%天青和1%亚甲基蓝的混合物。在染色切片加热至70°C之前，在切片上滴一滴着色剂。干燥（60°C）后，用蒸馏水冲洗未结合的着色剂。然后干燥载玻片，用DPX固定，并用指甲油密封。

2.10.免疫组织化学

切片在PBS中的4%BSA中保存过夜。用PBS洗涤后，用抗Cuvierian小管粘附蛋白的多克隆抗体（PoAb Ctub；稀释1）孵育样品 : 带抗体的切片在室温潮湿的室内保存2小时 h、 在PBS（2×10）中洗涤后 将切片与Cy3结合的山羊抗兔IgG（Dianova，汉堡，德国）（稀释1 : 100）在37°C的黑暗中120 额外清洗后的最小值（2×10 在PBS中，用DAPI（4′-6-二氨基-2-苯基吲哚；德国Taufkirchen Sigma-Aldrich）染色30分钟 进行min以突出细胞核。用凝胶/支架（荧光安装介质，德国汉堡达科）清洗和安装后，使用Olympus AHBT3光学显微镜检查切片的免疫荧光。使用免疫前血清作为阴性对照。

2.11.透射电子显微镜

用0.1%戊二醛/3%多聚甲醛处理的Cuvierian小管样品在pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中进行电子免疫金标记，持续3小时 将材料在乙醇中脱水并包埋在LR白色树脂中。切片（60 nm厚）被切割并用PBS中的牛血清白蛋白封闭，然后与来自Cuvierian小管的抗粘附蛋白一级抗体（PoAb Ctub；1）孵育 : 12人1000英镑 在对照组中，使用免疫前血清。在用PBS、1%BSA洗涤三次后，切片用1 : 二级抗体稀释100倍（1.4-nm纳米金抗兔IgG；稀释1 : 200）两次 h、 切片在PBS中冲洗，在PBS中用戊二醛处理，洗涤并干燥。随后，如Danscher所述，用银增强免疫复合物检测[20.]．将样品转移到涂覆的铜网上并使用Tecnai 12显微镜（Fei电子光学，埃因特湾，荷兰）分析。

2.12。测量的附着力

要测量附着力，仪器如图所示1是使用。这台仪器是基于实验室的天平，通过添加两个块(由特氟隆、铁、明胶、玻璃或硅树脂制成)进行改进。上面的块连接在天平的一根横梁上，而下面的块连接在一个可移动的平台上。粘附性的测量方法如下:一滴测量液(10μL)被放在木块上，并粘在悬挂在横梁上的第二个木块上。在此位置，测量液滴在室温下孵育15分钟。为了确定液体的粘附性，添加标准质量，直到两个块分离时，液体的粘附性失败。为了释放块状和液体而施加的重量等于它们之间的粘附力。

2.13。统计数据

如前所述，对数据进行统计评估[21]．

3.结果

3.1.Cuvierian小管的提取

几种缓冲液被用于从库维氏小管中提取蛋白质。蛋白质的增溶在碱性缓冲液中比在酸性缓冲液中得到改善。尿素、SDS和还原缓冲液增加了小管粘附蛋白的提取。通过SDS - PAGE分析比较不同缓冲液提取的蛋白量。使用4m尿素，0.5 M Tris-HCl pH 7.5时获得了最好的结果(图)2样品上样缓冲液(100mm Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 5% ß-巯基乙醇，15%甘油，0.006%溴酚蓝;结果未显示)。为了提高蛋白质的可视性，用Ready Prep 2-D cleanup试剂盒对A巷显示的提取物进行纯化。其他缓冲液如150mm NaCl, 1.5% NP₄₀， 0.1% SDS, 0.1% DOC, 50 mM Tris-HCl pH 8缓冲液或0.5 M NaCl, 5 mM Tris-HCl pH 7.5, 7 mM Na₂所以_4.0.4毫米NaHCO_3.20mm EDTA缓冲液溶解的蛋白质较少(未显示)。4 M尿素缓冲液用于进一步分析，因为样品加载缓冲液的组成(见上文)可能会干扰进一步的测试。

纯化的Cuvierian小管提取物的SDS-PAGE分析显示存在大范围的蛋白质（图1）2在此阶段，无法识别哪些蛋白质可能参与粘附。为了获得有关蛋白质构象和可能的二聚化/低聚化的信息，提取液在精液凝胶上运行（图1）2这种方法产生的蛋白质条带数量较少，这表明一些蛋白质可能以二聚体/低聚体的形式存在。

３．２．Cuvierian小管中粘附蛋白的鉴定

一种抗体(PoAb-pCD;抗贻贝足丝蛋白(重组前胶原D)的多克隆抗体编号N374m . galloprovincialis)用于鉴定库维氏小管的粘附蛋白。D前胶原蛋白是一种特殊的胶原蛋白，存在于足底丝线中，参与张力承载。与抗体反应后，膜显示出强条带(图)2(列B)与大小为18 kDa的库维氏小管蛋白之一。在进一步的实验中，该蛋白被确认为与粘附有关的蛋白。

3.3. 鉴定蛋白的分离

3.3.1。电洗脱

鉴定粘合剂蛋白质后的下一步是其分离。分子量为18kDa的带从凝胶中切出并电动。洗脱蛋白质的纯度通过SDS页面和Western印迹分析测定（图2将分离的蛋白注射到兔子体内，4周后，获得指定为PoAb Ctub的特异性抗体。

3.3.2.抗体中和

使用poab - ctb抗体对Cuvierian小管粗提取物进行Western blot分析，发现即使在优化的抗体和提取物浓度存在的情况下(未显示)，该提取物的几个蛋白也会发生强烈的反应。

通过与Cuvierian小管提取物孵育1-2小时来中和抗体。结合后，将所得混合物施加到Western印迹的膜上。如果混合物含有过量的特异性抗体，它们将结合到膜上的抗原。

在稀释至1:10 00和以1:5的比例加入提取物后，观察到抗体特异性的最大增加(图)2，车道e）。Western印迹显示出两种与抗体反应的蛋白质，其中分子量为18kDa，另外36kDa。与预热血清孵育的铜管萃取液均不孵育粘合剂蛋白质不产生反应（图2，D巷）。我们假设E区的上层蛋白带可能代表下层蛋白带的二聚体。为了验证这一点，运行了天然凝胶（图2转移蛋白质后，将膜与针对粘附蛋白质的抗体一起孵育。结果显示，仅存在一条带，最有可能是由粘附蛋白质的二聚体形成引起的（图2,莱茵克)。

3.3.3.免疫沉淀

由于电洗脱获得的粘附蛋白量低，且用于洗脱的缓冲液会使进一步分析复杂化，因此采用其他方法分离蛋白。免疫沉淀是基于蛋白与其特异性抗体的相互作用，将形成的免疫复合物与蛋白a分离，然后进行Western blot分析(图)3.,莱茵(a))。

在平行实验中，从贻贝中提取m . galloprovincialis应用于具有抗Cuvierian小管粘附蛋白抗体的免疫柱上。结果显示在20 kDa处有一个弱带(图)3.莱恩(b))。

3.3.4.凝胶过滤

根据蛋白大小采用凝胶过滤色谱(Sephadex G-50)进行分离。用Bradford测定法检测蛋白质的存在。用SDS - PAGE分析含蛋白组分，并测定粘附力。

在分数6到8中观察到粘附蛋白的存在(图4.）.附着力最强的是分数7(图)4（b）)，黏附蛋白浓度最高(图4（a）).馏分7和8含有较高程度的高分子量蛋白质污染。使用以下方程式测定相对分子量：（，分子质量；、膨胀凝胶的密度;洗脱体积；，空隙体积）[22]．为实验中使用的列，如图所示4.，方程式如下：（另见[23])。

3.3.5。粘附蛋白的收集

粘附蛋白可以粘附在各种表面上。在本实验中，采用与玻璃表面粘附的方法来分离H.Forskåli.粗提物中的蛋白质。玻璃珠与含有粘附蛋白的蛋白提取物一起孵育。去除提取物并用非变性缓冲液孵育玻璃珠后，粘附蛋白仍结合在玻璃珠上。为了去除玻璃表面的蛋白质，用电泳样品缓冲液煮沸珠子，并加载到12%SDS-PAGE上。使用Odyssey软件估计与粘附蛋白对应的相对条带强度。将蛋白转移到PVDV膜上，并使用抗Cuvierian小管粘附蛋白的抗体进行Western印迹分析。Western blot证实18kDa蛋白是通过玻璃珠法获得的主要蛋白（未显示）。在存在不同浓度尿素的情况下测试粘附力后的结果表明，提取物中尿素浓度的降低导致蛋白质粘附力的增加（图1）5.）.

3．4．组织学

用卡森三色、苏木精、伊红、亚甲基蓝和天蓝色对库维叶小管进行染色，以研究其结构。用这些染料染色显示H.Forskåli.由外间皮和内上皮组成，内上皮包裹着厚的结缔组织层。间皮由两层细胞组成，上层是腔内细胞，下层是颗粒细胞。

3.4.1。Cason的三色的

染色可见各种细胞器，如细胞核(红色)和胶原蛋白(蓝色)。库维叶小管切片中，间皮染色为红色，内部结缔组织染色为蓝色(图)6（a）和6 (b)）.

3.4.2。苏木精和伊红

苏木精将细胞核染成蓝紫色。伊红可用来染色细胞质、胶原蛋白和肌肉纤维。在苏木精和伊红染色的切片中，可以看到内部结缔组织层呈红色(伊红)，而间皮颗粒细胞呈紫色(图)6 (c)和6（d））.

3.4.3。亚甲基蓝色和蔚蓝b

亚甲基蓝用于显示细胞内的异染色质颗粒。Azure是一种甲基化噻嗪染料，是一种从绿色（染色体）、蓝色（细胞核和细胞质核糖体）到红色（含有粘多糖的沉积物）不等的异染色质碱性染料。

亚甲基蓝和天蓝色B染色显示间皮为蓝色，内部结缔组织为红色，颗粒细胞染色为暗色(图)6（e）和6（f））.

3．5．疣状

粘着蛋白在大鼠肾小管中的定位H.Forskåli.通过免疫荧光显微镜进行了研究。小管壁由外部培素和内上皮组成，包括厚的连接组织护套[5.]。间皮是参与粘附的组织层。使用针对粘附蛋白的抗体在切片中定位该蛋白。在间皮中发现最强的免疫反应性，其被广泛标记（图1）7(一)).切片用DAPI复染（图7（b）和7（d）)可以染色细胞核。免疫前血清作为阴性对照(图)7（c））.

3.6。Immunogold电子显微镜

透射电镜显示在间皮层和液泡细胞中有很强的免疫反应性(图中箭头较暗的区域)8（a））.免疫前血清未显示任何免疫反应(图8 (b)）.

3.7.Cuvierian小管提取物与各种表面的粘附

3.7.1.特氟隆

用4 M尿素，0.5 M Tris HCl pH 7.5。在将提取物稀释至不同尿素浓度后测量粘附力。作为参考，使用具有相同尿素浓度的缓冲液。在将提取物稀释至0.5时，可获得对聚四氟乙烯块的最强粘附力 M尿素（767个任意单位，减去单独使用缓冲液测得的附着力[控制值]；0.125 毫克/毫升蛋白质（图9.）.尿素浓度的升高或降低均可降低粘附力。

在对照实验中，BSA（1 在各种尿素溶液中观察到（mg/mL）。

用0.5 M尿素提取物的对数稀释得到标准曲线(观察到最高粘附力的尿素浓度)。稀释蛋白导致粘连下降(图)10）.

3.7.2.玻璃表面

Cuvierian小管提取物在4 M尿素、0.5 M Tris-HCl pH 7.5缓冲液中稀释至不同浓度，测定其对玻璃块的粘附性。Cuvierian小管提取物在1 M尿素浓度(366任意单位，减去控制值;0.25毫克/毫升蛋白质)。

3.7.3。铁表面

将Cuvierian小管提取物稀释至不同浓度的尿素，并使用两个铁块测量粘附力。在几乎所有尿素浓度下都观察到萃取缓冲液的强烈干扰。观察到1.5%的粘附力最强 M尿素提取物（350个任意单位，减去控制值后；0.25 mg/mL蛋白质）。

3.7.4。硅胶表面

使用两个硅氧烷块测量各种浓度的uvierian小管提取物的粘附。以1M和0.5M尿素的浓度（316和250个任意单位，减法在减去对照值后，观察到最强的粘附; 0.25mg / ml和0.125mg / ml蛋白）。

3.7.5.明胶表面

使用涂有明胶的试块测量各种浓度的Cuvierian小管提取物的粘附力。测量受到缓冲液的干扰，缓冲液也显示出较强的粘附力。用2 M尿素提取物（400个任意单位，减去控制值后；0.5 mg/mL蛋白质）。

3.8.金属离子和EDTA对附着力的影响

在K存在下测量了Cuvierian小管提取物的粘附力⁺(100 毫米和50毫米 嗯），约^2＋（5毫米），Zn^2＋(5毫米),Cd^2＋(5 以及乙二胺四乙酸(10) 结果显示钾和EDTA对粘附有积极影响，镉对粘附有消极影响（图11).锌没有引起粘附力的显著变化。

3.9.抗体的作用

可通过添加抗体(poab - ctb)来中和粘附。在没有抗体的情况下，与未处理的提取物相比，中和提取物的粘附性降低(图)12）.结果表明该抗体与粘合剂蛋白结合并抑制粘合性。

用胰蛋白酶溶液处理Cuvierian小管提取物也可以消除粘附（未显示）。

4.讨论和结论

研究海洋胶粘剂是一项具有挑战性的任务，因为它们在水中的溶解度非常差[5.那24].迄今为止，对无脊椎动物粘附蛋白的研究主要涉及贻贝和藤壶等生物的永久性粘附物的特性（例如[25那26])在贻贝方面取得了巨大的成功，目前已知有10种蛋白质参与粘附，9种已经被分离出来[7.那27]．已经开始着手对其进行生物技术和生物医学开发[28-31].在已确定参与贻贝粘附的十种蛋白质中，有一种是前胶原D，发现于贻贝的远侧线中，其两侧有丝素结构域[32]．相比之下，对棘皮动物使用的粘合剂知之甚少。对库维氏小管黏着分泌的研究主要集中在组织学特征(例如，[14]);Flammang等人进行了生化研究[2]和DeMoor等人[5.]．

在我们的方法中，我们结合了贻贝黏合剂的广泛知识和知之甚少的模型h . forskali。利用针对重组前胶原D的抗体，我们可以识别出一种参与细胞粘附的蛋白h . forskali。

第一个任务是均质化高度不溶的库维氏小管[5.]．为了溶解材料，使用几种缓冲液。基本的，强烈的变性缓冲剂，如4米尿素，0.5米的Tris-HCl pH 7.5得到了最佳结果，但一些非溶解的材料仍然保持依赖。我们没有使用包含Demoor等人的SDS的缓冲区。[5.]因为SDS可能会干扰进一步的实验。

提取后，我们必须证明可溶性材料中存在粘合蛋白质。确认存在粘合蛋白质的一个证据是使用玻璃珠分离粘合蛋白质。经过几次洗涤循环后，只有具有粘合特性的蛋白质才会留在珠上。第二，提取液的粘合测量从这些实验中我们获得了令人信服的证据，证明我们鉴定的蛋白质确实是一种粘附蛋白。

为什么居维叶小管是如此难溶的原因，在这项研究中没有调查。蛋白质的聚集可能是由于组成粘合剂的蛋白质之间形成交联[5.就像贻贝中的二多巴[33那34]藤壶中的二硫键[26那35]然而，通过使用Kamino等人建议的缓冲区[26]对于藤壶来说，增溶作用并没有得到改善，这可能表明其他交联物参与了小管粘附聚集。

Demor等人对来自Cuvierian小管的小管打印材料进行电泳分析[5.]在17-220 kda的范围内揭示了十种不同的蛋白质。在我们的实验中，在Cuvierian小管提取物中检测到10-220kDa范围内的几种蛋白质。在演奏凝胶中，观察到减少的带状带，表明存在一些蛋白质的构象低聚物或二聚体的存在。

在鉴定之后，分离蛋白质是一项具有挑战性的任务。到目前为止，还没有从海参中分离到粘附蛋白质。在这项工作中，测试了几种以前用于分离非粘附蛋白质的方法[23那36那37以获得高质量和高数量的粘附蛋白。人们发现电洗脱法可以产生最高数量的蛋白质，这使得它可以用于生产抗体。

获得的抗体用于进一步的分离方法，免疫沉淀。从所有分离方法中，电洗脱和凝胶过滤被发现最适用于其他应用。

采用不同的染色方法，分析了Cuvierian小管的组成。从卡森三色染色的切片可以得出结论，Cuvierian小管主要含有胶原。在间皮中，观察到腺管腔细胞的细胞质。通过苏木精和伊红染色，可以观察到胶原被染成红色（曙红）。用来自Cuvierian小管的粘附蛋白抗体对Cuvierian小管切片进行免疫染色，证实间皮是负责粘附的组织层，如Demor等人所报告[5.]．

为了使Cuvierian小管中更精确地定位粘合剂蛋白，进行免疫形状标记和透射电子显微镜研究。抗血清在间皮和液泡中强烈免疫反应，确认先前的研究表明粘合剂位于该层中。血清中没有标记，证实观察到的免疫反应在特定抗体和抗原之间真正。

Cuvierian小管黏附性的测量以前曾在各种条件下进行过研究[8.那9.那38]，但尚未对Cuvierian小管提取物和分离蛋白的粘附强度进行测量。一种能够在水下和低温下粘附在不同表面的蛋白质在技术和防污方面具有巨大的应用潜力。因此，对分离蛋白的粘附性能进行各种测试/进行提取。

Dalsin等人[39和Lee等人[40]发现贻贝可以粘附在任何有机或无机表面H.Forskåli.并非所有表面都适合粘合。使用聚四氟乙烯[聚四氟乙烯]可获得最佳效果，一种疏水性聚合物。提取缓冲液的粘附力很低，提取物的粘附力很强。通过测量各种稀释的Cuvierian小管提取物的粘附力，可以找到粘附蛋白粘附力最高的尿素浓度，并为提取物绘制标准曲线。最高粘附力在0.5%的条件下获得sion M尿素提取物；该结果与我们之前的结果一致[8.表明尿素对附着力有影响。

特氟隆表现出强粘附性的发现被认为是由于粘附蛋白具有很强的疏水性（因此其不溶性），并将倾向于从特氟隆中置换水，从而产生一种力（来自水分子）这将阻止水被拉入两个特氟隆块之间的空间，从而产生一个“键”，从而水移动到其可能的最低能量状态。

在硅氧烷表面上的粘合性的测量得到了与Teflon相似的结果，但是可以观察到缓冲液存在下的粘合。硅胶表面比Teflon表面变得粗糙，可能仅导致表面之间的更高的键合能量，而仅与Teflon仅用于提取物和缓冲液。

其他测试的表面(玻璃、铁和明胶)仅在缓冲液存在时显示出很强的粘附性，这使得它们不能被用作测量Cuvierian小管提取物介导的粘附性的合适表面。

通过比较特氟隆和玻璃，可以得出以下结论：附着力取决于表面。如果表面是疏水性的（特氟隆），附着力很强，并且没有缓冲液的干扰；当表面是亲水性的（玻璃）[41观察到缓冲液与表面的相互作用。

阳离子和EDTA对结合力的影响研究表明，镉抑制结合力，EDTA和钾增加结合力。镉抑制二硫键的形成，可能导致蛋白质失去其结构和粘附特性[42]．EDTA是一种螯合剂，广泛应用于二价和三价金属离子的螯合;它有可能螯合一些与粘附有关的阳离子。钾影响氨基酸在电解质水溶液中的溶解度[43]这可以使粘附蛋白更好地溶解并增加其粘附性能，或者使蛋白质折叠和负责粘附的基团更适合粘附。离子强度也可能参与增加粘附。

Cuvierian小管提取物的粘附特性可以通过添加针对粘附蛋白的抗体来中和，这很可能是因为抗体与参与粘附的蛋白质分子上的表位结合，或者通过空间干扰蛋白质与表面之间的粘附。中和通过胰蛋白酶或抗体对粘附蛋白的研究有助于设计防污化合物。关于阻断粘附的知识有助于理解粘附过程及其抑制作用（如有必要）。

粘附蛋白的分离将有助于鉴定编码该分子的基因，并可用于生产重组蛋白。本研究有助于开发新的抗水粘附蛋白用于生物技术和生物医学应用。

致谢

这项工作得到了欧盟委员会（玛丽·居里研究培训网络BIOCAPITAL and project BIO-LITHO）和德国弗松联邦研究院（Bundesministerium für Bildung und Forschung）的资助（项目：卓越中心BIOTECmarin）。

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