文摘
西洋参的结合增强效应(<我>人参quinquefolius我>)、甘草(<我>乌拉尔甘草我>)根提取物对肝癌细胞系(Hep-G2)。isobolographic分析是用来表达协同的可能性,添加剂或对立的两者之间的交互提取。人参和甘草的根都是广泛应用于中药制剂来治疗各种疾病。然而,草药的效果在培养Hep-G2细胞结合目前未知。人参(GE)和甘草(LE)提取物均能降低细胞生存能力。LC50值,72 h后,被发现是0.64±0.02毫克/毫升(GE)和0.53±0.02毫克/毫升(LE)。isobologram是策划,其中包括五个理论lc50计算,基于固定的分数组合人参甘草提取物的方法建立的可加性。所有组合的通用电气勒(1/5,1/3、1/2 2/3,4/5)产生影响Hep-G2细胞生存能力,但他们都发现是敌对的。分数的LC50 1/3、1/2, 2/3是23%、21%和18%以上理论毒杀。乳酸脱氢酶释放表示,通用电气的比例增加超过50%,影响膜透性增加。 Cell-cycle analysis showed a slight but significant arrest at the G1 phase of cell cycle for LE. Both GE and LE reduced Hep-G2 viability independently; however, the combinations of both extracts were found to have an antagonistic effect on cell viability and increased cultured Hep-G2 survival.
1。介绍
西洋参(<我>人参quinquefolius我>)和亚洲甘草(<我>乌拉尔甘草我>)根历史悠久中国传统医学(中医)的使用。这些根通常与其他草药成分结合使用的目的,提高中药制剂的有效性。人参、甘草根可能是最利用中药成分(<一个href="#B1">1一个>),现在两根也利用营养食品和功能性食品行业的所谓的生物活性和功能性质<一个href="#B2">2一个>- - - - - -<一个href="#B4">4一个>]。
人参中的主要生物活性成分被认为是一群达玛烷三萜皂苷、人参皂苷,也被称为(<一个href="#B5">5一个>),一个主要的甘草中有效成分甘草酸,它是一个齐墩果烷三萜烯皂素。两根还含有多种其他植物化学的物质如多糖和多酚(<一个href="#B4">4一个>, 甘草根提取物和甘草酸已报告有细胞毒性和hepato-protective属性。据报道,从甘草中提取甘草酸防止黄曲霉毒素B<年代ub>1年代ub>Hep-G2细胞损伤(<一个href="#B7">7一个>)和自由脂肪酸减少段肝lipotoxicity Hep-G2细胞培养和high-fat-diet-induced lipotoxicity在老鼠<一个href="#B8">8一个>]。此外,甘草和甘草酸的保护主要肝细胞对咪唑硫嘌呤(1<年代vgheight="9.6750002" id="M1" style="vertical-align:-2.29482pt;width:9.6374998px;" version="1.1" viewbox="0 0 9.6374998 9.6750002" width="9.6374998" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
人参根皂苷含量与广泛的相关生物活性如抗糖尿病(<一个href="#B13">13一个>, 本研究的目的是确定西洋参的组合(<我>人参quinquefolius我>)和甘草提取物(<我>乌拉尔甘草我>实现协同)或反对地影响肝癌细胞株培养的可行性(Hep-G2)。isobolographic分析是利用有效地描述协同,敌对和添加剂反应Hep-G2细胞。Isobolographic分析提供了一个清晰的图形视图的两个组件之间的交互,用来描述两种药物组合之间的相互作用(<一个href="#B19">19一个>]。
干人参(<我>人参quinquefolius我>)、甘草(<我>乌拉尔甘草我>)的根在当地采购(新加坡)。人参皂苷高效液相色谱标准(Rg1、再保险、Rb1 Rc, Rd)买来Chromadex Inc .(美国加利福尼亚州圣安娜)和甘草酸标准从σ(Steinheim、德国),购买三氟乙酸(组织)是来自默克公司(美国新泽西州怀特豪斯站)。乙腈和甲醇的高效液相色谱级(Tedia Inc .)、费尔菲尔德,美国),乙醇为分析纯(费舍尔科学、英国)。
干人参根(<我>人参quinquefolius我>)是磨成粉,在甲醇回流(500毫升)3 h,过滤两次(绘画纸没有4)和提取重复了三次。解决方案集中在真空下,预先处理,提取应用于高分子吸水安伯来特XAD-4(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)列(40孔隙直径、床60厘米的体积<年代up>3年代up>10毫升/分钟的流量),用蒸馏水洗净(1升)删除极性化合物如前所述[<一个href="#B20">20.一个>]。皂苷含量从列筛选了使用绝对乙醇(500毫升)和集中在真空下,冻干,这里被称为人参提取物(GE)。
粉干甘草(<我>乌拉尔甘草我>)的根长为2.5 h甲醇回流(70%,400毫升),两次过滤,提取三次,集中在真空和在此被称为甘草萃取(LE)。
水高效液相色谱(米尔福德,妈,美国)装有四元梯度泵和一个二极管阵列(PDA)探测器是用来评估的皂苷含量或各自提取甘草酸。使用反相高效液相色谱分析进行了C18柱(C18, 4.6×250毫米,5<年代vgheight="9.6750002" id="M2" style="vertical-align:-2.29482pt;width:9.6374998px;" version="1.1" viewbox="0 0 9.6374998 9.6750002" width="9.6374998" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
高效液相色谱法分离梯度LE和GA利用0.5%组织水(A)和乙腈(B),如下:时间0 B(20%), 5分钟B(40%), 10 - 20分钟(50% B),流量是恒定在0.8毫升/分钟。再保险,人参皂苷Rg1 Rb1、Rc、Rd在通用电气和GA勒根据各自的标准曲线,并评估了一式三份。
人类肝癌(Hep-G2)细胞从美国购买类型文化集合(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。这些细胞被维护在杜尔贝科修改鹰的媒介(DMEM)补充10%胎牛血清(σ),100 U青霉素,和100年<年代vgheight="9.6750002" id="M5" style="vertical-align:-2.29482pt;width:9.6374998px;" version="1.1" viewbox="0 0 9.6374998 9.6750002" width="9.6374998" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
细胞生存能力是衡量3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl溴化四唑,MTT(σ)试验,为了建立一个LC50值(浓度抑制细胞的50%)。细胞被播种在1×10的浓度<年代up>5年代up>细胞/在96 - microwell板和被允许坚持24 h。股票的解决方案的通用电气和勒(1.0毫克/毫升)溶解和过滤无菌0.2<年代vgheight="9.6750002" id="M6" style="vertical-align:-2.29482pt;width:9.6374998px;" version="1.1" viewbox="0 0 9.6374998 9.6750002" width="9.6374998" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
通用电气和勒之间的交互进行了分析使用一个isobologram和显著性检验的方法Tallarida (2000) (<一个href="#B22">22一个>]。上面描述的人参和甘草提取物的LC50值被用来绘制isobologram。通用电气的LC50值绘制的<我>x Hep-G2细胞浓度的5×10被播种<年代up>5年代up>细胞/毫升24-well盘子和允许坚持24 h。中被删除和提取(人参、甘草或五个分数)在各自的LC50浓度添加到井中。使用的浓度为0.64毫克/毫升(GE), 0.53毫克/毫升(LE), 0.64毫克/毫升(f1/5), 0.70毫克/毫升(f1/3), 0.74毫克/毫升(f1/2), 0.74毫克/毫升(f2/3)和0.69毫克/毫升(f4/5)。细胞培养24、48和72 h,和未经处理的细胞作为控制。在每个孵化时间,介质被和检测LDH活性如前所述<一个href="#B5">5一个>]。
通用电气、勒和五个分数(1/5,1/3、1/2 2/3,4/5)被添加在各自LC50 Hep-G2细胞浓度。细胞培养24、48和72 h与未经处理的细胞作为控制。细胞循环分析确定如前所述[<一个href="#B21">21一个>]。短暂,细胞使胰蛋白酶化,用PBS和细胞颗粒固定在冰冷的70%乙醇在一夜之间在4°C。上层清液被离心,1包含50毫升的PBS<年代vgheight="9.6750002" id="M9" style="vertical-align:-2.29482pt;width:9.6374998px;" version="1.1" viewbox="0 0 9.6374998 9.6750002" width="9.6374998" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
通用电气的LC50值,LE和五个分数决定从五个不同的五个复制实验为每个实验。LDH和细胞循环分析和三个复制重复三次。数据表示为平均值±标准偏差(SD)。单向方差分析与图基事后比较意味着被用来测试的意义(<年代vgheight="11.25" id="M10" style="vertical-align:-0.30096pt;width:48.337502px;" version="1.1" viewbox="0 0 48.337502 11.25" width="48.337502" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
确定理论LC50 (CAL50)我>年代pan> 在每个分数测定浓度的个体提取我>年代pan>2。方法
2.1。植物材料
2.2。高效液相色谱分析
2.3。细胞培养
2.4。细胞MTT分析可行性
2.5。Isobologram分析
2.6。细胞LDH活性
2.7。细胞循环分析
2.8。统计和数据分析
通用电气和LE变量代表的LC50实验确定值人参和甘草提取物,和变量<我>f
变量<我>f
添加剂、协同作用和对抗我>年代pan>
变量EXPLC50分数和变量的实验派生LC50 CAL50上面描述。测试的意义和上面的方程是基于文献报道[<一个href="#B22">22一个>,
3所示。结果
3.1。高效液相色谱分析
个人人参皂苷分析表明,通用电气的皂苷含量的百分比确定为(20.2±7.8),Rb1 (8.8±0.2), Rg1(1.5±0.04)和Rd(0.71±0.01),和总皂苷含量的内容确定为30.9±7.8%(干重)。人参皂苷Rc检测但低于检测极限。对勒,甘草酸的总比例是确定为7.1±0.2%(干重)。
3.2。剂量反应LC50测定人参和甘草提取物
图<一个href="//www.newsama.com/journals/ecam/2011/408273/fig1/" target="_blank">1一个>显示了通用电气和勒的剂量反应关系。LC50计算通过绘制细胞生存能力(%)和日志集中(图中没有显示),产生一个线性方程<我>y=−164。32
3.3。剂量反应LC50确定分数
五分数对应的LC50值比人参的甘草提取物的1/5,1/3、1/2,2/3和4/5和图所示<一个href="//www.newsama.com/journals/ecam/2011/408273/fig2/" target="_blank">2(一个)一个>- - - - - -<一个href="//www.newsama.com/journals/ecam/2011/408273/fig2/" target="_blank">2 (e)一个>)和计算如上所述。通用电气的LC50相比,分数(1/3、1/2 2/3,4/5)都显著(<年代vgheight="11.25" id="M15" style="vertical-align:-0.30096pt;width:48.337502px;" version="1.1" viewbox="0 0 48.337502 11.25" width="48.337502" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
(一)年代trong>
(b)年代trong>
(c)年代trong>
(d)年代trong>
(e)年代trong>
(f)年代trong>
3.4。Isobolographic分析
图<一个href="//www.newsama.com/journals/ecam/2011/408273/fig3/" target="_blank">3一个>代表的图形视图的影响通用电气和LE Hep-G2细胞生存能力的组合。创建一个isobologram使用通用电气的LC50值,这相交<我>x勒的毒杀设在价值,相交<我>y设在。这两个点是连接在一起形成的可加性。这行相加性指的是通用电气和LE提取需要的浓度产生同样的效果,如果他们单独行动。点躺在上面的线称为添加剂,这条线是敌对的,线下是协同(<一个href="#B22">22一个>, 代表DNA直方图的各种治疗方法如图所示<一个href="//www.newsama.com/journals/ecam/2011/408273/fig4/" target="_blank">4一个>和相应的分析是列在表中<一个href="//www.newsama.com/journals/ecam/2011/408273/tab2/" target="_blank">2一个>。通常不被观察凋亡细胞G1(子)在细胞循环分析。大部分的分数测试没有任何明显的凋亡细胞的增加在24小时的治疗比未经处理的控制。通用电气显著(<年代vgheight="11.25" id="M19" style="vertical-align:-0.30096pt;width:48.337502px;" version="1.1" viewbox="0 0 48.337502 11.25" width="48.337502" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
不同治疗方法的效果和曝光时间LDH释放,膜的完整性和损伤的一个标志,如图<一个href="//www.newsama.com/journals/ecam/2011/408273/fig5/" target="_blank">5一个>。勒治疗从24到72小时没有明显影响细胞LDH的释放与相应的控制。通用电气治疗LDH释放最大的显著增加,而分数,至少包含一个比例的一半通用电气(如f1/2, f2/3, f4/5)显著(<年代vgheight="11.25" id="M23" style="vertical-align:-0.30096pt;width:48.337502px;" version="1.1" viewbox="0 0 48.337502 11.25" width="48.337502" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
有效利用isobolographic分析,我们表明,人参的组合(<我>人参quinquefolius我>)、甘草(<我>乌拉尔甘草我>)提取不产生协同效应在减少Hep-G2细胞生存能力。相反,效果是敌对的。分数1/2和2/3被发现LC50值最高(0.75±0.02,0.74±0.02毫克/毫升,职责),相比其他分数和分数1/3和1/2比例最大的差异相比,理论或计算LC50 (CAL50)。亚当斯et al。<一个href="#B19">19一个>)也报道对抗与组合<我>g。解我>用<我>测得我>或<我>年代cuteellaria baicalensis我>在等量(1:1分数)在前列腺癌细胞培养。<我>乌拉尔甘草,r .得我>和<我>美国baicalensis我>也发现在中医处方<一个href="#B24">24一个>和PC-SPES配方<一个href="#B12">12一个>]。<我>测得我>和<我>美国baicalensis我>已报告,减少培养癌细胞生存能力的细胞系(Hep-G2, MCF-7 MCF-10A) [<一个href="#B25">25一个>, 在这项研究中,人参提取增加了LC50 LDH的释放浓度随时间显著(<年代vgheight="11.25" id="M25" style="vertical-align:-0.30096pt;width:48.337502px;" version="1.1" viewbox="0 0 48.337502 11.25" width="48.337502" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
一个可能的解释这些敌对对细胞活力的影响是人参和甘草提取物的活性化合物可能争夺相同的细胞受体。人参提取物,人参皂苷再保险是最丰富的皂素干重20.2%,紧随其后的是人参皂苷Rb1 (8.8%)、Rg1(1.5%)和Rd (0.7%)。皂苷含量,如Rg1 protopanaxatriol达玛烷型皂苷,包括结构相关的人参皂苷再保险,据报道是糖皮质激素受体的功能配体(<一个href="#B29">29日一个>)和oleanane-type皂苷类似甘草酸提取已确定为7.1%地塞米松相比,合成糖皮质激素在细胞培养实验中(<一个href="#B30">30.一个>]。丰富的活性化合物会浸透受体网站会导致低于预期比预测的细胞反应。
此外,甘草在特定条件下可以表现出hepato-protection。例如,甘草甜素、结构与甘草酸报道减轻腹腔诱导CCl由四氯化碳肝损伤<年代ub>4年代ub>)在小鼠炎性标记物的监管(<一个href="#B31">31日一个>]。预处理的培养肝细胞保护甘草和甘草酸对咪唑硫嘌呤损伤通过增加细胞内谷胱甘肽的水平。中村等人报道,甘草甜素导致剂量依赖性抑制CCl LDH泄漏造成的<年代ub>4年代ub>在初级鼠肝细胞(<一个href="#B32">32一个>]。这种保护作用是明显的在这个研究中,分数比人参含有更多的甘草减少细胞毒性效应和膜渗透的人参。甘草可能防止人参细胞毒性增加,从而导致观察到的对抗和肝细胞的生存。
人参的组合使用修复分数isobolographic甘草萃取分析被认为是对抗而不是协同以及个人提取相比,减少了细胞毒性。此外,甘草萃取人参提取物发现降低膜渗透性能。这还需要进一步的研究来确定精确的细胞触发,如果这些观察到的效应细胞特定的。
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3.5。细胞循环分析
3.6。LDH分析
4所示。讨论
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