文摘
海洋微生物的丰富来源天然产品在制药行业发挥着重要作用。在过去的十年中,genome-based对海洋微生物的研究揭开了巨大的多样性自然产品的生产者,也导致了效率的利用应变多样性和化学多样性,以及遗传多样性的海洋微生物的快速发现和一代新的天然产物。同时,基因信息检索从海洋共生微生物也可以用于发现新的医疗分子从yet-unculturable微生物。本文对海洋微生物的基因组研究的最新进展综述;新工具的基因组挖掘以及推进孤儿通路的激活和宏基因组研究进行了总结。Genome-based海洋微生物的研究将最大化biodiscovery供应过程和解决问题和可持续性的药物分子医学治疗。
1。介绍
海洋环境覆盖了地球表面的70%以上,已经被证明是一个对生物和化学多样性丰富。海洋天然产品已经成为迷人的目标对于生物学家和化学家发现铅化合物的临床开发了过去五年(1- - - - - -10]。海洋微生物组成的一个重要组天然产品生产商,和海洋微生物天然产物分离提出了多样化的活动,如抗菌、抗真菌、抗癌,抗病毒活动。有用的天然产品的主要生产者,海洋放线菌尤其显著的不同生产能力的有用的天然产物(5- - - - - -7),和海洋蓝细菌也是一种重要的生物活性代谢物组(5]。目前在临床开发13 marine-derived化合物报道,和那些属于真实的或衍生品的海洋微生物来源的天然产物和表中列出1,结构显示在图1。这些化合物,soblidotin (TZT 1027),合成的导数dolastatin 10,从海洋藻青菌分离Symploca从帕劳sp。VP642, plinabulin的合成(npi - 2358)的灵感来源于halimide phenylahistin,前者从海洋真菌分离曲霉属真菌sp。数控- 139。其他有趣的化合物的结构与小说结构或有效的活动可以从最近的文献检索和审查文件(8- - - - - -17]。
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虽然天然产品接受广泛的实体,如生物材料和生物催化剂以及生物防治剂除了药物分子,由于空间限制,本文的大部分引用天然产品专注于化合物的潜在开发药物和用于医学治疗。建立微生物培养技术的优势,希望从海洋微生物天然产物鉴定提供巨大的潜力来解决供应和可持续性问题有用的药物来治疗人类的疾病。
大规模筛选(高温超导)的药物分子要求丰富多样性的化合物库,为药物发现得到更多的点击。对抗耐药病原体的出现,以及提高治疗的有效性和安全性,迫切需要新的药物先导物。改善自然的成功的关键产品筛选和开发是提高多样性和天然产物库大小的新药物的发现。摘要基因组研究的最新进展综述了天然化合物的发现,遗传多样性的关注重要角色推导出从基因组挖掘新的药物发现。
2。天然产品——生产微生物的基因组测序
基因组测序的微生物近年来推出了前所未有的对微生物细胞的生物合成的潜力,因此天然产物的发现已经进入到新的基因组时代。各种生物的基因组测序数据已经在最近几年迅速积累。根据基因组联机数据库(黄金),有5831个基因组测序项目注册金,虽然根据最后更新(2011年4月11日),目前黄金(10298个基因组项目记录http://www.genomesonline.org),其中1674完整基因组注册。同时,204热点,6087个细菌,和2003个eukaryal基因组项目正在进行,2009年报道的两倍(18]。相同的情况是基因组计划数量在2009年与2007年(19]。基因组测序项目支持的戈登和贝蒂·摩尔基金会以及导致释放约150海洋细菌基因组(20.]。草案或完整的基因组序列蓝藻超过35海洋的六种不同的物种被释放,和一些确定酮化合物和nonribosomal肽生物合成基因簇(21]。可以预期更多的海洋微生物基因组序列将在不久的将来,和更多相关的微生物天然产物生物合成基因将被披露。例如,海洋的基因组Nocardiopsissp.应变TFS65-07 marine-derived真菌菌株曲霉属真菌sp。据报道MF297-2被测序,研究thiopeptide抗生素生物合成的tp - 1161和prenylated吲哚生物碱、stephacidin notoamide代谢物,随后根据基因的生物信息学分析集群位于这些基因组(22,23]。尽管研究陆地物种和品种比较,marine-derived微生物基因组研究仍远,从陆地微生物积累的知识也可以使用marine-derived菌株。放线菌是各种有用的抗生素和抗肿瘤药物的主要生产商。在下面的小节中,我给一些例子在调查一些模型或natural-product-producing菌株的基因组,从而阐明marine-derived同行。
链霉菌属最大的放线菌属,物种是否是抗生素的主要生产商具有广泛的实用程序在医疗和农业应用中。第一个模型链霉菌基因组测序,链霉菌属coelicolorA3 (2据报道2002年[],24],基因组包含大约31生物合成基因簇被预测为次生代谢产物的生物合成,生物活性天然产物的主要来源。令人惊讶的是,这些次生代谢产物中只有六个美国coelicolor到那个时候已经确定,这意味着微生物细胞可以产生更大的化学多样性比先前的预期。后来,基因组序列的美国avermitilis也被报道(25),其次是盛开的揭示基因组序列的各种抗生素生产商(26- - - - - -31日]。
第一个seawater-requiring海洋放线菌的基因组序列,Salinispora tropica,据报道(26]。生物信息学分析显示,这种海洋细菌物种拥有大部分的基因(大约9.9%)负责天然产物生物合成,而相应的数字美国coelicolor和美国avermitilis分别为4.5%和6%,(32]。的基因组美国tropica包含令人惊讶的是大尺寸的基因(516 Kb)致力于酮化合物合酶(PKS)和/或nonribosomal肽合成酶(nrp)生物合成,这是负责许多megasynthases活性天然产物的生物合成和组合生物合成(尤其流行的工具33- - - - - -35]。大多数的基因位点的小说,表明美国tropica有很大潜力产生新颖的天然产物的生物合成可能这个物种,像许多其他放线菌基因测序,远远大于被培养观察和化学分析26),这些小说的开采提供依据新天然产物的基因来源。
3所示。基因研究的重要作用最大化多样性为天然产物的发现
虽然从海洋微生物天然产物已经扩大的光谱化学多样性,增加天然化合物的多样性仍然是高温超导的先决条件获得足够的药物发现的新支安打。同时,经典的基于活动的检测越来越受到重复发现已知的化合物,以及可用的分析方法的局限性。因此,需要新技术来最大化多样性的天然产物的发现新的治疗药物,不仅提高疗效和降低毒性,而且还应对耐药性的出现。
基因组测序技术的发展以及生物信息学工具近年来对新药的发现有着深刻的影响。现在很容易感兴趣的生物的基因组测序,尤其是微生物的基因组相对较小。基因组序列的可用性和随后的基因组挖掘微生物提供了新的见解的生物合成的潜在的细胞,因此海洋天然产物的研究已进入到新的基因组时代。有增加的趋势,扩大研究天然产物的化学多样性从bioassay-based筛选遗传多样性研究,从自然多样性的研究重组多样性的创造和运用(例如,使用遗传工具来产生新的“非自然”天然产物),与此同时,广泛接受的是化学多样性和遗传多样性不仅存在于不同微生物物种,但也存在于不同的菌株在一个物种36]。因此,天然产物化学多样性有用可以最大化的整合基因组研究和基因工程与化学家们的努力。海洋天然产物的重要生物多样性策略来最大化见图2,将在以下部分中详细描述。
4所示。“Gene-to-Compound”程序Genome-Based筛选天然产物
已经观察到的遗传元素负责生物合成很多,如果不是全部,次生代谢物都聚集在细菌或真菌的基因组形成基因簇,其中包括生物合成的酶的基因编码,以及基因负责监管和电阻(37]。这种遗传特性不仅极大地促进了生物合成基因的分子克隆和表征,但也提供了依据通过组合生物合成新化合物的生成。传统上,识别和分离天然产物生物合成基因簇,对化合物的化学结构之前必须获得的遗传研究。然而,这种“compound-to-gene”路线正面临挑战,(1)媒体和培养条件对化学物质的搜索有很大影响;因此,很多需要努力测试不同的媒体和种植参数;(2)bioassay-based筛查结果重新发现的已知化合物的筛选天然产物;(3)复杂结构的说明;(4)天然产物的分离受到低产量和复杂的净化过程。
近年来,越来越多的研究都集中在天然产物研究“从genetics-to-chemistry”路线,也就是说,使用基于基因筛选策略研究生物合成的潜在的微生物菌株,紧随其后的是分子克隆实验和化学方法进行了净化(38,39]。一个很好的例子就是活跃的卤代化合物的识别研究从550年随机选择放线菌基于来自不同halogenase基因的保守序列。使用这种“genome-based”战略,小说halogenase基因识别和小说halometabolites分离相关基因簇的克隆不同的主机(38]。我们使用相同的策略筛选海洋放线菌菌株图书馆在我们的实验室和孤立的一个基因簇推定地参与糖肽抗生素的生物合成。此外,一个新的marine-derived的基因组序列链霉菌属sp。S187获得和生物信息学分析指导基因簇的识别负责新糖肽抗生素(未发表的数据)。基因组扫描是另一个成功的方法,随机的基因组序列标签(消费税)准备从基因组DNA库使用简并引物筛选识别基因簇,随后和基因簇的产品可以使用各种genomics-guided搜索策略(40,41),下一节将详细介绍。使用这种“gene-to-compound”策略,就可以快速筛选的菌株库集中在一小群株高可能性产生新的化合物。然而,这一战略的成功取决于多方面的因素,包括选择目标基因genome-based筛选合适的简并引物的设计,模板DNA的质量(特别是环境DNA, PCR条件,和序列退化,因此是有限的检测化学多样性和多元化的结构。
5。微生物的基因组挖掘天然产品生产商
虽然基因组测序的成本下降,它仍然不是负担得起的每一个自然产物研究实验室。可能出现两个问题涉及整个基因组测序。为什么我们需要知道所有的序列在基因组?接下来我们能做什么在获得基因组序列?
回答第一个问题,广泛接受,可以大致分组基因组中基因位点的基因参与初级代谢和次级代谢基因。因为不是所有基因表达的条件,培养汤的化学分析在一定条件下不能完全探索细胞的生物合成的潜力。此外,并不是所有的基因都可以使用简并PCR捕捞由基于基因的筛选;因此,基因组测序可以完全访问负责天然产物生物合成的基因位点。同时,参与初级代谢基因位点也紧紧地与天然产物的生物合成提供前体和代数余子式42];因此,天然产物的生产需要代谢网络的平衡互动的初级代谢和次级代谢。了解基因组序列的前提是理解和驾驭自然的多样性产品生产商。基因组序列的可用性也使自然产品生产者利用系统生物学的研究方法,以代谢物的研究(43)和转录组研究(44在美国coelicolor。
第二个问题的答案依赖于基因组挖掘工具的快速发展,提出了在几位优秀评论其他地方45- - - - - -51]。几个基因组策略挖掘小说自然产品识别与添加最近的报告总结如下:
(1)Genome-Guided结构预测和目标产品的隔离。
如上所示,多酮类化合物的生物和nonribosomal肽合成与其模块化或nrp系统,和广泛的知识积累之间的关系这些化合物的结构和多酶的组织。成功挖掘核糖体合成肽也被报道和总结51]。生物信息学分析这些群体的基因从而可以给重要的洞察生物合成产品的结构特点。在海洋放线菌salinilactam genome-guided发现的美国tropica应变cnb - 440是一个很好的例子27]。初始bioinformatises分析表明slm基因簇编码多烯macrolactam酮化合物,调查使用特点的发酵肉汤紫外线生色团的多烯单位导致salinilactam一系列化合物的结构片段的识别。检查结构片段建议salinilactam源自PKS至少10扩展模块。这些信息是有用的帮助解决,妥善组装相关的重复DNA序列slm繁荣正义党,结合使用部分NMR-based结构片段精确预测的总化学结构salinilactam a。更重要的是,生物信息学分析也协助修正初始分配的C-28甲基复杂重叠烯核磁共振信号。salinilactam结构后来验证了综合纯化天然产物的NMR分析确认bioinformatics-based总结构赋值。
在最近的另一个报告,salinosporamide K是由比较基因组分析发现“美国克莱斯勒太平洋“与美国tropica(52]。截断的生物合成基因簇被确认草案基因组的“美国克莱斯勒太平洋”,这是41 kb相关基因簇美国tropicasalinosporamide生物合成,但chloroethylmalonyl-CoA通路中的基因编码的酶没有在“帕西菲卡。“信息引导salinosporamide K的隔离,在结构上类似于salinosporamide (26]。
上述salinilactam和salinosporamide K结构呈现在图3。
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(2)比较代谢分析与添加或失活突变体的生物合成的基因。
生物合成基因簇相关的未知代谢物的生产通常被称为“孤儿”(46]。孤儿基因簇的生物合成的基因可以被删除或破坏,灭活和代谢分析的比较使用高效液相色谱或质突变体与野生型菌株将识别基因簇的乘积。coelichelin的发现美国coelicolor这种方法的早期例子是使用[53]。或者,可以不同的生物合成基因簇表达良好的“干净”的主机没有背景相似的代谢产物的生产,和比较代谢分析将有助于识别新颖的产品。5新2-alkyl-4-hydroxymethylfuran-3-carboxylic酸称为Mm呋喃(mmf),这是新的autoinducers规范抗生素生产、被发现的不同的表达方法(54]。在最近的一份报告中,一个包含ATP-grasp酶基因簇被基因组挖掘海洋伽马proteobacteriumPseudoalteromonas被囊类D2中过表达大肠杆菌的隔离,导致两个新的代谢物,3-formyl-L-tyrosine-L-threonine二肽和3-formyl-L-tyrosine55]。这项工作强调小的研究途径(比较战,nrp)使用不太熟悉的生物合成的策略新颖的天然产物的发现。一毫米的结构呋喃(MMF1) 3-formyl-L-tyrosine-L-threonine二肽,和3-formyl-L-tyrosine如图4。
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(3)生物合成基因的激活基因操纵的监管。
生产某些天然产物的失败可以归因于穷人表达式或沉默的生物合成基因簇。因此,调控基因的超表达,pathway-specific监管基因或全球监管基因,可能导致新化合物的生产。一个例子是aspyridones的发现曲霉属真菌nidulans。过度的假定的pathway-specific调节基因位于沉默基因簇导致小说的识别混合PKS-NRPS产品aspyridone [56]。另外,pathway-specific监管基因的启动子可以取而代之的是强大的组成型启动子,以便调节基因的表达受到镇压的管制。
另一方面,一些监管基因也可以对某些化合物的生产造成的抑制作用;在这种情况下,这种监管的缺失容易导致基因沉默途径的激活和生产新型化合物。在最近的一份报告中,一个新的yellow-pigmented次生代谢物被观察到美国coelicolor在删除一个假定的pathway-specific调节基因(scbR2),编码gamma-butyrolactone受体蛋白质(57]。这种策略可以用于小说从海洋微生物天然产物的发现,在这方面虽然没有已知的文献报道。
其他基因组挖掘策略包括genomisotopic研究和体外重组的生物合成的酶被描述在评论其他地方(58,59]。它可以预测海洋微生物基因组矿业将推出天然产物由微生物产生的极大的多样性。更重要的是,它应该提到,据估计,只有1%的微生物群落是在实验室条件下可栽培的[60- - - - - -62年),指出生物多样性研究领域的重要性还“unculturable”微生物,这将在下一节中加以解决。
6。海洋微生物宏基因组的研究“Unculturable”
海洋共生微生物丰富的活性天然产物来源,在某些情况下被认为是强有力的候选药物的真正生产者而不是海洋无脊椎动物包括海绵、被囊类、苔藓虫(63年]。猎枪海水环境基因组的测序样品收集从百慕大附近的马尾藻海还显示巨大的多样性一般认为托比nutrient-limited环境(64年],它公布了148种未知细菌phylotypes和120万年前所未知的基因。然而,大部分的海洋共生体和99%的微生物种群环境很难生长或缓慢增长为纯培养。完全访问有价值的化学多样性和探索所有的微生物群落的生物合成的潜力,环境DNA提取(埃德娜)直接从一个给定的环境中,和挤进向量,通过变换各种主机后,包括大肠杆菌和链霉菌属lividans。克隆库产生独立于主机培养或发酵,然后受序列筛选或基于函数的筛选。这种cultivation-independent方法称为宏基因组。在过去的十年中,许多成功的宏基因组研究已经被报道。Onnamides和theopederins多酮类化合物抗肿瘤生物由一个无教养的假单胞菌sp.共生有机体海洋海绵Theonella swinhoei。生物合成基因onnamides和theopederins孤立的metagenome海洋海绵、和生物合成基因的生物信息学分析表明原核来源,表明这些强有力的抗肿瘤药物可能产生的共生菌(65年]。整个公认的基因簇负责苔藓虫素的生物合成,已评估各种白血病的治疗,卵巢癌、前列腺癌、被牵连产生的共生细菌,Candidatus Endobugula sertula从海军苔藓虫(66年]。在另一项研究中,生物合成基因簇的强有力的抗肿瘤剂psymberin是孤立的宏基因组的海洋海绵Psammocinia等于off。Bulbosa(67年]。结合研究开发不同的表达式(68年),可以产生大量活性化合物overexpressing生物合成基因簇从宏基因组库分离在不同的主机,这将解决供应和可持续性问题的宝贵的化合物产生的海洋共生体,然而“unculturable”海洋微生物。
有些化合物研究了宏基因组分析的结构呈现在图5。
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7所示。更新工具探索多样性的自然化合物
探索海洋天然产物的多样性大大提升了各种genome-based策略本文描述和新化学结构新颖生物活性公布的这些方法获得补充传统的研究。然而,随着由Glockner表示和联合69年),genome-based方法的成功在很大程度上是依赖于生物信息学分析的准确性,和生物信息学工具通常是限制因素。研究人员正在开发各种生物信息学工具如ClustScan [70年),NP。搜索器(71年],SBSPKS [72年),仅举几例,分析党或nrp模块化的序列和结构的预测。
另一方面手新工具的检测天然产品不断开发探索微生物天然产物的化学多样性。成像质谱(IMS)工具被用来可视化海洋蓝藻产生的次生代谢产物的空间分布(73年dereplication],提供信息和发现新奇的天然产品。棱镜(次生代谢的蛋白质组学研究)方法使用mass-spectrometry-based蛋白质组学与其定位表达或nrp集群,这导致了新发现的nrp基因簇芽孢杆菌应变NK2018 [74年]。单细胞基因组学的方法被用来研究海洋共生菌的生活方式,Poribacteria(75年),这种策略也承诺在学习unculturable微生物的生物合成的潜力在不久的将来。所有这些更新的生物信息学工具和检测工具可以促进新的海洋天然产品。
探索海洋微生物的多样性利用经典的基于活动的筛选与基因组挖掘相结合可栽培的和unculturable微生物呈现在图6。
8。结论和前景
近年来成倍增加的基因组测序信息,和基因组挖掘分析揭示了海洋微生物产生的巨大功能活性天然产物作为治疗药物。研究天然产物生物合成的生物合成机制和监管机制将极大地最大化多样性探索海洋天然产品。如今的多样性研究天然产物已经从纯化学分析转向遗传操作和化学合成的结合,和天然产物的多样性可以通过基因工程生物合成基因的进一步扩大。海洋微生物的基因组的研究将有很大的影响医疗治疗和新颖的天然产物的发现将有助于有效的药物发现的海洋环境。
确认
这项工作为开放基金项目资助的生物反应器工程国家重点实验室,华东科技大学海洋halogenase作者。作者还感谢亚历山大•冯•洪堡基金会的支持研究抗生素生物合成的调控在德国。三个匿名评论者的评论和建议是真诚的赞赏,在海洋方面丰富了手稿。