文摘
糖尿病肾病是一个长期的并发症有糖尿病。许多实验证据表明,持续的高血糖症产生细胞内活性氧(ROS)和移植将增长factor-b1和细胞外基质表达在系膜和肾小管上皮细胞,这是自由基参与糖尿病的发病机制,更重要的是在糖尿病并发症的发展。抗氧化剂能有效抑制high-glucose H2O2-induced转变增长upregulation factor-b1、纤粘连蛋白,从而提供证据表明,ROS glucose-induced肾损伤起着重要的作用。黄酮类的木樨草素已被证明具有直接的抗氧化活性,因此我们推测它可能是有用的在治疗与氧化应激相关的许多慢性疾病,如糖尿病肾病通过其抗氧化性能。我们的研究结果表明,防止由毛地黄黄酮治疗糖尿病肾病的发展涉及超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化,丙二醛(MDA)含量和表达的血红素Oxygenase-1 (HO-1)的蛋白质。
1。介绍
草药是自然产生的,植物的物质以最小或没有工业加工,用于治疗疾病在当地或地区治疗实践。很长一段时间,草药或其提取物已被用于治疗各种疾病(1- - - - - -3),因为工厂产品经常被认为是更少的有毒和更多的自由从副作用比合成的4]。毛地黄黄酮、植物的类黄酮,具有多种生物活性,包括著名的抗炎(5),抗诱变剂的,和抗癌6]属性。此外,它具有直接抗氧化活性(7),这可能是有用的治疗与氧化应激相关的许多慢性疾病,如心血管疾病(8,9),肝脏疾病(10,11)、糖尿病(12),和老化13]。葡萄糖摄取和利用外围组织,如肝脏、肌肉和脂肪,维持正常的血糖水平是至关重要的。
许多实验证据表明,自由基参与糖尿病的发病机制14)在糖尿病并发症的发展,更重要的是(12,15,16]。自由基能够破坏细胞分子,DNA、蛋白质和脂质导致细胞功能改变。许多最近的研究表明,抗氧化剂能够中和自由基是有效预防实验诱导糖尿病动物模型(17,18)以及减少糖尿病并发症的严重程度(16]。
糖尿病肾病是糖尿病最严重的并发症之一,终末期肾功能衰竭的最常见原因。目前,糖尿病肾病影响-25%的I型糖尿病患者(约15%19),30% - -40%的II型糖尿病患者(20.]。糖尿病肾病的特点是具体肾形态和功能改变。ROS发挥重要作用在高glucose-induced肾损伤(21,22]。类黄酮是丰富的植物酚类化合物。超过6000人已确定到目前为止,和一些已被证明具有降糖、抗糖尿病的活动(23]。没有报告相关木樨草素在糖尿病肾病的保护作用。因此,本研究旨在确定木樨草素对糖尿病肾病的保护作用在STZ-induced DM。
2。方法
按照指南的所有实验的实验动物保健和使用中国国家卫生研究院。四十岁男性Sprague-Dawley老鼠,重180 - 220克,是采购的授权公司在南京,中国。他们被安置在一个标准的动物设施环境条件控制在室温22±2°C和12小时光暗周期和接收标准颗粒的饮食和水随意。在实验周期的开始,老鼠分配随机分为4组:对照组标准食物饮食,对照组给予木樨草素饮食,糖尿病组给出一个标准的食物的饮食,和糖尿病组木樨草素的饮食。1型糖尿病是诱导如前所述24]。简单地说,糖尿病是由一个单一的腹腔内注射链脲霉素诱导(STZ, 70毫克/公斤)溶解在0.1柠檬酸缓冲(pH值4.5)在雄性Sprague-Dawley老鼠。对照组大鼠服用枸橼酸缓冲容量是一样的。糖尿病是证实注射STZ后48 h葡萄糖浓度的测量外周血经尾静脉(美国加州一碰SureStep计,LifeScan)。所有的动物都有免费的食物和水。被诊断为糖尿病的葡萄糖浓度持续> 15更易/ L。糖尿病被确认后,木樨草素喂养开始剂量为200毫克/公斤溶解在蒸馏水使用胃内的管。老鼠与戊巴比妥钠麻醉和牺牲八周后证实高血糖水平。收集血液样本和肾脏生化分析。24小时尿液收集血液样本的前一天和整除。
2.1。生化分析
血液样本的测量血液化学被卷入prechilled EDTA-containing管和立即放在冰。血液样本在2300 g离心分离血清和存储在−70°C到化验。血清用于葡萄糖的估计,24小时尿素蛋白、血尿素氮(BUN),和肌酐如前所述24,25]。的水平血清三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)测量如前所述[26]。脂质在肝脏TC和TG等也通过上述方法估计。
3所示。抗氧化测定
肾脏匀浆(10%,w / v)准备0.1 PBS和离心10分钟的12000克。上层清液是用来确定超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平与商用试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
3.1。毛地黄黄酮在组织学
跟踪结束时,所有的老鼠都与高剂量的戊巴比妥安乐死。肾脏被立即删除,在中性4%福尔马林固定2小时。三极震区片肾组织获得和嵌入在石蜡。部分在4毫米减少切片机和清蜡和二甲苯。他们沾Hematoxylin-Eosin(圆))染色。光显微镜下观察染色肾脏部分的放大400倍。
3.2。毛地黄黄酮对血红素Oxygenase-1和磷酸化Akt
肾脏样品(0.2 g)是细胞溶解和均质2毫升的裂解缓冲(10毫米Tris-buffered盐水,1毫米EDTA, EGTA 1毫米,2毫米钠原钒酸盐,0.2毫米PMSF, 2μg / mL亮抑酶肽,2μg / mL抑肽酶,1% Triton x - 100) 30分钟在冰和通过离心13000克15分钟在4°C。上层清液中总蛋白浓度测定用布拉德福德化验(美国加州Bio-Rad实验室、大力神)。对于每一个车道,等量的蛋白质与十二烷基硫酸钠(SDS)的混合样品缓冲和煮5分钟。样本分离10%钠十二烷基sulfatepolyacrylamide凝胶,然后转移到0.2 -μ硝化纤维素膜。硝基的屁股都被孵化TBST(10毫米Tris-HCl, pH值7.5,150毫米氯化钠,和0.1%渐变20)含5%脱脂牛奶在室温下1 h,然后孵化与兔多克隆anti-Heme oxygenase-1 (HO-1),一种蛋白激酶/ PKB phospho-AKT / PKB,β肌动蛋白抗体(1:500稀释)一夜之间在4°C。3清洗步骤之后,第二个antirabbit抗体(1:10000稀释)添加和孵化1小时。冲洗后清洗缓冲了三遍,民建联的反应是可视化。
3.2.1之上。统计分析
所有值表示为均值±s.e.m。统计评估使用单向方差分析(方差分析)其次是邓肯的多个测试范围(DMRT)通过使用SPSS 11.09对windows。显著性水平是设定在。
4所示。结果
在这项研究中,STZ-treated糖尿病大鼠发展不受控制的1型糖尿病。老鼠收到链脲霉素成为糖尿病的频率为80%。所有的老鼠都成熟的迹象STZ糖尿病2周后的管理,也就是说,高血糖症,糖尿,多尿症,用水量增加,和减肥。糖尿病与减少体重与对照组大鼠相比。改变初始和最终体重(BW)正常的实验组和对照组如表所示1。正如所料,标志着糖尿病大鼠观察BW损失。然而,毛地黄黄酮治疗似乎从大规模BW保护糖尿病大鼠损失。Luteolin-treated老鼠显示复苏最终BW是接近正常大鼠的控制。
4.1。生物化学的发现
血糖水平是非常高的DM组和DM毛地黄黄酮组在注射STZ后48 h。8周后,毛地黄黄酮治疗显示出明显的糖尿病大鼠的血糖水平(表2)。包子、血清肌酐和24小时尿素蛋白测定,结果如表所示3。包子的水平,24小时尿素蛋白质,和肌酐显著增加STZ-induced糖尿病大鼠与正常大鼠相比控制处理和未经处理的毛地黄黄酮。政府木樨草素在200毫克/公斤糖尿病老鼠往往带值接近正常。血尿素氮的水平,24小时尿素蛋白、肌酐明显减少。
以下4.4.1。血清和组织脂质
的影响与毛地黄黄酮治疗糖尿病大鼠血清脂质如TC, TG,血清高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)展示在表4。如表所示4水平的血清TC、TG、LDL显著增加在糖尿病大鼠与正常控制的老鼠相比,而血清高密度脂蛋白的水平相比明显降低糖尿病大鼠的正常控制老鼠。血清脂质和TC、TG和LDL降低,高密度脂蛋白显著提高糖尿病大鼠治疗相比木樨草素与糖尿病大鼠。
此外,有显著增加的TC和TG相比在STZ-induced糖尿病大鼠肾脏的正常控制老鼠。另一方面,TC和TG水平在糖尿病大鼠肾脏明显减少毛地黄黄酮治疗糖尿病的老鼠相比(表5)。
4.2。毛地黄黄酮抗氧化的影响
如图1,SOD活性明显降低,MDA水平显著增加STZ-induced糖尿病大鼠肾脏的相比,那些在正常大鼠的控制。毛地黄黄酮显著增强肾脏匀浆SOD活性,减少MDA水平。
(一)
(b)
4.3。组织病理学发现
糖尿病肾病的特点是肾小球系膜的扩张,这是引起系膜细胞增殖和过度积累ECM (27]。作为显示在图2在正常大鼠,外皮层肾小球的正常大小和配置。此外,肾小球膜细胞包含通常的补充和矩阵没有ECM积聚。糖尿病大鼠肾脏的肾小球中截然不同的外观。
(一)
(b)
(c)
(d)
免疫印迹
我们的数据显示显著增加表达HO-1蛋白在糖尿病大鼠肾脏的价格相比正常。毛地黄黄酮治疗糖尿病老鼠HO-1蛋白表达增加(图3)。我们也记录的一种蛋白激酶的磷酸化丝氨酸- 473 / PKB相比,糖尿病大鼠肾脏的正常大鼠肾脏。毛地黄黄酮治疗增加一种蛋白激酶/ PKB磷酸化在糖尿病大鼠肾脏的价格相比未经治疗的糖尿病大鼠肾脏(图3)。
(一)
(b)
5。讨论
在研究中,我们提供的证据表明,预防糖尿病肾病的发展由毛地黄黄酮治疗涉及HO-1的表达和p-Akt的变化。我们的结果表明,毛地黄黄酮治疗预防糖尿病肾病的发展,显著降低了面包和糖尿病动物的肌酐。Luteolin-fed老鼠少肾损伤。这可能是解释说,有间隙的增加血尿素和肌酐通过肾脏或减少蛋白质降解。此外,毛地黄黄酮还阻止了24小时增加尿素蛋白在糖尿病大鼠。
多元醇通路活动增加引起的高血糖症已经被报道为异常增加渗透和氧化应激等因素被认为是糖尿病微血管疾病,包括糖尿病肾病的倡导者(28]。高血浆MDA水平和降低SOD活性在糖尿病(29日]。抗氧化剂(如维生素C和E)预防糖尿病肾病的发展(30.]。各种生物行为的木樨草素介导通过抑制氧化应激(7)和炎症(5]。此外,毛地黄黄酮被调制调解的影响报道几个重要的分子靶点,包括转录因子(核factor-kB和激活蛋白1)[31日),酶(诱导一氧化氮合酶抑制剂)32)和细胞因子(肿瘤坏死因子a, interleukin-1、白细胞介素- 6和趋化因子)(33]。在目前的研究中,发现木樨草素减少MDA水平,增加肾脏匀浆SOD活性。
高浓度的血清脂质异常主要是由于增加的游离脂肪酸动员周围脂肪堆积,因为胰岛素能抑制激素敏感脂肪酶生产。因此,高水平的血清脂质在DM导致糖尿病肾病的风险34,35]。完善,DM改变组织如肾脏的正常代谢。政府木樨草素对大鼠糖尿病往往带值接近正常。木樨草素是已知有抗氧化性能7),这可能会降低敏感性脂质氧化和稳定细胞膜脂质,从而减少氧化应激。然而,管理木樨草素对糖尿病大鼠往往带值接近正常。因此,毛地黄黄酮治疗hypocholesterolaemic展出,hypotriglyceridaemic hypophospholipidaemic效果,同时增加高密度脂蛋白。
增加血浆肌酐水平和包子的迹象在糖尿病大鼠糖尿病肾病的发展36,37]。包子和肌酐水平较高与糖尿病肾病大鼠比正常大鼠(38]。维护这些生化变量接近控制老鼠的毛地黄黄酮治疗表明,木樨草素发挥作用,直接或间接地提供保护糖尿病肾病发展或延迟。
血红素oxygenase-1 (HO-1),何鸿燊的诱导同种型系统,是一个血红素转换成克分子数相等的病原反应酶量的铁、一氧化碳和胆绿素。HO-1被认为有抗氧化和cytoprotective角色39]。何反应的产物、胆绿素和一氧化碳可以在非常高浓度有毒。然而,最近的证据表明,他们不是在生理浓度有毒正常细胞,他们可能也有重要的抗氧化剂,抗炎、抗凋亡的属性(40,41]。AKT蛋白是一种丝氨酸/苏氨酸激酶和PI3-K的下游效应。它起着至关重要的作用在各种各样的细胞事件如细胞凋亡、细胞周期进展,和转录调控42]。最近的研究表明,激活AKT占心脏功能的调制43],HO-1可能引起炎症和/或氧化应激,然后生成p-AKT转录因子激活,增加HO-1蛋白质水平(44,45]。糖尿病与氧化应激密切相关;因此,蛋白质HO-1无菌幕的水平。我们的结果表明,毛地黄黄酮增加HO-1蛋白质的水平。这些结果表明,毛地黄黄酮renoprotective效应的机理之一可能与增加HO-1表达和提高抗氧化剂在糖尿病肾病。
总之,本研究的结果表明,毛地黄黄酮可能防止肾脏形态破坏由于糖尿病。还需要进一步的研究来确定的确切机制renoprotective木樨草素的影响。
6。结论
从上面的结果,它可能会得出结论,毛地黄黄酮可能防止肾脏的形态破坏与糖尿病有关,可能改善肾脏的氧化还原平衡。因此,长期控制使用毛地黄黄酮的抗氧化水平的饮食可以预防糖尿病和预防肾病的进展。