文摘

宏基因组是由深海沉积物样本筛选分解脂肪的活动。六个开放式框架阳性克隆显示只有33 - 58%氨基酸身份已知的蛋白质。其中一个是分配给一个新组,而人分为家庭我和V或EstD家庭。采用的组合等方法去除信号序列,coexpression伴侣蛋白的基因,和低温诱导,我们获得五可溶性重组蛋白大肠杆菌。纯化酶的最适温度30到35个和cold-activity属性。其中,一个优先显示脂肪酶活性的酶水解p-nitrophenyl棕榈酸酯,p-nitrophenyl硬脂酸和高耐盐性高达4 M氯化钠。我们的研究表明小说发展的可行性从海洋环境分解脂肪的酶功能宏基因组方法的组合和蛋白质表达技术。

1。介绍

分解脂肪的酶,如酯酶和脂酶属于类羧酸酯水解酶催化水解和合成的酯键。分解脂肪的酶已被分为八个家庭基于保守序列图案和生物学性质1]。他们共享一个特征水解酶折叠的三维结构,但在衬底上有所不同的偏好。酯酶(EC 3.1.1.1)水解水溶性或乳化与短链羧酸酯(≤10个碳原子),而脂酶(EC 3.1.1.3)喜欢长链acylglycerides(≥10个碳原子)2]。酯酶和脂酶有广泛的生物技术应用,例如有机化学加工,洗涤剂配方,合成生物表面活性剂,oleochemical行业,乳品工业、农用化学品行业,造纸、营养、化妆品和医药加工(3- - - - - -6]。因此,新颖的酯酶和脂酶的识别将是一个有用的策略寻找新颖的生物催化剂。

宏基因组方法,直接克隆基因的微生物出现在一个给定的栖息地,可以访问nonculturable微生物的潜力7- - - - - -10]。在细节,宏基因组库是由各种环境样品的DNA克隆载体包括粘粒、fosmid和细菌人工染色体(BAC) [11- - - - - -13)和宿主菌株。两个主要的策略一直追求确定新型生物催化剂或基因生物技术的应用程序的新功能。第一种方法使用基于函数的放映的宏基因组DNA库,和第二个包括序列搜索(14- - - - - -16]。通过宏基因组库的功能屏幕,多个基因编码分解脂肪的酶已经从各种环境样品(之前确认17- - - - - -21]。

我们已经应用宏基因组方法寻找新的分解脂肪的酶等海洋环境样品的深海沉积物和北极海岸,具有原始的和潜在的资源(22- - - - - -24]。一些新颖的酯酶和脂酶已确定与独特的属性包括寒冷的活动。在这项研究中,我们使用了另一种深海沉积物岩芯样本在我们之前的研究和探索可以推出新颖的分解脂肪的酶的存在。在这里,我们描述小说的识别分解脂肪的enzyme-encoding从宏基因组的基因,增强可溶性蛋白表达,纯化酶的生化特性。

2。材料和方法

2.1。大肠杆菌菌株、图书馆建设和筛查

DH5α(美国Stratagene拉霍亚,CA), EPI300-T1R (WI震中,麦迪逊,美国),和BL21 (DE3)(美国WI Novagen,麦迪逊)被用作克隆和表达宿主菌株。pBluescript SK - (Stratagene), pET-24a(+)向量(Novagen)和fosmid向量(中心)作为向量。

2.2。宏基因组库建设和筛查分解脂肪的克隆

深海沉积物样本收集来自南部蛤床周围爱迪生海底山的顶峰在巴布亚新几内亚附近的新爱尔兰弧前(89′S / 152°49°′E;深度1440米)。沉积物样品的DNA提取基于先前所描述的方法(25与一些细微的修改。提取后,DNA凝胶电泳进一步纯化的low-melting-temperature 1%琼脂糖凝胶(FMC Bioproducts,大我)含1%聚乙烯醇polypyrrolidone(σ,圣路易斯,密苏里州)。凝胶电泳是在35 V 13 h,大约40到50 kb和DNA片段被孤立于凝胶。孤立的DNA与结束它end-repaired DNA End-Repair工具包(震中,麦迪逊,WI),导致DNA冲结束,5′磷酸化。blunt-ended DNA的结扎成pCC1FOS向量(震中,麦迪逊,WI)。λ包装提取物添加到结扎,感染噬菌体T1-resistant EPI300-T1^R细胞进行根据制造商的指示。的大肠杆菌转化株被转移到96 -微量滴定板和储存在−80°C。酯酶、脂肪酶活性筛选,转化株镀在Luria-Bertani(磅)琼脂板包含12.5μg / mL的氯霉素和1%三丁酸甘油酯作为衬底。殖民地孵化了一天在37°C和随后孵化一周在4°C。候选人明确光环包围在盘子里。阳性克隆后,subcloned。

Fosmid克隆显示分解脂肪的活动在三丁酸甘油酯琼脂板被接种到200毫升的包含12.5磅肉汤μ氯霉素的g / mL。隔夜孵化后37°C,细胞被离心收获5000 g×15分钟,用蒸馏水洗两次。fosmid DNA纯化采用碱裂解法(26)和少量修改被雾化随机剪切根据制造商的指令(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。雾化后,2到4 kb的DNA片段分离low-melting-temperature 0.6%琼脂糖(FMC Bioproducts,大我)凝胶和end-repaired钝结束。blunt-ended DNA被结扎了生态房车的pBluescript SK (−) (Stratagene拉霍亚,CA),和结扎引入大肠杆菌DH5α细胞。的大肠杆菌转化株被镀到包含100磅琼脂板μg / mL的氨苄青霉素和1%三丁酸甘油酯。在37°C孵化后24 h,殖民地包围一个明确的光环被选中。核苷酸序列进行自动测序仪(ABI3100)使用BigDye终结者工具包(PE应用生物系统公司,福斯特城,CA)。DNA序列是由底漆走在两个方向和组装使用矢量的ContigExpress程序NTI套件7软件包(InforMax,北马里兰州贝塞斯达)。开放阅读框(ORF)检测使用ORF搜索工具提供的国家生物技术信息中心(NCBI)。与基本的局部比对序列同源性搜索进行搜索工具(爆炸)项目(27]。信号序列搜索SignalP 3.0执行程序(28]。蛋白质序列之间的多重比对进行与ClustalW程序(29日]。构建了系统发育树neighbor-joining方法(30.4.1)使用分子进化遗传学分析软件(兆,版本4.1)[31日]。

2.3。超表达和纯化的分解脂肪的Enzyme-Encoding基因

分解脂肪的酶基因放大通过PCR引物对,和放大DNA片段插入到pET-24a(+)表达载体(表1)。三个重组质粒包括EM3L1基因,EM3L2, EM3L3变成了大肠杆菌BL21 (DE3)细胞而三个重组质粒包括EM3L4基因,EM3L6, EM3L7变成了大肠杆菌BL21 (DE3)表达分子伴侣GroEL-GroES pGro7(豆类,京都,日本)和转化株接种到含有20磅中等μ氯霉素和50 g / mLμ卡那霉素的g / mL质粒选择和0.5毫克/毫升L-arabinose伴侣表达的诱导。转化株种植在37°C,异丙基- 1毫米β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)添加到诱导基因表达时,光密度在600 nm达到0.4。孵化后16 h在16°C,细胞被离心收获(6000×g 20分钟4°C)和resuspended 50 mM Tris-HCl缓冲区(pH值8.0)包含0.1氯化钾和10%的甘油。细胞被破坏的声波降解法和离心机(20000×g, 1 h, 4°C)。得到的上层清液应用于列的爪metal-affinity树脂(BD生物科学Clontech,帕洛阿尔托,CA)和洗10毫米咪唑(σ,圣路易斯,密苏里州)在50 mM Tris-HCl缓冲区(pH值8.0)包含0.1氯化钾和10%的甘油,和酶筛选了300毫米的咪唑缓冲区。布拉德福德的蛋白浓度测定方法使用Bio-Rad蛋白质分析工具包(Bio-Rad大力神,CA)与牛血清白蛋白作为标准(32]。蛋白质的纯度检测钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)在变性条件下所描述的方法(33]。

2.4。分解脂肪的酶的特性

酯酶和脂肪酶的活动被分光光度法测量使用p-nitrophenyl丁酸和p-nitrophenyl棕榈酸酯(σ,圣路易斯,密苏里州)为底物,分别。反应混合物中含有p-nitrophenyl丁酸乙腈,Tris-HCl缓冲区,和酶解。p-nitrophenyl棕榈酸酯的解决方案是混合着Tris-HCl缓冲区包含Triton x - 100作为乳化剂。孵化后,在每一个最适温度为5分钟,在405纳米测量吸光度检测释放p硝基酚。一个单位的酯酶和脂肪酶的活动被定义为所需的酶释放1μ摩尔的p硝基酚从p-nitrophenyl丁酸盐或p每分钟-nitrophenyl棕榈酸酯。

酶最适温度的测定在不同温度下的5到65°C。最佳酸度决心在4.0到10.0范围,使用以下缓冲系统:50毫米醋酸钠(pH值4.0到6.0),50 mM磷酸钠(pH值6.0到7.5),50 mM Tris-HCl (pH值7.5到8.5),混身起红疹;痒和50毫米(pH值8.5到10.0)。底物专一性决定了不同的脂肪族侧链,C2(醋酸),C4(丁酸)、C6己酸酯类()、C8(辛酸酯),C10(癸酸盐)、C12(月桂酸盐)、吸收(十四酸盐),C16(棕榈酸酯)和C18(硬脂酸)为基质。

各种金属离子(MnCl₂,MgCl₂,CaCl₂,CuCl₂,ZnSO₄,FeSO₄,CoSO₄,你₄)和酶抑制剂,Phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF)和乙二胺四乙酸(EDTA),在最后一个1毫米被添加到酶浓度在50 mM Tris-HCl缓冲区(pH值7.5)然后化验酶活性预培养后1小时35°C。洗涤剂对酶活性的影响取决于孵化酶在50 mM Tris-HCl缓冲区(pH值7.5)含有1% (w / v)的洗涤剂SDS,特里同x - 100, Tween-20, -40年,-60年,-80年为1小时35°C。

氯化钠浓度对酶活性的影响来衡量p己酸酯类-nitrophenyl衬底。反应混合物中含有酶解决方案在50 mM Tris-HCl (pH值7.5)包含不同氯化钠浓度从0.5到4米。混合物在35°C preincubated 30分钟,然后添加的酶活性检测p己酸酯类-nitrophenyl。

2.5。加入核苷酸序列号码

获得的核苷酸序列已经存入基因库数据库下加入数字EM3L1 (GQ340923) EM3L2 (GQ340924) EM3L3 (GQ340925) EM3L4 (GQ340926) EM3L6 (GQ340927)和EM3L7 (GQ340928)。

3所示。结果

3.1。筛查和分解脂肪的主要序列分析Enzyme-Encoding基因

探索尚未开发的酯酶和脂酶在海洋环境中,宏基因组方法应用于深海沉积物样本,附近的一个小火山锥名叫爱迪生在深度1440米海底山,有广泛的蛤蜊床与低温通风口(34]。深海样本被选中代表好寒性的环境平均温度低于4°C。组成的宏基因组81100 fosmid克隆构建fosmid向量,pCC1FOS。每个克隆包含插入约15 - 33 kb。Fosmid克隆有分解脂肪的活动确定了活动筛选含1%琼脂板三丁酸甘油酯(TBN)。因此,6阳性克隆(指定为pFosEM3L1、pFosEM3L2 pFosEM3L3, pFosEM3L4, pFosEM3L6,和pFosEM3L7)通过区间隙的殖民地。

6 fosmid克隆受到进一步subcloning pBluescript SK(−)质粒。积累与分解脂肪的活动选择在TBN盘子了。2 - 3 kb的DNA插入的序列分析积累透露orf编码假定的存在α/β水解酶与含量46.5 - -66.6%。爆炸搜索六子的氨基酸序列表示,他们取得了不到60%的身份数据库中的蛋白质。EM3L1的推导氨基酸序列、EM3L2 EM3L3, EM3L4, EM3L6, EM3L7显示最高的相似水解酶折叠蛋白质(YP_003395264)Conexibacter woesei身份DSM 14684(39%),假设蛋白(ZP_01915829)Limnobactersp。MED105身份(49%)、三酰甘油酰基水解酶(AAK07450)Moritella滨(49%的身份),LpqC (ZP_01463024)Stigmatella树蛙DW4/3-1身份(39%),水解酶折叠蛋白质(ZP_01697334)芽孢杆菌coagulans36 d1(身份)33%,细菌脂肪酶(ACJ13070)从无教养的身份(58%),分别为。

看到羊痘疮是已知的酯酶和脂酶,分析了系统发育关系基于酯酶/脂肪酶分类(由Arpigny家庭I-VIII)和Jaeger [1包括最近报道的家庭如LipG [35),(36],LipEH166 [20.],FLS18 [18],EstD2 [17)(图1)。EM3L1 EM3L3, EM3L6分为家庭V图1,保留G-X-S-M-G五胜肽的主题和HG oxyanion洞(数字序列2(一)和2(b))。他渣组成的催化三分子不能在EM3L1预测和EM3L6序列比对(图2(a))。EM3L2与EstD2聚集在一起从植物根际土壤宏基因组最近报道17]。多重比对分析EM3L2显示活跃的网站包含了丝氨酸守恒的五肽G-H-S-Q-G EstD2家庭(图2(c))。

另一方面,发现EM3L4没有显示显著的相似性在八个家庭和扩展任何成员一起一组与同源基因。值得注意的是推导氨基酸序列的比较分析显示,EM3L4显示低相似性聚(3-hydroxyalkanoate)解聚酶(ZP_07602911)链霉菌属violaceusniger身份(34%),两个活性部位G-X-S-N-G环绕的两种蛋白质的丝氨酸(图五肽共同之处2(d))。序列分析,似乎EM3L4酶(图可能是小说1)。最后,EM3L7与家人聚在一起我细菌分解脂肪的酶和活性部位丝氨酸A-X-S-X-G图案(图包含的特征2(e))。主题通常被发现芽孢杆菌脂酶属于亚I.4即使没有明显的同源性(少于14%的身份)被发现。综上所述,宏基因组研究应用于深海的海洋沉积物样品有可能产生新的分子实体与已知序列无关。

3.2。的表达和描述分解脂肪的Enzyme-Encoding基因

表达六个基因,EM3L1、EM3L2 EM3L3, EM3L4, EM3L6, EM3L7,我们调查的存在信号序列使用SignalP 3.0程序,发现EM3L2 EM3L3, EM3L4保留一个假定的信号序列氨基酸长年龄在18岁至25岁之间。删除了信号序列的基因都放大,和由此产生的表达结构表达大肠杆菌BL21压力。总细胞溶解产物,可溶性分数,和不溶性分数12% sds - page分析,我们发现部分由三个基因编码的蛋白质(EM3L1、EM3L2 EM3L3)检测可溶性部分(图3(一个)),而由三个基因编码的蛋白质(EM3L4、EM3L6 EM3L7)被表示为不溶性形式。

基于低温表达增加了稳定和适当的折叠的蛋白质,可能由于疏水相互作用,确定包涵体的形成是温度依赖(37- - - - - -39),我们做了三种蛋白质(EM3L4、EM3L6 EM3L7)在低温诱导16°C。然而,低温诱导表达孤独并不是成功的增强表达蛋白质的溶解度(数据没有显示)。因为它据报道,GroEL-GroES有效地促进他们的正确折叠通过最小化聚合和错误折叠40),我们使用GroEL-GroES co-expression增溶的蛋白质。事实证明EM3L4 EM3L6蛋白质和可溶性表达的coexpressing GroEL-GroES 16°C。与其他蛋白质,大多数表示EM3L7仍在不溶性分数不管我们在本研究的实验条件(图3 (b))。蛋白质表达纯化节中描述2,和sds - page分析纯化EM3L1 EM3L2 EM3L3, EM3L4, EM3L6显示蛋白质乐队的相关预测分子量(图3 (c))。这个结果表明,结合co-expression陪伴和低温诱导可能有效实现的可溶性表达脂解的enzyme-encoding基因。

纯化酶显示一个最佳温度范围内的活动进行30到35°C和神经或微碱性pH (pH值7.5 - -8.5)(表2看看数据S1和S2 Supplementry材料上可用线http://dx.doi.org/10.1155/2011/271419)。值得注意的是他们可以分为cold-active酶基于温度资料和活化能值。基因的来源是深海沉积物样品,我们预测,低温酶。类似的现象在其他研究报告;例如,两个低温酯酶从北极沉积物metagenome表现出最适温度在30°C (23从温泉metagenome显示)和耐热性的酯酶酶活性高于30°C到95°C (41]。这个结果表明,分解脂肪的酶来自宏基因组的财产可能会反映在他们的环境特征。

EM3L1、EM3L2 EM3L3, EM3L6可以水解短链基板(C₂C₁₂向)和显示最高的活动p己酸酯类-Nitrophenyl (C₆)(表2和图S3)。另一方面,EM3L4显示对长链酶活性基质(C₁₆- c₁₈),它可以归类为脂肪酶。酶测定的特定活动的范围在1.7 - -558.2 U /毫克(表的最佳条件2)。

自EM3L4属于一个新组和同源蛋白质从来没有特点,EM3L4进一步的生化性质分析。确定耐各种化学药剂,与化学药剂提纯EM3L4是孵化,其余活动测量p-nitrophenyl棕榈酸酯或p己酸酯类-nitrophenyl衬底在35°C。EM3L4的活动增加了锰的存在^{2 +}、镁^{2 +}、钙^{2 +}、铜^{2 +},倪^{2 +}(表3)。它是由锌抑制的^{2 +}、铁^{2 +}、有限公司^{2 +}和完全抑制PMSF(表3)。除此之外,它也抑制了各种非离子去污剂Tween-20等,-40年,-60年,-80年和特里同x - 100和离子洗涤剂,SDS(表3)。EM3L4的酶活性明显受盐度的影响。如图4,EM3L4显示最高的酶活性存在1 M氯化钠。此外,活动是维持4 M氯化钠(图4)。

4所示。讨论

我们的方法搜索小说分解脂肪的酶开始建设的宏基因组从深海沉积物。六脂解的结果,我们可以发现enzyme-encoding基因序列相似性较低的身份(33 - 58%)已知的蛋白质。通过消除信号序列的n端和co-expression伴侣蛋白基因在较低的温度下,我们可以获得可溶性重组由5个基因编码的蛋白质大肠杆菌。他们透露的生化特性的御寒,反映的环境特征metagenome的起源。

特别是EM3L4扩展到一个新的组在系统发育树中,和任何的同源蛋白质EM3L4从来没有的特点。纯化EM3L4首选水解时间脂肪酸,和高度活跃在氯化钠浓度高。最近,一些酯酶的活动增加氯化钠的存在已确定使用深海等各种海洋环境宏基因组库水(42,海水36),和海洋沉积物(18]。我们建议EM3L4是一种新型脂肪酶保留抗盐性属性。然后,问题是否同源蛋白质属于同一组与EM3L4显示类似的属性,它需要进一步调查。

最终,这项研究表明,小说分解脂肪的酶主要序列而言,活动,和底物特异性可以通过宏基因组方法使用深海沉积物样品。他们可能会作为生物催化剂在制药和精细化工产业。

确认

这项工作得到了KORDI内部程序(PE98513)和海洋和极端的基因组研究中心项目并使用Hyperthermophilic古生菌生物生产技术的发展项目的土地、交通、海事、韩国。

补充材料